bahan dan metode

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Survei penyakit mosaik dan koleksi sampel tanaman nilam sakit dilakukan
di Kebun Percobaan Balai Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) di daerah
Gunung Bunder dan Cicurug, Bogor, Jawa Barat. Deteksi virus dilakukan di
Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Maret sampai November
2011.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel Tanaman Nilam Bergejala Mosaik di Lapangan
Sampel tanaman nilam yang bergejala mosaik diperoleh dari Kebun
Percobaan Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) di daerah
Gunung Bunder dan Cicurug, Bogor, Jawa Barat. Sampel daun yang diambil dari
lapangan dideteksi di laboratorium.
Deteksi Potyvirus melalui I-ELISA
Teknik deteksi diawali dengan menggerus sampel tanaman nilam
sebanyak 0,1 g dalam buffer coating pH 9,6 dengan perbandingan 1:5 (b/v).
Sebanyak 100 µl sampel tanaman kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing
sumuran plat mikrotiter ELISA dan diinkubasi semalam pada suhu 4 °C. Cairan
sampel tanaman dalam plat mikrotiter dibuang kemudian plat di cuci dengan
phosphate buffer saline tween-20 (PBST) sebanyak dua kali kemudian masingmasing sumuran diisi dengan 100 µl skim milk 2%. Plat diinkubasi selama
30 menit pada suhu 37 °C. Setelah itu buang dan keringkan plat mikrotiter
kemudian masing-masing sumuran diisi dengan antiserum Potyvirus sebanyak
100 µl dan diinkubasikan selama 2-4 jam pada suhu 37 °C. Antiserum tersebut
telah diencerkan terlebih dahulu menggunakan buffer conjugate dengan
perbandingan 1:1000. Plat mikrotiter kemudian dicuci dengan PBST sebanyak
tiga kali dan kemudian diisi dengan 100 µl konjugat yang dilarutkan dalam
conjugate buffer dengan perbandingan 1:1000. Plat mikrotiter kemudian
diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 °C. Setelah inkubasi selama 2 jam plat
11
mikrotiter dicuci menggunakan PBST sebanyak tiga kali. Masing-masing
sumuran kemudian diisi dengan 100 µl PNP yang telah dilarutkan dalam substrate
buffer dan diinkubasi pada suhu ruang dan di tempat gelap. Plat mikrotiter
kemudian diuji secara kuantitatif menggunakan ELISA reader (Bio-RAD 550)
pada panjang gelombang 405 nm setiap 30 menit selama 60 menit. Dalam setiap
pengujian disertakan kontrol negatif yaitu tanaman sehat dan bufer. Pengujian
dikatakan positif jika nilai absorban sampel yang diuji 2 kali lebih besar daripada
kontrol negatif tanaman sehat.
Deteksi Fabavirus melalui DAS-ELISA
Teknik deteksi diawali dengan mengencerkan antiserum Fabavirus pada
coating buffer dengan perbandingan 1:500. Sebanyak 100 µl antiserum
dimasukkan kedalam masing-masing sumuran pada plat mikrotiter dan
diinkubasikan selama 2-4 jam pada suhu 37 °C. Plat mikrotiter kemudian dicuci
menggunakan PBST sebanyak 2 kali. Sampel tanaman sebanyak 0,1 g digerus
menggunakan extract buffer dengan perbandingan 1:5 (b/v) kemudian 100 µl
dimasukan ke dalam masing-masing sumuran dan diinkubasi pada suhu 4 °C
selama semalam. Plat mikrotiter kemudian dicuci menggunakan PBST sebanyak
3 kali. Pada masing-masing sumuran dimasukkan 100 µl konjugat yang telah
diencerkan pada conjugate buffer dengan perbandingan 1:500 dan diinkubasikan
selama 4 jam pada suhu 37 °C. Masing-masing sumuran dicuci kembali
menggunakan PBST sebanyak 3 kali dan kemudian ditambahkan 100 µl PNP
yang telah dilarutkan dalam substrate buffer dan diinkubasi pada suhu ruang dan
di tempat gelap. Plat mikrotiter kemudian diuji secara kuantitatif menggunakan
ELISA reader (Bio-RAD 550) pada panjang gelombang 405 nm setiap 30 menit
selama 60 menit. Dalam setiap pengujian disertakan kontrol negatif yaitu tanaman
sehat dan bufer. Pengujian dikatakan positif jika nilai absorban sampel yang diuji
2 kali lebih besar daripada kontrol negatif tanaman sehat.
Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus Melalui RT-PCR
Untuk dapat membedakan Potyvirus dan Fabavirus yang menginfeksi
tanaman nilam, dilakukan deteksi virus melalui metode RT-PCR dan
12
menggunakan primer khusus yang dapat digunakan dalam RT-PCR yang dapat
mengamplifikasi virus secara terpisah.
Ekstraksi RNA total. RNA total diekstraksi dari jaringan daun tanaman
nilam bergejala penyakit mosaik dengan menggunakan Bench-Top Protocols for
Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT Korea). Tanaman yang diekstraksi merupakan
tanaman yang telah diuji menggunakan ELISA dan positif Potyvirus dan
Fabavirus. Tahapannya adalah sebanyak 0,1 g sampel daun digerus dengan
menggunakan mortar dan pistil steril dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan
dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 450 µl bufer XPRB
yang mengandung 1% mercaptoethanol, kemudian dihomogenkan. Sampel
dipipet, lalu dimasukkan ke dalam filter coloumn putih dan ditempatkan pada
tabung koleksi 2 ml, lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit.
Supernatan dipipet tanpa menyentuh pelet dalam tabung koleksi, ukur volume
supernatan yang diperoleh lalu dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml baru.
Kemudian ditambahkan ethanol 96% (setengah dari volume supernatan) dan
dicampur dengan rata. Sampel dimasukkan ke dalam XPPLR
mini coloumn
merah, kemudian ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml lalu disentrifuse pada
kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi
dibuang, kemudian ditambahkan 500 µl wash buffer 1 ke dalam XPPLR mini
coloumn, lalu ditutup dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm
selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian
ditambahkan 700 µl wash buffer 2 ke dalam XPPLR mini coloumn, lalu ditutup
dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan
yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian untuk mengeringkan
XPPLR
mini coloumn disentrifuse selama 3 menit pada 12000 rpm. Untuk
meyakinkan bahwa coloumn telah kering, coloumn dipindahkan pada tabung
koleksi baru. Selanjutnya, 50 µl RNAse free water ditambahkan ke dalam pusat
membran XPPLR
mini coloumn, didiamkan 1 menit lalu disentrifuse pada
kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Siapan RNA total ini digunakan sebagai
template dalam reaksi RT-PCR.
Sintesis cDNA. RNA hasil ekstraksi selanjutnya ditranskripsi balik menjadi
cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan teknik Reverse Transcription
13
(RT). Reaksi RT dibuat dengan total volume 10 µl yang mengandung 2 µl RNA
total, 2 µl bufer RT 10X, 0,35 µl 50 mM DTT (dithiothreitol), 2 µl 10 mM dNTP
(deoksiribonukleotida triphosphat), 0,35 µl M-MuLV Rev, 0,35 µl RNase
inhibitor, 0,75 µl oligo (dT), dan 2,2 µl H2O. Komponen-komponen tersebut
digunakan untuk satu kali reaksi RT. Reaksi RT dilakukan dalam sebuah
Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied
Biosystem, USA) yang diprogram untuk satu siklus pada suhu 25 ºC selama
5 menit, 42 ºC selama 60 menit, dan 70 ºC selama 15 menit. cDNA hasil RT
digunakan sebagai DNA template dalam reaksi PCR.
Amplifikasi DNA dengan PCR. Amplifikasi DNA virus dilakukan
dengan metode PCR dengan menggunakan pasangan primer yang telah didesain
khusus untuk mengamplifikasi virus secara terpisah. Pasangan primer yang
spesifik
digunakan
untuk
mendeteksi
Potyvirus
yaitu
CPUP(F)
(5’-
TGAGGATCCTGGTGYATHGARAAYGG-3’, Y = C/T, H = A/T/C, R = A/G),
spesifik
untuk
coat
protein
pada
Potyvirus
dan
CP9502(R)
(5’-
GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’) spesifik untuk ujung 3’ genom
Potyvirus dengan prediksi ukuran produk 800 bp (Singh et al. 2009). Sedangkan
pasangan primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi Fabavirus yaitu
[BBWVVSSP (5’- GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’, B = C, G, atau T; D = A,
G, atau T; Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5’-TDGWDCCATCVAGICK
CATTTT-3’, W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T)] dengan
prediksi ukuran produk 322 bp mencakup wilayah dari C-terminal dari large coat
protein (LCP) ke N-terminal small coat protein (SCP) (Kondo et al. 2005).
