Uploaded by Jessye Maria Deanne Awuy

Modul Praktikum Elektroforesis Gel 2020

advertisement
Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020
Elektroforesis Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa memahami cara elektroforesis pada sampel deoxyribonucleic acid (DNA).
2. Mahasiswa mampu mengetahui fungsi dari setiap alat, bahan, dan cara kerja pada proses
elektroforesis deoxyribonucleic acid (DNA).
Pendahuluan
Dalam menganalisis hasil amplifikasi PCR, mengetahui ukuran fragmen DNA yang
diisolasi, hingga persiapan sekuensing, teknik elektroforesis perlu dilakukan. Elektroforesis
merupakan teknik pemisahan biomolekul (RNA, DNA, dan protein) melalui aliran listrik
menggunakan matriks gel sebagai tempat migrasinya dan buffer sebagai tempat elektron (arus
listrik) mengalir. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan biomolekul berdasarkan
muatannya, ukuran fragmennya, dan kerapatan matriks gel; sehingga terdapat perbedaan
kecepatan migrasi fragmen pada matriks gel.
Matriks gel yang dimaksud adalah tempat migrasi biomolekul, melalui pori-pori yang
ukurannya ditentukan dari konsentrasi gel. Konsentrasi gel yang akan digunakan perlu
disesuaikan dengan ukuran biomolekul yang akan dipisahkan. Konsentrasi gel akan
memengaruhi kemampuan migrasi biomolekul; semakin besar konsentrasi gel, semakin tinggi
pula kerapatan gel, semakin kecil ukuran pori-pori, sehingga semakin sulit biomolekul bermigrasi
di dalam gel. Konsentrasi gel dapat dihitung melalui rumus berikut:
πΎπ‘œπ‘›π‘ π‘’π‘›π‘‘π‘Ÿπ‘Žπ‘ π‘– 𝑔𝑒𝑙 (%) =
π‘šπ‘Žπ‘ π‘ π‘Ž π‘π‘’π‘π‘’π‘˜ 𝑔𝑒𝑙 (𝑔 π‘Žπ‘‘π‘Žπ‘’ π‘šπ‘”)
× 100%
π‘£π‘œπ‘™π‘’π‘šπ‘’ π‘π‘’π‘“π‘“π‘’π‘Ÿ π‘π‘’π‘™π‘Žπ‘Ÿπ‘’π‘‘ (π‘šπ‘™ )
Molekul berukuran besar, seperti DNA whole genome, dipisahkan menggunakan gel
dengan konsentrasi yang lebih rendah, sedangkan molekul yang berukuran kecil (sekuens DNA
ukuran tertentu hasil PCR) dipisahkan menggunakan gel dengan konsentrasi yang lebih tinggi.
Pilihan jenis gel juga perlu dipertimbangkan dalam memisahkan biomolekul berdasarkan jenis
dan ukurannya. Agarosa dan poliakrilamida merupakan jenis gel yang umum digunakan dalam
elektroforesis. Gel dari agarosa umum digunakan untuk memisahkan fragmen DNA, sementara
gel dari poliakrilamida digunakan untuk analisis ukuran dan muatan protein.
Dalam membuat gel elektroforesis, bubuk gel dan buffer pelarut (disebut sebagai loading
buffer/gel casting buffer) dicampurkan. Buffer yang digunakan sebagai loading buffer adalah
buffer yang sama dengan running buffer. Jenis buffer yang umum digunakan adalah TAE (TrisAcetic Acid-EDTA) dan TBE (Tris-Boric Acid-EDTA). Bubuk gel harus dicampur dengan
loading buffer agar elektron bisa mengalir melalui running matriks, membuat pemisahan molekul
berjalan dengan optimal; menentukan dan menjaga pH agar tidak turun karena aliran elektron;
dan mencegah difusi biomolekul di dalam matriks gel akibat panas yang timbul dari voltase yang
digunakan. Setelah dicampurkan, larutan gel tersebut dipanaskan di dalam microwave. Panas
yang dihasilkan microwave kemudian akan membuat larutan gel dapat mengeras setelah
didinginkan.
1
Departemen Biologi FMIPA UI
Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020
Selain gel elektroforesis dan buffer, reagen penting lainnya adalah pewarna DNA/DNA gel
stain. Pewarna DNA berfungsi untuk mempermudah visualisasi gel hasil elektroforesis. Pewarna
DNA ditambahkan ke dalam gel setelah gel dikeluarkan dari microwave tetapi sebelum gel
mengeras. Molekul pewarna DNA tersebut akan berinteraksi dengan fragmen DNA sehingga
fragmen DNA akan berpendar dan dapat terlihat saat divisualisasikan dengan dipaparkan sinar
ultra violet (UV) di dalam mesin Gel Doc. Contoh pewarna DNA yang umum digunakan adalah
Ethidium Bromide (EtBr) dan Gel Red.
Ketika gel sudah mengeras dan sudah dimasukkan ke dalam chamber, serta direndam
dengan running buffer, sampel DNA dapat dimasukkan (loading) ke dalam well/β€œsumur”
elektroforesis yang dicetak oleh comb. Sebelum loading sampel, sampel perlu dicampur dengan
reagen loading dye, agar densitas/kerapatan sampel lebih tinggi dari running buffer sehingga
sampel tidak larut di buffer, tetapi tenggelam ke dasar well. Selain itu, loading dye juga berfungsi
sebagai indikator kualitatif elektroforesis berjalan atau tidak, karena loading dye juga ikut
