Resume Jurnal Principles of Nucleic Acid Separation

Principles of Nucleic Acid Separation
by Agarose Gel Electrophoresis
Muhittin Yılmaz*, Cem Ozic and İlhami Gok
University of Kafkas, Department of Biology, Faculty of Sciences, Kars,
Turkey
1.
Latar Belakang
Elektroforesis gel agarosa merupakan metode yang banyak digunakan untuk
pemisahan protein, DNA dan RNA. Molekul asam nukleat, dipisahkan sesuai dengan
ukurannya dengan menggunakan medan listrik, dimana molekul yang bermuatan
negatif akan bermigrasi ke arah anoda (kutub positif). Urutan migrasi ini ditentukan
oleh berat molekul, yang mana molekul dengan berat molekul kecil akan bermigrasi
lebih cepat daripada molekul dengan berat molekul besar. Fraksinasi asam nukleat
dengan elektroforesis gel agarosa biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti UV transilluminator.
Elektroforesis asam nukleat dapat dideteksi dengan pewarnaan dan
divisualisasikan dengan sinar UV dibawah 300 nm.Pewarnaan dan visualisasi DNA
yang baik dilakukan dengan menggunakan etidium bromida ataupun Green SYBR
Aplikasi lain dari elektroforesis asam nukleat selain untuk fragmentasi asam
nukleat berdasarkan ukurannya, yakni juga berguna untuk diagnosis genetika
molekuler atau sidik jari genetik melalui analisis produk PCR. Pemisahan genom DNA
dengan menggunakan metode Southern blot dan Northern blot juga menggunakan
elektroforesis gel agarosa.
Langkah lain yang digunakan dalam pemisahan molekul asam nukleat lainnya
adalah pewarnaan. Asam nukleat yang telah dipisahkan melalui proses
elektroforesis, kemudian diwarnai untuk selanjutnya hasilnya dilihat di atas sinar UV.
Pewarnaan ini biasanya menggunakan larutan penyangga muatan perwarna loading
buffer (dye). Dye ini biasanya berupa etidium bromida (EtBr). Tetapi, EtBr ini
memiliki kelemahan, yakni tidak dapat dilihat hasilnya pada cahaya natural. Oleh
karena itu, alternatif lain dari larutan dye ini selain menggunakan EtBr adalah
menggunakan SYBR Green. Meskipun harga SYBR Green lebih mahal dari EtBr, tetapi
SYBR Green bersifat 25x lebih sensitif dibandingkan dengan EtBr. Sementara, SYRB
Safe yang merupakan turunan dari SYBR memiliki tingkat sensitifitas yang sama
dengan EtBr, akan tetapi SYBR Safe lebih rendah tingkat mutageniknya dan tingkan
toxic nya dibandingkan dengan EtBr, sehingga harga SYBR Safe pun lebih mahal dari
EtBr.
2.
Metode
Metode
yang digunakan
dalam
elektroforesis
gel
agarosa adalah
menyediakan media yang tepat untuk analisa ukuran fragmen setelah itu lakukan
pemurnian fragmen DNA. Sebelum melakukan proses elektroforesis, fragmen DNA
dicampurkan dengan larutan penyangga muatan perwarna loading buffer (dye).
Setelah itu dilakukan proses elektroforesis dengan menggunakan gel agarosa.
Setelah proses elektroforesis, dilakukan proses pewarnaan terhadap molekul asam
nukleat yang menggunakan pewarna Ethidium bromide atau SYBR Green , yang
kemudian hasilnya dilihat di atas sinar UV.
Alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah:
1. Asam nukleat dan oligonukleat
2. Larutan penyngga elektroforesis ; TAE, TPE, TBE
3. Larutan penyangga DNA ; EtBr dan SYBR Green
4. Larutan Agarosa
3.
Prinsip Kerja
3.1.
Mempersiapkan molekul asam nukleat.
Pertama, kita harus memisahkan populasi campuran fragmen asam nukleat
dengan menggunakan larutan buffer, yakni Tris-Asetat / EDTA (TAE) atau Tris-
Borat / EDTA (TBE). Untuk membuat gel, bubuk agarosa dicampurkan dengan
larutan buffer, kemudian dipanaskan di dalam microwave hingga terlarut setelah
itu EtBr dicampurkan.
3.2.
Proses Elektroforesis
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Kemudian, asam nukleat akan bererak menuju kutub yang
bersilangan dengan muatannya. Karena asam nukleat bermuatan negatif, maka
asam nukleat akan bergerak ke kutub positif. Pada saat yang sama, EtBr akan
bergerak juga ke arah yang sama, sehingga bergabung dengan asam nukleat.
Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan dari asam nukleat adalah:
a. Konsentrasi agarosa
b. Voltase
c. Larutan buffer elektroforesis
d. Efek dari EtBr
3.3.
Pewarnaan
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan agar molekul
sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Pewarnaan ini menggunakan EtBr atau
SYBR Green. Kemudian molekul sampel yang telah diwarnai akan diletakkan di
bawah sinar UV, dan kemudian akan difoto.
4.
Cara Kerja
1. Siapkan larutan agarosa dalam larutan buffer elektroforesis pada konsentrasi
yang tepat.
2. Panaskan campuran ke dalam microwave hingga larut.
3. Dinginkan campuran, kemudian tambahkan etidium bromida dengan konsentrasi
akhir 0,5 mg / ml.
4. Pilihlah sisir yang tepat untuk membentuk sampel slot di gel. Posisikan sisir 0,51,0 mm di atas piring.
5. Tuangkan larutan agarosa ke dalam cetakan.
6. Didiamkan selama 20-45 menit pada suhu kamar.
7. Tuangkan larutan penyangga elektroforesis di atas gel.
8. Sisir diangkat secara hati-hati.
9. Tempatkan gel ke dalam perangkat elektroforesis dengan buffer elektroforesis
hingga kedalaman sekitar 1 mm.
10. Campur sampel dengan dye dengan rasio 1:05 atau 1:10.
11. Secara hati-hati, letakkan campuran sampel ke dalam slot dari gel yang terendam
menggunakan mikropipet.
12. Tutup tutup tangki gel dan aliri listrik dengan tegangan 1-5 V / cm.
13. Ketika sampel DNA atau pewarna telah bermigrasi pada jarak tertentu, matikan
arus listrik dan tutup tangki gel.
5.
Manfaat
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan molekul asam nukleat
dengan pembawanya, juga untuk memperkirakan ukuran fraksinasi asam nukleat,
juga berfungsi dalam diagnosis genetika molekular atau sidik jari genetik serta untuk
analisa berat dari asam nukleat yang telah dipisahkan.