Uploaded by ShaniaAs

Proposal Mar'atus Mangifera Fix 10

advertisement
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN SITOTOKSIK EKSTRAK
KULIT BUAH MANGGA KASTURI (Mangifera casturi)
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA MCF7
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
Proposal Skripsi
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Farmasi
Mar’atus Sholihah
1643050085
FAKULTAS FARMASI
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
KIMIA BAHAN ALAM
JAKARTA
NOVEMBER 2019
HALAMAN PENGESAHAN
Proposal Skripsi
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN SITOTOKSIK EKSTRAK
KULIT BUAH MANGGA KASTURI (Mangifera casturi)
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA MCF7
Disusun Oleh
Mar’atus Sholihah
1643050085
Telah disetujui,
Pembimbing Utama
(Rabima, M. Farm, Apt)
Tanggal: 14 November 2019
ii
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
Kata Pengantar
Segala puji dan syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karna
atas segala nikmat serta limpahan Rahmat dan Hidayah-Nya, sehingga proposal
skripsi yang berjudul ”Aktivitas Antioksidan Dan Sitotoksik Ekstrak Kulit Buah
Mangga Kasturi (Mangifera casturi) Terhadap Sel Kanker Payudara MCF7”
dapat disusun dan diselesaikan dengan tepat waktu.
Proposal skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk menyelesaikan
program pendidikan Strata 1 Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas 17
Agustus 1945 Jakarta. Selain itu proposal skripsi ini juga sebagai bentuk
pengaplikasian ilmu pengetahuan yang diperoleh selama mengenyam pendidikan
di Fakultas Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta.
Dalam penulisan proposal skripsi ini banyak sekali pihak yang membantu
ataupun membimbing, sehingga dalam kesempatan kali ini saya mengucapkan
terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada:
1.
Ibu Dr. Diana Laila Ramatillah, M. Farm., Apt. selaku dekan Fakultas
Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta .
2.
Bapak Drs. Wahidin, M.Si., Apt. selaku kepala Program Studi Sarjana
Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta.
3.
Ibu Rabima, M.Farm, Apt Selaku dosen pembimbing akademik Fakultas
Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta.
4.
Ibu Rabima, M.Farm, Apt dan Bapak Sogandi, M.Si selaku dosen
pembimbing yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan skripsi ini
dan memberikan arahan, motivasi serta saran-saran yang sangat bermanfaat
bagi penulis.
5.
Kedua Orang tua, kakak yang senantiasa memberikan dorongan semangat,
materi, dan doa sehingga menjadikan motivasi untuk penulis.
6.
Kepada Ariq Ramadhan tersayang yang telah banyak membantu dan selalu
sabar menemani dalam penyusunan proposal skripsi ini I Love You.
iii
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
7.
Teman- teman seperjuangan skripsi Andi Ristiawan Sholih, Joni Suryo, Ka
Sella, Ka Dora. Squad IND (Dewi, Nelly Deana, Silvia) yang telah banyak
memberikan masukan serta saran selama penyusunan proposal skripsi. Serta
teman-teman lain yang tidak bisa saya sebutkan satu persatu, saya
mengucapkan banyak terimakasih.
Saya telah berusaha semaksimal mungkin dalam penyusunan skripsi ini
untuk mencapai hasil yang terbaik. Saya menyadari skripsi ini banyak kekurangan
dan jauh dari sempurna. Semoga proposal skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua
pihak
Jakarta, November 2019
Penulis
iv
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................
i
LEMBAR PENGESAHAN ......................................................................
ii
KATA PENGANTAR ..............................................................................
iii
DAFTAR ISI .............................................................................................
V
BAB I : PENDAHULUAN........................................................................
1
1.1 Latar Belakang ..........................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah .....................................................................
2
1.3 Tujuan Penelitan........................................................................
3
1.4 Manfaat Penelitian ....................................................................
3
1.5 Hipotesis....................................................................................
3
BAB II : TINJAUAN PUSTAKA ............................................................
4
2.1 Tumbuhan Kasturi (Magnifera Casturi) ...................................
4
2.1.1 Klasifikasi Tumbuhan Kasturi ........................................
4
2.1.2 Morfologi Tanaman ........................................................
5
2.1.3 Kandungan Kimia ...........................................................
6
2.2 Ekstrasi dan Fraksinasi ..............................................................
8
2.2.1 Metode Ekstrasi Dingin ..................................................
8
2.2.2 Metode Ekstrasi Panas ....................................................
9
2.2.3 Fraksinasi ........................................................................
10
2.3 Kandungan Total Flavonoid ......................................................
11
2.4 Kandungan Total Fenol .............................................................
10
2.5 Antioksidan ...............................................................................
12
2.5.1 Macam-macam Antioksidan (Sayuti et al, 2015) ...........
12
2.5.2 Vitamin C ........................................................................
13
2.5.3 Uji Antioksidan ...............................................................
14
2.6 Antikanker .................................................................................
16
2.6.1 Pengertian Kanker Payudara ...........................................
17
2.6.2 Sel Kanker MCF7 ...........................................................
17
v
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
2.6.3 Etiologi Kanker Payudara ...............................................
18
2.6.4 Patofisiologi Kanker payudara.........................................
18
2.6.5 Pengobatan Kanker (Radji, 2016) ...................................
19
2.6.6 Mekanisme Antikanker (Radji, 2016) .............................
21
2.6.7 Doxorubisin......................................................................
22
2.6.8 Uji Aktivitas Antikanker .................................................
23
2.6.9 Apoptosis ........................................................................
24
2.6.10 Anti Proliferasi ..............................................................
24
2.5 GC-MS (Gass Chomatography – Mass Spectrocopy) ..............
24
BAB III : METODOLOGI PENELITIAN .............................................
