Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020 Elektroforesis Deoxyribonucleic Acid (DNA) Tujuan Praktikum 1. Mahasiswa memahami cara elektroforesis pada sampel deoxyribonucleic acid (DNA). 2. Mahasiswa mampu mengetahui fungsi dari setiap alat, bahan, dan cara kerja pada proses elektroforesis deoxyribonucleic acid (DNA). Pendahuluan Dalam menganalisis hasil amplifikasi PCR, mengetahui ukuran fragmen DNA yang diisolasi, hingga persiapan sekuensing, teknik elektroforesis perlu dilakukan. Elektroforesis merupakan teknik pemisahan biomolekul (RNA, DNA, dan protein) melalui aliran listrik menggunakan matriks gel sebagai tempat migrasinya dan buffer sebagai tempat elektron (arus listrik) mengalir. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan biomolekul berdasarkan muatannya, ukuran fragmennya, dan kerapatan matriks gel; sehingga terdapat perbedaan kecepatan migrasi fragmen pada matriks gel. Matriks gel yang dimaksud adalah tempat migrasi biomolekul, melalui pori-pori yang ukurannya ditentukan dari konsentrasi gel. Konsentrasi gel yang akan digunakan perlu disesuaikan dengan ukuran biomolekul yang akan dipisahkan. Konsentrasi gel akan memengaruhi kemampuan migrasi biomolekul; semakin besar konsentrasi gel, semakin tinggi pula kerapatan gel, semakin kecil ukuran pori-pori, sehingga semakin sulit biomolekul bermigrasi di dalam gel. Konsentrasi gel dapat dihitung melalui rumus berikut: πΎπππ πππ‘πππ π πππ (%) = πππ π π ππ’ππ’π πππ (π ππ‘ππ’ ππ) × 100% π£πππ’ππ ππ’ππππ ππππππ’π‘ (ππ ) Molekul berukuran besar, seperti DNA whole genome, dipisahkan menggunakan gel dengan konsentrasi yang lebih rendah, sedangkan molekul yang berukuran kecil (sekuens DNA ukuran tertentu hasil PCR) dipisahkan menggunakan gel dengan konsentrasi yang lebih tinggi. Pilihan jenis gel juga perlu dipertimbangkan dalam memisahkan biomolekul berdasarkan jenis dan ukurannya. Agarosa dan poliakrilamida merupakan jenis gel yang umum digunakan dalam elektroforesis. Gel dari agarosa umum digunakan untuk memisahkan fragmen DNA, sementara gel dari poliakrilamida digunakan untuk analisis ukuran dan muatan protein. Dalam membuat gel elektroforesis, bubuk gel dan buffer pelarut (disebut sebagai loading buffer/gel casting buffer) dicampurkan. Buffer yang digunakan sebagai loading buffer adalah buffer yang sama dengan running buffer. Jenis buffer yang umum digunakan adalah TAE (TrisAcetic Acid-EDTA) dan TBE (Tris-Boric Acid-EDTA). Bubuk gel harus dicampur dengan loading buffer agar elektron bisa mengalir melalui running matriks, membuat pemisahan molekul berjalan dengan optimal; menentukan dan menjaga pH agar tidak turun karena aliran elektron; dan mencegah difusi biomolekul di dalam matriks gel akibat panas yang timbul dari voltase yang digunakan. Setelah dicampurkan, larutan gel tersebut dipanaskan di dalam microwave. Panas yang dihasilkan microwave kemudian akan membuat larutan gel dapat mengeras setelah didinginkan. 1 Departemen Biologi FMIPA UI Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020 Selain gel elektroforesis dan buffer, reagen penting lainnya adalah pewarna DNA/DNA gel stain. Pewarna DNA berfungsi untuk mempermudah visualisasi gel hasil elektroforesis. Pewarna DNA ditambahkan ke dalam gel setelah gel dikeluarkan dari microwave tetapi sebelum gel mengeras. Molekul pewarna DNA tersebut akan berinteraksi dengan fragmen DNA sehingga fragmen DNA akan berpendar dan dapat terlihat saat divisualisasikan dengan dipaparkan sinar ultra violet (UV) di dalam mesin Gel Doc. Contoh pewarna DNA yang umum digunakan adalah Ethidium Bromide (EtBr) dan Gel Red. Ketika gel sudah mengeras dan sudah dimasukkan ke dalam chamber, serta direndam dengan running buffer, sampel DNA dapat dimasukkan (loading) ke dalam well/“sumur” elektroforesis yang dicetak oleh comb. Sebelum loading sampel, sampel perlu dicampur dengan reagen loading dye, agar densitas/kerapatan sampel lebih tinggi dari running buffer sehingga sampel tidak larut di buffer, tetapi