tersaring di dalam matriks gel.
Teknik elektroforesis menggunakan seperangkat alat khusus, yaitu aparatus elektroforesis
yang tersusun dari tray, comb, dan electrophoresis chamber. Tray dan comb adalah alat yang
digunakan dalam membuat gel (gel cast). Tray berfungsi sebagai cetakan dari gel yang akan
dibentuk, sementara comb adalah pencetak well dari gel. Chamber adalah tempat berjalannya
elektroforesis. Bagian penting lainnya adalah penutup chamber, elektroda, dan power supply.
Voltase juga merupakan faktor penting dalam elekroforesis DNA karena jika terlalu tinggi dapat
membuat gel meleleh dan jika terlalu rendah akan membuat fragmen DNA tidak terpisah dengan
baik, serta jika voltase tidak stabil maka analisis ukuran fragmen dapat menjadi tidak akurat.
Gambar 1 menunjukkan bagian aparatus elektroforesis secara umum.
Gambar 1. Bagan aparatus elektroforesis
Sumber: Science Direct, 2019
Setelah running elektroforesis, gel didokumentasikan pada mesin khusus visualisasi gel
elektroforesis, yaitu Gel Doc System. Gel Doc System (Gel Documentation system) terdiri atas
kamera, filter cahaya (monokromator), overhead illuminator, transilluminator, tempat gel, dan
2
Departemen Biologi FMIPA UI
Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020
pengatur ketinggian gel. Kamera pada Gel Doc System juga diatur oleh komputer, sehingga gel
dapat difoto sesuai keinginan. Gel Doc System tersambung dengan komputer agar foto gel dapat
langsung disimpan dan dinamai. Gambar 2 menunjukkan bagian Gel Doc System secara umum.
Gambar 2. Bagan Gel Doc System.
Sumber: Palwala, 2014.
Alat dan Bahan
A. Alat
1. Labu Erlenmeyer
2. Gelas ukur
3. Timbangan digital
4. Microwave
5. Mikropipet
6. Tabung sentrifugasi
7. Aparatus elektroforesis: tray, comb, dan chamber
8. Gel Doc System
B. Bahan
1.
Sampel DNA
2.
Bubuk agarosa
3.
Loading buffer: 1x TAE buffer
4.
Running buffer: 1x TAE buffer
5.
Loading Dye
6.
Gel Red
7.
Marka DNA 1 kb
8.
Parafilm
9.
Mikrotips ukuran 1-10ul
10. Sarung tangan lateks
3
Departemen Biologi FMIPA UI
Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020
Cara Kerja
➒ Pembuatan Gel Agarosa 1,5%
1.
Timbang 0,75g bubuk gel agarosa, masukkan ke dalam labu Erlenmeyer.
2.
Tambahkan loading buffer (TAE buffer) sebanyak 50ml, aduk sedikit.
3.
Panaskan di dalam microwave selama 60β€”90 detik dan tambahkan 2µl Gel Red.
4.
Siapkan tray dan pasang comb di atas tray.
5.
Tuang gel ke dalam cetakan/tray.
6.
Tunggu gel mengeras, gel siap digunakan.
➒ Loading sampel ke dalam Well pada Gel Elektroforesis
1.
Masukkan gel ke dalam chamber, tambahkan running buffer (TAE buffer) hingga
gel terendam.
2.
Loading dye, marka DNA, dan parafilm disiapkan.
3.
Sebanyak 2µl loading dye dicampur dengan 5µl DNA (di atas parafilm).
4.
Masukkan campuran dan sampel DNA ke dalam well yang berbeda pada gel
elektroforesis.
➒ Running Elektroforesis
1.
Penutup chamber dipasang, sambungkan aparatus elektroforesis ke power supply
100V.
2.
Tunggu hingga 30β€”40 menit sampai sampel DNA dan marka mencapai ujung gel.
3.
Matikan power supply, lepas power supply dari stopkontak, keluarkan gel dari
chamber.
➒ Dokumentasi Gel
1.
Pindahkan gel secara perlahan ke dalam Gel Doc System.
2.
Pastikan Gel Doc System tertutup rapat lalu nyalakan lampu sinar UV pada mesin Gel
Doc System.
3.
Amati dan simpan foto hasil elektroforesis ke dalam komputer.
4
Departemen Biologi FMIPA UI
Modul Praktikum Biologi Molekuler ATA 2019/2020
Daftar Pustaka
Palwala, A. A. 2014. β€˜Gel Documentation’ [presentasi PowerPoint]. Microbiology. Tersedia di:
https://www.slideshare.net/palwala_aamir/gel-doc-system?from_action=save (Diakses
pada 17 Februari 2020)
Science Direct. 2019. Agarose. 1 hlm.
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/agarose. Diakses pada 17 Februari
2020, pk 19:00 WIB.
5
Departemen Biologi FMIPA UI
Download
Random flashcards
Rekening Agen Resmi De Nature Indonesia

9 Cards denaturerumahsehat

Rekening Agen Resmi De Nature Indonesia

9 Cards denaturerumahsehat

sport and healty

2 Cards Nova Aulia Rahman

Secuplik Kuliner Sepanjang Danau Babakan

2 Cards oauth2_google_2e219703-8a29-4353-9cf2-b8dae956302e

Tarbiyah

2 Cards oauth2_google_3524bbcd-25bd-4334-b775-0f11ad568091

Create flashcards