26
3.1 Metode Penelitian .....................................................................
26
3.2 Tempat dan Waktu ..................................................................
26
3.3 Sampel ....................................................................................
26
3.4 Alat dan Bahan ..........................................................................
26
3.4.1 Alat ...................................................................................
26
3.4.2 Bahan ...............................................................................
27
3.5 Prosedur Kerja ...........................................................................
27
3.5.1 Determinasi Simplisia ......................................................
27
3.5.2 Ekstraksi ...........................................................................
27
3.5.3 Fraksinasi .........................................................................
28
3.5.4 Skrining Fitokimia ...........................................................
28
3.5.5 Uji Total Kandungan Flavonoid.......................................
31
3.5.6 Uji Total Kandungan Fenolik...........................................
32
3.5.7 Uji Antioksidan ................................................................
33
3.5.8 Uji Antikanker..................................................................
35
3.5.8.1 Persiapan Larutan Uji ...........................................
35
3.5.8.2 Persiapan Kultur Sel MCF7 .................................
35
3.5.8.3 Uji Proliferasi dengan MTT .................................
36
3.5.8.4 Apoptosis .............................................................
36
3.5.8.5 Perhitungan Persen Inhibisi..................................
37
vi
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
3.5.8.6 Analisa Data .........................................................
37
3.4.8 Identifikasi Kandungan Senyawa Fraksi Kulit
Buah Kasturi (Mangifera casturi) dengan
menggunakkan Gass Chomatography – Mass
Spectrocopy (GC-MS) ....................................................
38
DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................
39
LAMPIRAN ...............................................................................................
46
vii
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang menjadi
perhatian khusus di bidang kedokteran dan kesehatan, hal ini disebabkan
karena belum ditemukan cara efektif untuk mengobatinya. Kanker dapat
diartikan sebagai suatu kelompok besar penyakit yang ditandai dengan
adanya sel-sel abnormal yang bertumbuh di luar batas wajarnya, kemudian
melakukan penyebaran ke organ lain dan menyerang bagian-bagian tubuh
yang berdekatan (Sunaryanti, 2011). Penyakit kanker dengan presentase
tertinggi di Indonesia adalah kanker payudara sebesar 0,5% dan kanker
serviks sebesar 0,8% (Kemenkes RI, 2015).
Terdapat berbagai faktor yang dapat menyebabkan timbulnya kanker
seperti merokok, terpapar radiasi, terinfeksi virus, terpapar hormon dengan
kadar tinggi, memiliki riwayat penyakit kanker dan radikal bebas . Radikal
bebas mempunyai sifat sangat labil dan reaktif sehingga menimbulkan
kerusakan sel seperti DNA, lipid, protein dan karbohidrat. Radikal bebas
merupakan suatu molekul yang mempunyai satu atau lebih elektron yang
tidak berpasangan pada orbit terluarnya (Septiana et al, 2017). Dapat
diartikan bahwa radikal bebas memiliki sifat toksik terhadap sel-sel dan
molekul biologis di dalam tubuh karena radikal bebas berusaha mengambil
elektron dari molekul sekitarnya. Radikal bebas yang mengambil elektron
dari DNA dapat menyebabkan gangguan lipid pada dinding sel, pembuluh
darah, produksi prostaglandin dan protein lain nya sehingga struktur DNA
berubah dan menimbulkan sel mutan. Bila mutasi ini terjadi berlangsung
lama dapat menjadi kanker (Werdhasari, 2014).
Terdapat beberapa jenis pengobatan terhadap kanker salah satunya
adalah kemoterapi. Kemoterapi adalah penggunaan obat-obatan baik dalam
bentuk injeksi, ataupun tablet minum untuk mematikan sel-sel kanker
(Yudissanta, 2012). Selain menggunakkan pengobatan secara klinis dengan
1
UNIVERSITAS 17 AGUSTUS 1945
2
menggunakkan bahan kimia, pengobatan secara tradisional menggunakan
bahan alam juga sering dilakukan. Pengobatan tradisional biasanya
menggunakkan ramuan ramuan yang berasal dari akar, kulit batang, kayu,
daun, buah, kulit buah, biji, dan bunga (Sukandar, 2008). Salah satu
tumbuhan yang dapat digunakan sebagai alternatif untuk pengobatan kanker
adalah buah mangga (Mangifera indica L.). Penelitian sebelumnya yang
dilakukan oleh Lauricella (2019) menyatakan bahwa buah mangga
(Mangifera indica L.) memiliki aktivitas sebagai antikanker (Lauricella et
al, 2019).
Indonesia kaya akan sumber daya alam nabati maupun hewani yang
dapat dimanfaatkan sebagai pengobatan. Banyak jenis tumbuhan Indonesia
yang dapat digunakan sebagai obat, salah satunya dengan tumbuhan kasturi
(Mangifera casturi). Mangifera casturi merupakan tumbuhan khas Pulau
Kalimantan dan termasuk dalam tumbuhan langka. Pada kulit batang kasturi
(Mangifera casturi) memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S.aureus
dan E.coli. (Rosyidah, 2012) .Penelitian terdahulu menyatakan bahwa daun
tumbuhan kasturi (Mangifera casturi Kosterm.) juga memiliki aktivitas
antioksidan (Khairiah, 2018). Sedangkan pada kulit buahnya mengandung
senyawa flavonoid, alkaloid, triterpenoid, saponin, tanin, glikosida, dan
fenolik (Sogandi, 2018) Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder
dari tanaman yang memiliki aktivitas sebagai antikanker (Sirait, 2019 )
Oleh karena itu peneliti tertarik untuk melakukan penelitian lebih
lanjut mengenai uji aktivitas antioksidan dan antikanker dari fraksi kulit
buah kasturi (Mangifera Casturi)
1.2 Rumusan Masalah
1.2.1
Apakah kulit buah mangga kasturi (Mangifera Casturi) memiliki
aktivitas antioksidan dan antikanker terhadap sel kanker payudara
MCF7?
1.2.2
Senyawa bioaktif apakah yang terdapat dalam kulit buah mangga
kasturi (Mangifera casturi) yang berperan sebagai antioksidan dan
antikanker ?