tenggelam ke dasar well. Selain itu, loading dye juga berfungsi sebagai indikator kualitatif elektroforesis berjalan atau tidak, karena loading dye juga ikut tersaring di dalam matriks gel. Teknik elektroforesis menggunakan seperangkat alat khusus, yaitu aparatus elektroforesis yang tersusun dari tray, comb, dan electrophoresis chamber. Tray dan comb adalah alat yang digunakan dalam membuat gel (gel cast). Tray berfungsi sebagai cetakan dari gel yang akan dibentuk, sementara comb adalah pencetak well dari gel. Chamber adalah tempat berjalannya elektroforesis. Bagian penting lainnya adalah penutup chamber, elektroda, dan power supply. Voltase juga merupakan faktor penting dalam elekroforesis DNA karena jika terlalu tinggi dapat membuat gel meleleh dan jika terlalu rendah akan membuat fragmen DNA tidak terpisah dengan baik, serta jika voltase tidak stabil maka analisis ukuran fragmen dapat menjadi tidak akurat. Gambar 1 menunjukkan bagian aparatus elektroforesis secara umum. Gambar 1. Bagan aparatus elektroforesis Sumber: Science Direct, 2019 Setelah running elektroforesis, gel didokumentasikan pada mesin khusus visualisasi gel elektroforesis, yaitu Gel Doc System. Gel Doc System (Gel Documentation system) terdiri atas kamera, filter cahaya (monokromator), overhead illuminator, transilluminator, tempat gel, dan 2 Departemen Biologi FMIPA UI Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020 pengatur ketinggian gel. Kamera pada Gel Doc System juga diatur oleh komputer, sehingga gel dapat difoto sesuai keinginan. Gel Doc System tersambung dengan komputer agar foto gel dapat langsung disimpan dan dinamai. Gambar 2 menunjukkan bagian Gel Doc System secara umum. Gambar 2. Bagan Gel Doc System. Sumber: Palwala, 2014. Alat dan Bahan A. Alat 1. Labu Erlenmeyer 2. Gelas ukur 3. Timbangan digital 4. Microwave 5. Mikropipet 6. Tabung sentrifugasi 7. Aparatus elektroforesis: tray, comb, dan chamber 8. Gel Doc System B. Bahan 1. Sampel DNA 2. Bubuk agarosa 3. Loading buffer: 1x TAE buffer 4. Running buffer: 1x TAE buffer 5. Loading Dye 6. Gel Red 7. Marka DNA 1 kb 8. Parafilm 9. Mikrotips ukuran 1-10ul 10. Sarung tangan lateks 3 Departemen Biologi FMIPA UI Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020 Cara Kerja β’ Pembuatan Gel Agarosa 1,5% 1. Timbang 0,75g bubuk gel agarosa, masukkan ke dalam labu Erlenmeyer. 2. Tambahkan loading buffer (TAE buffer) sebanyak 50ml, aduk sedikit. 3. Panaskan di dalam microwave selama 60—90 detik dan tambahkan 2µl Gel Red. 4. Siapkan tray dan pasang comb di atas tray. 5. Tuang gel ke dalam cetakan/tray. 6. Tunggu gel mengeras, gel siap digunakan. β’ Loading sampel ke dalam Well pada Gel Elektroforesis 1. Masukkan gel ke dalam chamber, tambahkan running buffer (TAE buffer) hingga gel terendam. 2. Loading dye, marka DNA, dan parafilm disiapkan. 3. Sebanyak 2µl loading dye dicampur dengan 5µl DNA (di atas parafilm). 4. Masukkan campuran dan sampel DNA ke dalam well yang berbeda pada gel elektroforesis. β’ Running Elektroforesis 1. Penutup chamber dipasang, sambungkan aparatus elektroforesis ke power supply 100V. 2. Tunggu hingga 30—40 menit sampai sampel DNA dan marka mencapai ujung gel. 3. Matikan power supply, lepas power supply dari stopkontak, keluarkan gel dari chamber. β’ Dokumentasi Gel 1. Pindahkan gel secara perlahan ke dalam Gel Doc System. 2. Pastikan Gel Doc System tertutup rapat lalu nyalakan lampu sinar UV pada mesin Gel Doc System. 3. Amati dan simpan foto hasil elektroforesis ke dalam komputer. 4 Departemen Biologi FMIPA UI Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020 Daftar Pustaka Palwala, A. A. 2014. ‘Gel Documentation’ [presentasi PowerPoint]. Microbiology. Tersedia di: https://www.slideshare.net/palwala_aamir/gel-doc-system?from_action=save (Diakses pada 17 Februari 2020) Science Direct. 2019. Agarose. 1 hlm. https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/agarose. Diakses pada 17 Februari 2020, pk 19:00 WIB. 5 Departemen Biologi FMIPA UI
