View/Open - Repository | UNHAS

DETEKSI PENYEBAB PENYAKIT MOSAIK LABU KUNING (Cucurbita
moschata) YANG BERASOSIASI DENGAN POTYVIRUS DI SULAWESI
SELATAN
Muhammad Danial Rahim1), Andi Nasruddin1), Rinaldi Sjahril2, Rifni Nikmat1,3),
Amanda Pattapari4) dan Yani Dawy5)
1) Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Hasanuddin
Makassar 90245
2) Jurusan Agronomi, Fak. Pertanian, Univ.Hasanuddin, Makassar 90245
3) Program Studi Magister Ilmu Hama dan Penyakit Tumbuhan, Program Pascasarjana,
Universitas Hasanuddin, Makassar 90245
4) Fakultas Pertanian, Universitas Muhammadiyah Makassar
5) Balai Besar Uji Standar Karantina, Badan Karantina Pertanian, Jakarta
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan potyvirus sebagai penyebab
penyakit mosaik pada tanaman labu kuning. Sampel tanaman labu kuning yang
menampakkan gejala mosaik dengan beberapa variasi gejala lainnya dikumpulkan dari
beberapa lokasi pertanaman labu kuning. Sampel tanaman sakit dideteksi secara
serologi dengan DAS-ELISA menggunakan antiserum potyvirus, kajian biologi yakni
pengujian pada tanaman inang indikator serta teknik RT-PCR menggunakan pasangan
primer oligonukleotida degenerate potyvirus. Sebanyak 8 dari 24 sampel yang
dikumpulkan dari beberapa lokasi pertanaman labu kuning di Sulawesi Selatan
menunjukkan positif terinfeksi virus yang tergolong ke dalam genus potyvirus.
KATA KUNCI : Cucurbita moschata, labu kuning, serologi, RT-PCR, potyvirus
PENDAHULUAN
Virus merupakan salah satu patogen penting penyebab penyakit pada beberapa
jenis famili cucurbitaceae, seperti semangka, melon, mentimun, dan labu. Lebih dari 32
jenis virus yang dapat menginfeksi family cucurbitaceae tersebut dan menyebabkan
terjadinya gejala yang sangat keras dan beragam mulai dari gejala mosaik kuning,
bercak klorotik, vein banding dan dengan terjadinya perubahan bentuk daun pada
daun-daun muda (Provvidenti, 1996; Zitter et al., 1996). Di antara virus-virus tersebut,
Squash mosaic virus (SqMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Papaya ringspot
virus (PRSV) dan Watermelon mosaic virus (WMV) yang tergolong ke dalam genus
Potyvirus merupakan jenis virus yang sering ditemukan di pertanaman jenis labu-labuan
(cucurbita) dengan penyebarannya yang sangat luas (Davis dan Mazumi, 1987; Brunt et
al., 1990; Massumi et al., 2007).
Kemunculan, penyebaran, intensitas infeksi serta
kerusakan tanaman akibat virus-virus tersebut bergantung pada hubungan antara virus,
inang, serangga penular serta faktor lingkungan.
Pengamatan di beberapa pertanaman labu kuning di Sulawesi Selatan
menunjukkan adanya gejala belang hijau (mosaik), belang hijau kekuning-kuning,
vein banding dan perubahan bentuk daun tanaman labu (Gambar 1). Gejala penyakit ini
dapat terjadi karena adanya asosiasi lebih dari satu jenis virus, misalnya asosiasi antara
cucumovirus dan potyvirus. Dilaporkan oleh Wakman dan Kontong (1996), bahwa
tanaman labu kuning yang menampakkan gejala mosaik berasal dari Kabupaten Maros,
Sulawesi Selatan yang ditularkan secara mekanik dan melalui serangga penular aphid
pada beberapa jenis labu-labuan memperlihatkan kemunculan gejala mosaik dan diduga
mirip dengan infeksi ZYMV dan WMV-2 yang merupakan jenis virus dari genus
potyvirus. Hingga saat ini laporan mengenai potyvirus sebagai penyebab penyakit
mosaik pada labu kuning atau cucurbita lainnya di Sulawesi Selatan masih terbatas.
Penyakit mosaik pada labu kuning merupakan penyakit yang berpotensi
menimbulkan masalah besar pada tanaman labu atau cucurbita lainnya sehingga
diperlukan upaya pengembangan metode pengendalian yang efektif.
Pengendalian
akan efektif apabila diketahui penyebabnya secara akurat. Penelitian ini bertujuan untuk
mendeteksi penyebab penyakit mosaik pada tanaman labu kuning menggunakan metode
serologi dan melalui kajian biologi yaitu dengan pengujian kisaran inang serta teknik
RT-PCR menggunakan pasangan primer degenerate potyvirus.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebanyak 10 dari 28 sampel tanaman yang
dikumpulkan sebagai bahan pengujian menunjukkan positif terinfeksi virus yang
termasuk dalam genus potyvirus.