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
3
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Mengetahui aktivitas antioksidan dan antikanker kulit buah mangga
kasturi (Mangifera casturi) terhadap sel kanker payudara MCF7.
1.3.2
Mengetahui jenis senyawa bioaktif dalam fraksi kulit buah mangga
kasturi (Mangifera casturi) yang berperan sebagai antioksidan dan
antikanker.
1.4
Manfaat Penelitian
1.4.1 Dapat digunakan sebagai referensi mengenai uji aktivitas antioksidan
kulit buah kasturi (Mangifera casturi) untuk penelitian lanjutan.
1.4.2
Dapat digunakan sebagai referensi bagi penelitian selanjutnya untuk
uji aktivitas antikanker dari kulit buah kasturi (Mangifera casturi).
1.4.3
Menambah wawasan untuk berfikir kritis dalam memberikan
penjelasan secara ilmiah mengenai efek kulit buah kasturi (Mangifera
casturi) sebagai agen terapi kanker payudara MCF7.
1.5
Hipotesis
Kulit buah mangga kasturi (Mangifera Casturi) memiliki aktivitas
antioksidan
dan
antikanker
terhadap
sel
kanker
payudara
MCF
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Tumbuhan Kasturi ( Mangifera Casturi )
Gambar 2.1 Tumbuhan Kasturi (Mangifera Casturi)
Sumber : wikimedia commons
2.1.1
Klasifikasi Tumbuhan Kasturi
Kingdom
: Plantae (tumbuhan)
Subkingdom
: Thracheobionta (tumbuhan berpembuluh)
Super divisi
: Spermatophyta (menghasilkan biji)
Divisi
: Angiospermae/Magnoliophyta (tumbuhan
berbunga)
Kelas
: Dicotyledoneae/Magnoliopsida (berkeping dua)
Subkelas
: Rosidae
Ordo
: Sapindales
Family
: Anacardiaceae
Genus
: Mangifera
Spesies
: Mangifera Casturi (Andriyani, 2013)
4
UNIVERSITAS 17 AGUSTUS 1945
5
2.1.2
Morfologi Tanaman
Tanaman mangga kasturi (Mangifera casturi) merupakan
tumbuhan khas Pulau Kalimatan. Tumbuhan ini memiliki umur
puluhan tahun dan memiliki habitat di hutan ataupun pekarangan
rumah. Jenis akar yang dimiliki tanaman mangga kasturi (Mangifera
casturi) merupakan perakaran tunggang yang memiliki warna coklat
keabu-abuan. Bentuk batang tanaman ini silindris dengan tinggi
hingga 25m dan diameter yang dimilikinya kurang lebih 1m. Kulit
batang bagian luar berwarna coklat tua dan kulit batang yang telah
mati memiliki retakan berwarna keabu-abuan. Sedangkan kulit
batang bagian dalam memiliki warna coklat muda. Tanaman bisa
mencapai tinggi 25-50 m atau bahkan lebih, dengan diameter batang
±40-115 cm. (Sutomo, 2017).
Daun tanaman mangga kasturi (Mangifera casturi) berwarna
hijau muda sampai dengan hijau tua dengan bentuk daun lancet.
Panjang daunnya berkisar ± 20 samapi dengan 27 cm dan lebar ±
5,5 samapi dengan 8,5 cm. Tanaman ini memiliki permukaan daun
kasar, ujung daun berbentuk runcing dengan tepi rata. Tulang
daunnya menyirip dengan jumlah 17 sampai dengan 23 pasang.
(Sutomo, 2017)
Bunga mangga kasturi (Mangifera casturi) termasuk bunga
atinomorf atau bunga berbentuk bintang dan memiliki rambut rapat.
Tanamn ini juga memiliki bunga berbentuk karang dalam malai
dengan banyak yang berukuran cukup kecil. Bunga ini tergolong
dalam bunga majemuk berkelamin ganda. Panjang tangkai bunga
berkisar ±28 cm .Daun kelopak berbentuk bulat telur memanjang
dengan panjang 2-3 mm. Daun mahkota berbentuk bulat telur
memanjang dan bunga berbau harum. Benang sari sama panjang
dengan mahkota, staminodia sangat pendek seperti benang sari yang
tertancap pada tonjolan dasar bunga (Rashedy, 2014).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
6
Tanaman mangga kasturi (Mangifera casturi) memiliki
bentuk buah yang bulat sampai elips dengan berat berkisar antara 6084 g, panjang antara 4,5-5,5 cm, dan lebar 3,5-3,9 cm. Saat matang
buah mangga kasturi (Mangifera casturi) memiliki bintik-bintik
berbentuk bulat kecil kehijauan. Warna buah ini saat matang adalah
coklat keunguan.Buah ini memiliki getah pada permukaan kulitnya
yang licin (Sutomo, 2107) .Daging buahnya cenderung tipis dan
mengandung kadar air yang cukup tinggi air, berwarna orange
kekunginan serta memiliki serabut, tekstur daging buah sedikit kasar,
memiliki rasa yang manis keasaman dengan bau yang khas. Buah ini
memiliki biji berdinding tebal. Biji nya bertekstur keras sehingga
tergolong dalam
biji batu. Saat memasuki musim penghujan,
tanaman ini akan mulai berbuah (Shaban, 2009).