Metode yang digunakan dalam penelitian ini untuk mengamplifikasi DNA
Potyvirus, Fabavirus, dan keduanya yaitu digunakan pasangan primer Potyvirus,
pasangan primer Fabavirus, dan pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang
dicampur untuk mengamplifikasi DNA Potyvirus, Fabavirus, dan campuran
kedua DNA tersebut. Reaksi PCR dengan total volume 25 µl, terdiri atas 1 µl
masing-masing primer, 12,5 µl Go Tag Green Master Mix 2x (Promega, Madison,
USA), 9,5 µl H2O, dan 1 µl DNA template. Amplifikasi ini dilakukan pada
Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied
Biosystem, USA). Untuk Potyvirus amplifikasi ini didahului dengan denaturasi
14
awal pada 94 ºC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan 45 siklus yang
terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing)
pada 54 ºC selama 2 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama 1 menit. Khusus
untuk siklus terakhir, ditambahkan 10 menit pada 72 ºC untuk tahapan sintesis,
dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Untuk Fabavirus amplifikasi ini didahului
dengan denaturasi awal pada 95 ºC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan
35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95 ºC selama 1 menit, penempelan
primer (annealing) pada 51 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC
selama 1 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 5 menit pada 72 ºC
untuk tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Untuk pengujian yang
dilakukan bersamaan menggunakan primer Potyvirus dan Fabavirus (Mix)
amplifikasi ini didahului dengan denaturasi awal pada 95 ºC selama 5 menit.
Kemudian dilanjutkan dengan 10 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95 ºC
selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 51 ºC selama 1 menit, dan
pemanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, kemudian dilanjutkan dengan 30 siklus
yang terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer
(annealing) pada 54 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama
2 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 10 menit pada 72 ºC untuk
tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Setelah dilakukan PCR,
maka hasil yang diperoleh dapat dielektroforesis.
Elektroforesis. Agarose sebanyak 0,3 gr dimasukkan ke dalam tabung
Erlenmeyer 100 ml, lalu ditambahkan 30 ml bufer Tris-Borate EDTA (TBE) 0,5x
(0,045 M Tris-Borate, 0,01 M EDTA), untuk pembuatan gel agarose. Kemudian
dipanaskan dalam microwave selama 2 menit atau sampai agarose larut. Larutan
agar didinginkan terlebih dahulu selama kurang lebih 15 menit, kemudian
ditambahkan 1,5 µl ethidium bromida kemudian diaduk. Cetakan gel telah
disiapkan terlebih dahulu dan ‘sisir’ gel diletakkan di bagian atas pencetak gel
kemudian larutan agarose dituang ke dalam cetakan. Gel didiamkan sampai
mengeras (30-45 menit). Setelah mengeras, gel diambil dan diletakkan ke dalam
bak elektroforesis yang berisi buffer TBE 0,5 kali. DNA hasil PCR dimasukkan
ke dalam sumur gel elektroforesis sebanyak 5 µl dan 100 bp DNA ladder
dimasukkan pada sumuran gel elektroforesis yang berada di posisi sebelah kiri
15
sebanyak 5 µl. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 100 volt selama
25 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transluminator ultraviolet.
Pita DNA yang terbentuk pada hasil elektroforesis tersebut difoto dengan
menggunakan kamera digital.
PCR dilakukan berkali-kali untuk melihat validitas pasangan primer
Potyvirus, pasangan primer Fabavirus, dan pasangan primer keduanya.
Tabel 1 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Potyvirus yang digunakan secara terpisah
terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus dan
keduanya).
Komponen
H2O
Gotag Green Master Mix 2x
Primer CPUP-F
Primer CP9502-R
cDNA
Total Volume (µl)
Volume(µl)1
9,5
12,5
1
1
1
25
1)
Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi;
sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi
2)
Volume(µl)2
28,5
37,5
3
3
3
75
Volume total yang diperlukan
Tabel 2 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Fabavirus yang digunakan secara terpisah
terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus dan
keduanya).
Komponen
H2O
Gotag Green Master Mix 2x
Primer BBWVVSSP
Primer BBWVKMRM
cDNA
Total Volume (µl)
1)
Volume(µl)1
9,5
12,5
1
1
1
25
Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi;
sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi
2)
Volume(µl)2
28,5
37,5
3
3
3
75
Volume total yang diperlukan
16
Tabel 3 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang digunakan
secara bersamaan terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus,
Fabavirus dan keduanya).
Komponen
H2O
Gotag Green Master Mix 2x
Primer CPUP-F
Primer CP9502-R
Primer BBWVVSSP
Primer BBWVKMRM
cDNA
Total Volume (µl)
1)
Volume(µl)1
Volume(µl)2
7,5
12,5
22,5
37,5
1
1
1
1
1
25
3
3
3
3
3
75
Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi;
sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi
2)
Volume total yang diperlukan