BAHAN DAN METODE
Pengambilan sampel tanaman bergejala di lapangan
Pengambilan sampel tanaman labu kuning yang menunjukkan gejala khas infeksi
potyvirus dilakukan pada beberapa lokasi di Sulawesi Selatan, yakni Gowa (Gw1-Gw9),
Takalar (Tk1-Tk3), Bantaeng (Bt1-B6), Maros (Ms1-Ms3) dan Makassar (Mks1-Mks3).
Sampel tanaman bergejala mosaik dan variasi gejala lainnya dikumpulkan (Gambar 1)
untuk selanjutnya dideteksi secara serologi dan teknik RT-PCR di laboratorium.
Sebagian dari sampel tanaman bergejala digunakan sebagai sumber inokulum untuk
pengujian kisaran inang.
Deteksi potyvirus pada labu kuning
Serologi
Potyvirus dideteksi secara serologi dengan teknik direct double antibody
sandwich-enzyme linked immunoabsorbent assay (DAS-ELISA) sesuai prosedur yang
dikemukakan oleh pembuat antiserum. Antiserum yang digunakan adalah antiserum
potyvirus universal (Agdia Inc.). Analisis secara kuantitatif hasil ELISA ditentukan
menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Pengujian dinyatakan
positif jika nilai absorban 1,5x nilai kontrol negatif (tanaman sehat).
Deteksi dengan teknik RT-PCR
Ekstraksi RNA total dilakukan pada masing-masing sampel tanaman yang
menunjukkan hasil positif terinfeksi virus pada pengujian serologi. RNA total diperoleh
dari 0,1 g daun bergejala yang digerus dengan nitrogen cair dan diekstraksi
menggunakan kit isolasi RNA total (RNAeasy Plant Mini Kit) sesuai prosedur
pembuatnya (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA). Total RNA dielusi dengan air bebas
RNAse (ddH2O) sebanyak 50 μl.
RNA total yang diperoleh digunakan sebagai template untuk sintesis first
strand complementary DNA (cDNA) pada mesin PCR. Komposisi reagen reaksi RT
(reverse transcription) (RevertAid RT, Fermentas) dengan total volume 20 μl. Total
RNA yang diperoleh ditambahkan reagen RT sampai mencapai volume total 20 μl
kemudian diamplifikasi menggunakan mesin PCR Automated Thermal Cycler (T100
Bio-rad) yang diprogram untuk satu siklus pada 42oC selama 60 menit dan 72 oC selama
10 menit. cDNA dari hasil RT tersebut kemudian disimpan pada suhu -20 oC sampai
siap digunakan untuk pereaksi PCR.
Reagen PCR terdiri dari cDNA, PCR master mix (Maxima hot start taq DNA
polymerase, Life Science), sepasang primer
serta ddH2O (Tabel 3.2). Reaksi PCR
diamplifikasi dengan menggunakan sepasang primer degenerate untuk potyvirus yang
mengamplifikasi gen NIb pada posisi 7619 - 7641 dan 7945 – 7968, yakni NIb 2F
(5’-GTITGYGTIGAYGAYTTYAAYAA-3’) dan NIb 3R (5’-TCIACIAC IGTIGAI
GGYTGNCC-3’). Amplifikasi dilakukan menggunakan mesin PCR T1000 Thermal
Cycler (Bio-Rad) pada kondisi PCR 35 siklus dengan tahapan pemisahan utas DNA
pada 95ºC selama 45 detik, penempelan primer pada DNA template pada 45ºC selama
45 detik dan sintesis DNA pada 72ºC selama 45 detik, dan perpanjangan akhir pada
72ºC selama 5 menit (Zheng et al., 2010).
DNA virus hasil amplifikasi dielektroforesis menggunakan gel agarose 1,5%
(w/v) (dalam TBE 0,5 X) yang mengandung Ethidium bromide (0,5 mg/10 ml). Penanda
DNA yang digunakan adalah ladder 100 bp dan 1 Kb (Fermentas), sebanyak 8 μl yang
dicampurkan dengan 2 μl 5x loading buffer. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100
V DC selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi dibawah transilluminator
ultraviolet dan didokumentasi dengan kamera digital.