2.1.3
Kandungan Kimia
Batang pohon mangga kasturi (Mangifera casturi) memiliki
kandungan senyawa terpenoid, steroid, dan saponin (Mustikasari,
2008). Penelitian yang di lakukan oleh Soetomo, dkk menyatakan
bahwa ekstrak metanol buah mangga kasturi mengandung senyawa
golongan terpenoid, steroid, dan fenolik. Berdasarkan penelitian
sebelumnya menggunakkan pengujian fitokimia fraksi etil asetat,
menyatakan bahwa daun mangga kasturi mengandung flavonoid,
tanin, serta triterpenoid. (Tanaya et al, 2015)
Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yang
dihasilkan oleh mikroorganisme dan sering dikaitkan dengan
pengobatan penyakit kanker diabetes, dan lainnya. Flavonoid
termasuk ke dalam kelas polifenol dan memiliki fungsi sebagai
modulator komunikasi intraseluler. Flavonoid dikenal memiliki sifat
terapeutik seperti antioksidatif, anti mutagenik, dan anti karsinogenik
(Yadavalli, 2019).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
7
Tanin merupakan senyawa metabolit sekunder yang mampu
mengikat protein, sehingga protein pada tanaman dapat resisten
terhadap degradasi oleh enzim protease didalam silo. Selain itu tanin
juga bersifat melindungi protein dari degradasi enzim mikroba
(Oliveira et al, 2009) . Berdasarkan penelitian terdahulu yang telah
dilakukan menyatakan bahwa senyawa flavonoid, steroid, dan tannin
dalam bentuk bebas dan kompleks tannin-protein berkhasiat sebagai
antiinflamasi. (Simon, 2000)
Triterpenoid adalah suatu senyawa metabolit sekunder yang
tersusun dari kerangka karbon dan enam satuan isoprena yang di
sebut skualena. Skualena terbentuk dari turunan hidrokarbon C 30
asiklik. Senyawa
ini mengandung gugus alkohol, aldehida, atau
asam karboksilat. Menurut penelitian terdahulu yang telah dilakukan
triterpenoid dapat digunakkan sebagai obat seperti untuk pengobatan
diabetes, gangguan menstruasi, gangguan pada kulit, kerusakan hati
dan juga pengobatan `malaria. Triterpenoid ini juga dapat
bermanfaat bagi tumbuhan, karena senyawa ini memiliki aktivitas
sebagai anti jamur, membunuh serangga (insektisida), anti
pemangsa, pembunuh bakteri & antivirus. (Widiyati, 2006)
Saponin adalah senyawa yang terdapat disebagian besar
tanaman tingkat tinggi serta pada beberapa hewan laut. Senyawa
glikosida ini merupakan sekumpulan senyawa yang memiliki
berbagai macam sifat fisikokimia, struktur dan efek biologisnya
(Patra, 2009). Menurut penilitian yang telah dilakukan saponin
mempunyai aktivitas hemolitik, antibakterial, aktivitas sitotoksik
atau antikanker, efek hipokolesterolemia (Singh, 2012).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
8
2.2
Ekstraksi dan Fraksinasi
Ekstraksi dapat di artikan sebagai pemisahan suatu senyawa atau
bahan dari campurannya dengan menggunakkan cairan pelarut yang cocok
atau sesuai. Pada proses ektraksi ini akan tercapai kesetimbangan
konsentrasi suatu senyawa didalam pelarut dengan konsentrasi didalam sel
tanaman. Saat terjadi kesetimbangan proses ekstraksi ini akan dihentikan.
Menurut Hamdani (2009) terdapat 2 jenis metode ekstraksi berdasarkan ada
tidak nya proses pemanasan, yaitu ekstraksi dingin dan panas.
2.2.1
Metode Ekstraksi Dingin :
2.2.1.1 Maserasi
Maserasi adalah cara penyarian yang sangat sederhana
dibandingkan
proses
ekstraksi
lainnya.
Proses
maserari
dilakukan dengan cara menggunakkan cairan penyari yang
cocok
untuk
merendam
serbuk
simplisia.
Saat
proses
perendaman ini terjadi, cairan penyari akan memasuki dinding
sel dan perlahan akan masuk kedalam rongga sel. Di dalam
rongga sel terdapat zat aktif, sehingga saat cairan penyari masuk
maka akan melarutkan zat aktif di dalam nya. Larutan terpekat
di dalam sel akan keluar karena adanya perbedaan konsentrasi
antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel. Proses ini akan
terjadi berulang kali sampai didapatkan konsentrasi yang
seimbang antara larutan di dalam dan di luar sel.
2.2.2.2 Perkolasi
Perkolasi
adalah
proses
penyarian
dengan
cara
mengalirkan cairan penyari melalui bahan yang telah dibasahi .
Proses perkolasi umumnya dilakukan pada suhu ruangan.
Prosedur metode ini yaitu bahan direndam dengan pelarut,
kemudian pelarut baru dialirkan secara terus menerus sampai
warna pelarut tidak lagi berwarna atau tetap bening yang artinya
sudah tidak ada lagi senyawa yang terlarut. Kelebihan dari
metode ini yaitu tidak diperlukan proses tambahan untuk
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
9
memisahkan padatan dengan ekstrak, sedangkan kelemahan
metode ini adalah jumlah pelarut yang dibutuhkan cukup banyak
dan proses juga memerlukan waktu yang cukup lama, serta tidak
meratanya kontak antara padatan dengan pelarut (Sarker et al,
2006).
2.2.2
Metode Ekstraksi Panas :
2.2.2.1 Sokhlet
Metode ini dilakukan dengan menempatkan serbuk sampel
dalam sarung selulosa (dapat digunakan kertas saring) dalam
klonsong yang ditempatkan di atas labu dan di bawah
kondensor. Pelarut yang sesuai dimasukkan ke dalam labu dan
suhu penangas diatur di bawah suhu reflux. Keuntungan dari
metode ini adalah proses ektraksi yang kontinyu, sampel
terekstraksi oleh pelarut murni hasil kondensasi sehingga tidak
membutuhkan banyak pelarut dan tidak memakan banyak
waktu. Kerugiannya adalah senyawa yang bersifat termolabil
dapat terdegradasi karena ekstrak yang diperoleh terus-menerus
berada pada titik didih. (Mukhriani, 2011).
2.2.2.2 Refluk
Ekstraksi refluks merupakan metode ekstraksi yang
dilakukan pada titik didih pelarut tersebut, selama waktu dan
sejumlah pelarut tertentu dengan adanya pendingin balik
(kondensor). Pada umumnya dilakukan tiga sampai lima kali
pengulangan proses pada rafinat pertama. Kelebihan metode
refluks adalah padatan yang memiliki tekstur kasar dan tahan
terhadap pemanasan langsung dapat diekstrak dengan metode
ini. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan jumlah pelarut
yang banyak ( Irawan, 2010).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
10
2.2.2.3 Infusa
Infusa adalah cara ekstraksi dengan menggunakan pelarut
air pada suhu 98-98˚C selama 15-20 menit. Bejana infusa
teredup dalam dalam tangas air (Hanani, 2015).
2.2.2.4 Destilasi Uap
Destilasi uap memiliki proses yang sama dan biasanya
digunakan untuk mengekstraksi minyak esensial (campuran
berbagai
senyawa
menguap).
Selama
pemanasan,
uap
terkondensasi dan destilat (terpisah sebagai 2 bagian yang tidak
saling bercampur) ditampung dalam wadah yang terhubung
dengan kondensor. Kerugian dari kedua metode ini adalah
senyawa yang bersifat termolabil dapat terdegradasi (Seidel,
2006).
2.2.2.5 Dekokta
Dekok merupakan cara ekstraksi yang mirip dengan
infusa,
akan
tetapi
pada
dekok
proses
ekstraksinya
membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 30 menit dan
suhunya mencapai titik didih air (Hanani, 2015).
2.2.3
Fraksinasi
Fraksinasi pada prinsipnya adalah proses penarikan senyawa
pada suatu ekstrak dengan menggunakan dua macam pelarut yang
tidak saling bercampur. Pelarut yang umumnya dipakai untuk
fraksinasi adalah n-heksan, etil asetat, dan metanol. Untuk menarik
lemak dan senyawa non polar digunakan n-heksan, etil asetat untuk
menarik senyawa semi polar, sedangkan metanol untuk menarik
senyawa-senyawa polar. Dari proses ini dapat diduga sifat kepolaran
dari senyawa yang akan dipisahkan. Sebagaimana diketahui bahwa
senyawa-senyawa yang bersifat non polar akan larut dalam pelarut
yang non polar sedangkan senyawasenyawa yang bersifat polar akan
larut dalam pelarut yang bersifat polar juga (Mutiasari, 2012).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
11
2.3
Kandungan Total Flavonoid
Total kandungan flavonoid diukur dengan prinsip 𝐴𝑙𝐶𝑙3 yang akan
membentuk kompleks karena memiliki C-4 gugus keto lalu dengan C-3 atau
C-5 gugus hidroksil yang bertetangga sehingga terjadi pergeseran panjang
gelombang ke arah visible (nampak) yang terlihat dari warna kuning pada
larutan .Pada pengukuran total flavonoid dilakukan pembuatan standar
kuersetin sebagai pembanding. Pada penelitian ini untuk menentukan kadar
flavonoid total pada sampel digunakan kuarsetin sebagai larutan standar
dengan deret konsentrasi 6, 8, 10, 12 dan 14 ppm. Digunakan deret
konsentrasi karena metode yang di pakai dalam menentukan kadar adalah
metode yang menggunakan persamaan kurva baku untuk membuat kurva
baku terlebih dahulu dibuat beberapa deret konsentrasi untuk mendapatkan
persamaan linear yang dapat digunakan untuk menghitung persen kadar.
Pengukuran serapan panjang gelombang maksimum dilakukan running dari
panjang gelombang 400 – 450 nm. Kuersetin dipilih karena merupakan
salah satu golongan flavonoid/flovanol Pengukuran absorbansi dilakukan
pada panjang gelombang 435 nm. Ekstrak dengan kandungan total
flavonoid tertinggi kemudian dilanjutkan padat tahap pengujian nilai
antioksidan (IC50) (Senet et al, 2018)
2.4
Kandungan Total Fenol
Kandungan fenolik total pada ekstrak dinyatakan sebagai ekuivalen
asam galat atau Gallic Acid Equivalent (GAE). GAE merupakan acuan
umum untuk mengukur sejumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam
suatu bahan (Mongkolsilp et al, 2004). Total kandungan fenolik dapat
dilakukan dengan menggunakkan reagen Folin-Ciocalteu. Penentuan
kandungan total fenol merupakan uji kuantitatif yang didasarkan pada
kemampuan sampel untuk mereduksi reagen Folin-Ciocalteu membentuk
Kompleks Molybdenum-Blue. Timbang ekstrak sebanyak 100mg, larutkan
dengan aquadest 10ml (konsentrasi 10mg/ml). Lalu Pipet 1ml dan encerkan
dengan aquadest 10ml, sehingga diperoleh konsentrasi 1mg/ml. Kemudian
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
12
pipet 0,2 ekstrak dan tambahkan aqadest sebanyak 15,8 ml. Tambah 1 ml
reagen Folin-Ciocalteu lalu di kocok. Diamkan selama 8menit, lalu
tambahkan Na2CO3 10%. Kemudian diamkan lagi selama 2 jam pada suhu
kamar. Ukur serapan dengan spektrometer UV-Vis . Lakukan tiga kali
pengulangan (Triplo) (Orak, 2006).
2.5
Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkap atau meredam
dampak negatif oksidan dalam tubuh. Dalam pengertian kimia, senyawa
antioksidan
adalah
senyawa
pemberi
elektron
(electron
donors).
Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada
senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut
bisa dihambat (Winarsi, 2007). Antioksidan bersifat sangat mudah
dioksidasi, sehingga radikal bebas akan mengoksidasi antioksidan dan
melindungi molekul lain dalam sel dari kerusakan akibat oksidasi oleh
radikal bebas atau oksigen reaktif.Radikal bebas merupakan molekul yang
sangat reaktif karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dalam
orbital luarnya sehingga dapat bereaksi dengan molekul sel tubuh dengan
cara mengikat elektron molekul sel tersebut (Nurdin et al, 2008). Radikal
bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses metabolisme
normal, dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel
tubuh yang akhirnya menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif
(Juniarti, 2009)
2.5.1 Macam-macam Antioksidan (Sayuti et al, 2015):
2.5.1.1 Antioksidan Primer
Antioksidan primer merupakan antioksidan yang bekerja
untuk mencegah pembentukan senyawa radikal baru, yaitu
mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang
berkurang dampak negatifnya sebelum senyawa radikal bebas
bereaksi. Antioksidan primer mengikuti mekanisme pemutusan
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
13
rantai reaksi radikal dengan mendonorkan atom hidrogen secara
cepat pada suatu lipid yang radikal, produk yang dihasilkan
lebih stabil dari produk awal. Contoh antioksidan primer adalah
superoksida dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx),
katalase dan protein pengikat logam.