Pengujian kisaran inang
Bibit tanaman uji berasal dari biji sehat,ditanam dalam polibag yang berisi tanah
steril yang mengandung humus (perbandingan 2:1). Tanaman yang diuji terdiri atas 7
jenis tanaman, yakni Chenopodium amaranticolor, mentimun (Cucumis sativus), C.
moschata, semangka (Citrulus radiatus), Nicotiana tabacum, N. glutinosa dan N.
benthamiana,
Tanaman-tanaman
tersebut
setelah membentuk
daun
sempurna
diinokulasi dengan potyvirus isolat Sulawesi Selatan Masing-masing jenis tanaman uji
terdiri atas sepuluh tanaman yang sekaligus sebagai ulangan. Pengamatan dilakukan
setiap hari selama satu bulan yang meliputi gejala dan variasi gejala yang timbul
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan di lapang ditemukan bahwa tanaman labu kuning yang
terindikasi oleh adanya infeksi potyvirus pada umumnya menunjukkan gejala berupa
helaian daun tampak belang hijau, helai daun bewarna kuning cerah atau hijau muda
yang berseling dengan warna kuning cerah yang berkembang menjadi warna kuning
sangat jelas, vein banding, adanya pelepuhan pada helaian daun dan terjadinya distorsi
pada helai daun (Gambar 1). Adanya variasi gejala yang terdapat pada masing-masing
tanaman labu kuning tersebut diduga faktor tanaman seperti umur tanaman, genotip
tanaman, tingkat populasi serangga penularnya, dan faktor lingkungan, misalnya tingkat
kesuburan tanah dan iklim sekitar tanaman (Mattew, 1992). Selain itu, gejala yang
beragam dapat dipengaruhi oleh keberadaan jenis virus yang berbeda dalam kelompok
potyvirus. Menurut Davis dan Mizuki (1987), tiga jenis virus yakni PRSV, WMV and
ZYMV yang tergolong ke dalam genus potyvirus dapat memunculkan ekspresi gejala yang
berbeda pada tanaman labu-labuan pada waktu yang bersamaan dan pada waktu yang
berbeda dapat menyebabkan terjadinya tumpang tindih gejala. Selanjutnya (Davis et al.,
2003) mengemukakan bahwa perbedaan isolat virus dapat mengakibatkan perbedaan gejala.
Terinfeksinya beberapa inang indikator yang diinfeksi dengan beberapa isolate
virus penyebab mosaic dari pertanaman labu kuning mengindikasikan bahwa virus tersebut
memiliki kisaran inang yang sangat luas. Gejala yang dinampakkan pada tanaman indicator
umumnya memperlihatkan mosaik hingga malformasi kecuali pada tanaman chenopodium
amaranticolor.
Sejumlah delapan isolat virus mosaik yang diuji serologi menunjukkan bahwa
virus yang menginfeksi tanaman labu kuning berasosiasi dengan potyvirus. Kelompok
Potyvirus merupakan salah satu genus yang memiliki kisaran inang yang luas. Beberapa
jenis virus tersebut diantaranya, ZYMV, WMV-2 dan PRSV. Hasil tersebut sejalan dengan
pengujian dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer spesifik pada gen NIb
menunjukkan bahwa hasil amplifikasi menunjukkan fragment pada pita DNA 350 bp.
KESIMPULAN
Penyakit mosaik pada tanaman labu di Sulawesi Selatan umumnya terinfeksi
oleh virus yang tergolong ke dalam kelompok Potyvirus berdasarkan uji serologi,
kisaran inang dan metode RT-PCR. .
DAFTAR PUSTAKA
Brunt, A. K. Crabtree and A. Gibbs, 1990. Viruses of tropical. CAB International
Davis, R. F., and Muzuki, M. K. 1987. Detection of cucurbit viruses in New Jersey.
Plant Dis. 71:40-44.
Massumi, H., A. Samei, A.H. Pour, M. Shaabanian and H. Rahimian, 2007. Occurrence,
distrivution and relative incidence of sevent virus infecting greenhouse-grown
cucurbits in Iran. Plant Dis 91 * 159-163.
Provvidenti, R. 1996. Diseases caused by virus Page 37-45 in: Compendium of Cucurbit
Diseases.
Wasmo Wakman dan A. Said Kontong, 1996. Uji penularan penyakit mosaic pada
tanaman labu (Cucurbita sp.) secara kenamik melalui biji dan inang lainnya.
Prosiding seminar PEI/PFI Komda Sulawesi Selatan.
Zheng, L., Rodoni, B.C., Gibbs, M.J. and Gibbs, A.J. 2010. A novel pair of universal
primers for the detection of Potyviruses. Plant Pathol 59, 211–220.
Zitter , T. A. , Hopkins , D. L. ,Thomas, C. E. 1996. Compendium of Cucurbit Diseases,
APS Press.T. A. Zitter, ed. American Phytopathological Society, St. Paul, MN.