2.5.1.2 Antioksidan Sekunder
Antioksidan sekunder bekerja dengan cara megkelat
logam yang bertindak sebagai pro oksidan, menangkap radikal
dan mencegah terjadinya reaksi berantai. Antioksidan seunder
berperan sebagai pengikat ion-ion logam, penangkap oksigen,
pengurai hidroperoksida menjadi senyawa non radikal, penyerap
radiasi UV atau deaktivasi singlet oksigen. Contoh antioksidan
sekunder adalah vitamin E, C, , β-karoten, isoflavon, bilirubin
dan albumin.
2.5.1.3 Antioksidan Tersier
Antioksidan tersier bekerja dengan cara memperbaiki
kerusakanbiomolekul yang disebabkan radikal bebas. Contoh
antioksidan tersier adalah enzim-enzim yang memperbaiki DNA
yaitu metionin sulfida reduktase.
2.5.2
Vitamin C
Pembanding yang digunakkan dalam pengujian antioksidan ini
adalah vitamin C. (Farmakope, 1995)
Sinonim
: 2,3-didehydro-L-threo-hexono-1,4-lactone;
Acidum ascorbicum
Rumus Kimia
: C6H8O6
Berat Molekul
: 176,15
Deskripsi
: Kristal atau serbuk putih atau agak kuning. Bila
terpapar udara, warnanya perlahan-lahan menjadi
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
14
lebih gelap. Dalam keadaaan kering, stabil di udara,
tetapi dalam larutan akan teroksidasi dengan cepat.
Kelarutan
: Larut 1 bagian dalam 3 bagian air dan 1 bagian
dalam 40 bagian alkohol, tidak larut dalam
kloroform, eter, dan benzena.
Penyimpanan
: dalam wadah tertutup rapat dan terlindung dari
cahaya matahari.
Stabilitas
: Secara bertahap menjadi gelap lewat paparan
terhadap cahaya, namun sedikit perubahan warna
tidak berpengaruh pada efek terapinya. Asam
askorbat teroksidasi dengan cepat pada udara atau
suasana basa.Pada konsentrasi > 100 mg/ml, vitamin
C mengalami dekomposisi melalui produksi kabon
dioksida.
Vitamin C juga disebut sebagai elektron donor (pemberi
elektron) sehinggatermasukdalam senyawa anti-oksidan. Vitamin C
sebagai pemberi elektron, juga ini berarti sebagai agen reduktor,
berasal dari sifat ikatan ganda antara C-2 dan C-3 dari cincin lakton 6karbontersebut. Vitamin C dapat mencegah senyawa-senyawa lain
mengalami oksidasi. Secara alamiah vitamin C itu sendiri yang
mengalami oksidasi (Wijaya, 2014).
2.5.3
Uji Antioksidan
2.5.3.1
Metode DPPH (1, 1-diphenyl-2picrylhydrazyl radical)
DPPH
(2,2-difenil-1-pikril-hidrazil)
Uji
aktivitas
antioksidan dengan metode DPPH dilakukan untuk menentukan
seberapa besar aktivitas suatu sampel untuk menghambat radikal
stabil DPPH dengan cara mendonorkan atom hidrogen. Sampel
yang memiliki aktivitas antioksidan akan mereduksi DPPH
menjadi DPPH-H (Molyneux, 2005). Prinsip DPPH adalah
reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
15
Senyawa DPPH akan bereaksi dengan atom Hidrogen yang
berasal
dari
suatu
antioksidan
membentuk
senyawa
dihenylpicrylhydrazine berwarna kuning pucat ( Molyneux,
2004).
Parameter yang dipakai untuk menentukan aktivitas
antioksidan adalah harga konsentrasi efesien atau efficient
concentration 50 ( EC50) atau inhibition concentration 50
(IC50) , yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat
menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau
konsentrasi suatu zat antioksidan yang memberikan %
penghambatan sebesar 50%. Zat yang mempunyai antioksidan
tinggi akan mempunya nilai EC50 atau IC50 yang rendah
(Molyneux, 2004). Aktivitas antioksidan dikatakan sangat kuat
jika nilai IC50 < 50 µg/mL, kuat jika IC50 < 100 µg/mL, sedang
jika IC50 < 150 µg/mL, lemah jika IC50 < 200 µg/mL, dan
sangat lemah jika IC50 > 200 µg/mL (Blois, 1958). Selain itu
aktivitas suatu antioksidan juga di pengaruhi oleh kandungan
total fenol, semakin besar kandungan total fenol maka semakin
tinggi pula aktivitas antioksidan nya. (Chung and Woo, 2001).
2.5.3.2
Metode Cupric Ion Reducing Antioxidant (CUPRAC)
Pada metode CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant
capacity),
kompleks
bis-
neokuproin-tembaga(II)
akan
mengoksidasi senyawaan antioksidan dalam ekstrak tanaman
dan mengalami reduksi membentuk kompleks bis-neokuprointembaga(I). Secara visual hal ini dapat dilihat dari perubahan
warna kompleks larutan dari biru toska menjadi kuning.
Pereaksi CUPRAC merupakan pereaksi yang selektif karena
memiliki nilai potensial reduksi yang rendah, yaitu sebesar 0,17
V (Apak et al. 2007).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
16
2.5.3.3
Metode Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)
Hasil pengujian dengan metode FRAP dipengaruhi oleh
banyaknya reduksi dari ferri-tripyridyl triazine (Fe (III)-TPTZ)
berubah menjadi ferrotripyridyl-triazine (Fe (II)-TPTZ) oleh
pereduksi atau reduktan (Benzie,1996).
2.5.3.4
Metode uji kapasitas radikal oksigen (ORAC)
Prosedur analisis ini mengukur kemampuan antioksidan
dari makanan, vitamin, suplemen nutrisi atau bahan kimia lainya
terhadap radikal bebas. Uji ini dilakukan dengan menggunakan
trolox (analog vitamin E ) sebagai standar untuk menentukan
trolox ekuvalen (TE). Nilai ORAC kemudian dihitung dari TE
dan ditunjukan sebagai satuan atau nilai ORAC. Semakin tinggi
nilai ORAC, semakin besar kekuatan antioksidanya (Amelia,
2011).
2.6
Antikanker
Upaya pengobatan kanker dapat dilakukan dengan pembedahan,
radiasi, kemoterapi, dan pemberian hormon-hormon terapi (Di Piro et al.,
2009). Kemoterapi bekerja berdasarkan gangguan pada salah satu proses sel
yang essensial, karena tidak ada perbedaan kualitatif antara sel kanker
dengan sel normal, maka semua obat anti kanker bersifat mengganggu sel
normal, bersifat sitotoksik, dan bukan kankerosid atau kankerotoksik yang
selektif (Nafrialdi & Gan, 2008) .
Berdasarkan penelitian tanaman obat sebagai antikanker, alkaloid
merupakan senyawa kimia yang berpotensi memiliki aktivitas tersebut
dengan mekanisme menginduksi apoptosis (Macabeo et al., 2008).
Apoptosis adalah tipe kematian sel yang terprogram melalui serangkaian
perubahan struktural sebagai hasil dari rangsang fisiologis atau patologis.
Ciri morfologi apoptosis adalah pengkerutan sel, penonjolan membran
(membrane blebbing), mitokondria bersegregasi, ribosom bersegregasi,
sitoplasma berkondensasi, kondensi kromatin, dan fragmentasi inti sel (De
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
17
Vita et al., 1997 cit Sudarmawan, 2006; Rahmawati, 2006) Alkaloid yang
telah digunakan untuk pengobatan kanker adalah alkaloid vinkristin dan
vinblastin dari tanaman tapak dara.
2.6.1
Pengertian Kanker Payudara
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang
mempunyai prevalensi cukup tinggi. Kanker ini dapat menyerang pria
ataupun wanita, namun prevalensi terhadap wanita jauh lebih tinggi
dibandingkan dengan pria. Kemungkinan laki-laki terkena kanker
payudara adalah 1: 100 dari wanita. Frekuensi kejadian kanker
payudara relatif tinggi, terutama pada wanita usia 40 tahun ke atas
(Wijayakusuma, 2008). Sampai usia 80 tahun, risiko seumur hidup
seseorang wanita untuk terkena kanker payudara adalah 1 dari 9
(Davey, 2005). Kanker juga merupakan penyebab utama kematian
pada anak-anak antara 3-14 tahun di Amerika Serikat (Nafrialdi &
Gan, 2008).
Kanker payudara pada umumnya berupa ductal breast cancer
yang invasif dengan pertumbuhan yang tidak terlalu cepat. Sebagian
besar kanker payudara ditandai dengan adanya gumpalan yang
biasanya terasa sakit pada payudara. Adapun gejala yang jarang
ditemui berupa sakit pada payudara, erosi, retraksi, pembesaran dan
rasa gatal pada bagian puting, timbul kemerahan, pemesaran atau
penyusutan payudara. (Tambunan, 2003)
2.6.2
Sel Kanker MCF7
Sel MCF7 merupakan sel kanker payudara yang diperoleh
dari pleural effusion breast adenocarcinoma seorang pasien wanita
Kaukasian berubur 69 tahun, golongn darah , dengan Rh Positif. Sel
tersebut menunjukkan adanya deferensiasi pada jaringan epitel
mammae termasuk deferensiasi pada sintesis estradiol. Media dasar
penumbuh sel MCF7 adalah media EMEM terformulasi. Untuk
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
18
memperoleh media kompleks , maka ditambahkan 0,01 mg/ml bovine
insulin dan FBS hingga konsentrasi akhir FBS dalam media menjadi
10%. Sel ditumbuhkan pada suhu 37°C dan dengan kadar CO2 5%.
Sel MCF7 tergolong Cell line adherent (Zampieri et al, 2002 )
Sel MCF-7 digunakan di mana-mana dalam penelitian untuk
percobaan sel kanker payudara ER-positif, dengan sebagian besar
investigasi terhadap resistensi obat anti-estrogen yang didapat telah
menggunakannya. Sel MCF-7 sangat cocok untuk studi resistensi
terapi
anti-hormon
karena
mereka
mudah
dikultur
dan
mempertahankan ekspresi ER ketika mereka diperlakukan dengan
terapi yang ditargetkan tersebut. Untuk menyelidiki sifat-sifat sel
kanker payudara yang kebal antihormon yang diperoleh, populasi sel
MCF-7 - yang diadaptasi ke berbagai lingkungan anti-hormon - telah
dibuat (Comsa, 2015).
2.6.3
Etiologi Kanker Payudara
Faktor etiologi kanker payudara sampai saat ini belum di ketahui
pasti. Namun ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi
timbulnya kanker payudara. Faktor reproduksi (usia menache dini,
kehamilan pertama pada usia lanjut, paritas yang rendah, masa
laktasi), faktor endokrin ( kontrasepsi oral, terapi sulih hormon, usia
>75 tahun denan densitas payudara 75%, hiperplasi atipik), adapun
faktor genetik yang dapat menyebabkan kanker payudara (riwayat
keluarga dengan kanker payudara, kanker ovarium). Namun faktor
resiko utama yang berhubungan dengan kanker payudara adalah
keadaan hormonal dan genetik (Rasajidi, 2010).
2.6.4
Patofisiologi Kanker Payudara
Kanker payudara yang invasif disebabkan oleh pertumbuhan selsel epitel payudara yang berlebih dan tidak terkendali (Stopeck et al,
2014). Proliferasi sel yang berlebih dapat disebabkan oleh mutasi gen,
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
19
tidak aktifnya gen supresor tumor, gangguan apoptosis, dan gangguan
perbaikan DNA sehingga terjadi aktivasi onkogen yang pada akhirnya
menjadi sel kanker invasif. Selain itu, reseptor estrogen dan
progesteron yang berada di inti sel yang terdapat pada beberapa
kanker payudara dapat mendorong replikasi DNA, pembelahan sel
dan pertumbuhan sel kanker ketika hormon yang sesuai berikatan
pada reseptor
(Kosir, 2013). Pertumbuhan sel ini dapat muncul
pertama kali di duktus maupun lobulus payudara yang kemudian
menyebar ke jaringan sekitar infiltrasi, invasi, dan penetrasi progresif.
Sel kanker dapat menyebar melalui aliran limfe dan sirkulasi darah
yang mengakibatkan metastasis ke organ tubuh lain (Kosir, 2013)
2.6.5
Pengobatan Kanker
Pengobatan kanker sangat bervariasi dan tergantung pada
berbagai faktor, antara lain jenis kanker, lokasi kanker pada tubuh,
stadiumnya dan status kesehatan pasien. Pada umumnya,
pengobatan kanker ditujukan untuk membunuh sel kanker,
mengangkat sel kanker melalui tindakan operasi, atau mencegah
agar sel kanker tidak mendapatkan sinyal yang dibutuhkan untuk
proses pembelahan sel. Selain itu, upaya pengobatan kanker juga
dilakukan dengan cara meningkatkan sistem kekebalan tubuh
pasien sehingga tubuh mampu mempertahankan diri dari serangan
sel kanker. Beberapa jenis pengobatan kanker (Radji, 2016) :
2.6.5.1 Operasi
Tindakan operasi merupakan pengobatan lini pertama
untuk kanker atau tumor padat. Pada kasus kanker yang
terdiagnosis pada stadium dini, tindakan operasi merupakan
cara yang cukup efektif untuk menanggulangi kanker. Pada
umumnya, tindakan operasi hanya dapat mengatasi kanker
jinak atau tumor yang terlokalisasi.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
20
2.6.5.2 Radiasi
Radiasi ditujukan untuk membunuh sel kanker dengan
energi sinar, biasanya merupakan terapi setelah pengangkatan
sel tumor. Radiasi juga dapat dikombinasi dengan kemoterapi
untuk membunuh sel-sel kanker yang kemungkinan tidak
dapat dihilangkan sepenuhnya dengan cara operasi.
2.6.5.3 Kemoterapi
Kemoterapi merupakan pengobatan yang menggunakan
suatu senyawa kimia untuk membunuh sel kanker yang
sedang
membelah
dan
mencegah
perkembangan
sel
selanjutnya.
2.6.5.4 Terapi hormonal
Obat ini diberikan untuk mencegah pertumbuhan sel
kanker dengan mencegah sel kanker menerima sinyal penting
untuk pembelahan dan proliferasi sel kanker.
2.6.5.5 Terapi tepat sasaran
Terapi tepat sasaran (targeted therapy) merupakan
golongan obat yang relatif baru untuk pengobatan kanker.
Obat ini bekerja secara spesifik dan terarah untuk
menghalangi peran protein atau enzim tertentu yang spesifik
hanya terdapat atau banyak terdapat pada sel kanker.
Penghambatan terhadap peran protein spesifik tersebut akan
mencegah pertumbuhan dan proliferasi sel kanker.
2.6.5.6 Antibodi monoklonal
Antibodi digunakan dalam terapi kanker merupakan
antibodi monoklonal yang diproduksi tidak hanya untuk
menghantarkan senyawa kemoterapi, tetapi juga digunakan
sebagai obat. Antibodi monoklonal sebagai terapi antikanker
bekerja dalam berbagai mekanisme, baik secara langsung
dapat membunuh sel kanker maupun dengan menghambat
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
21
sinyal penting yang dibutuhkan untuk proliferasi sel. Karena
antibodi bersifat sangat spesifik, antibodi monoklonal dapat
dikatakan sebagai inhibitor spesifik untuk sel kanker.
2.6.5.7 Biological response modifier
Terapi ini menggunakan protein yang secara alami
tedapat dalam tubuh untuk menstimulasi pertahanan tubuh
dalam mengatasi sel kanker.
2.6.5.8 Vaksin kanker
Tujuan penggunaan vaksin kanker adalah untuk
menstimulasi sistem kekebalan tubuh melawan kanker.
Vaksin kanker umumnya mengandung protein yang terdapat
pada sel kanker atau yang diproduksi oleh sel kanker.
Pemberian protein tersebut sebagai vaksin akan merangsang
respons tubuh terhadap sel kanker.
2.6.5.9 Terapi alternatif dan komplementer
Terapi ini menggunakan senyawa alami dari herbal atau
hewan yang digunakan untuk pengobatan kanker disamping obat
konvensional.
2.6.6
Mekanisme Antikanker
Obat antikanker merupakan suatu senyawa yang dapat
menghambat pertumbuhan atau membunuh sel kanker. Antikanker
umumnya bekerja dengan cara membunuh sel yang sedang
berkembang. Dengan begitu, sel kanker lebih rentan terhadap
senyawa yang bersifat sitotoksik tersebut karena sel kanker
umumnya terus membelah dengan cepat dibandingkan dengan sel
yang normal. Antikanker biasanya ditujukan untuk menghambat
langsung sistem metabolisme esensial pada replikasi sel kanker,
antara lain penghambatan terhadap biosintesis purin dan pirimidin
yang merupakan senyawa penting untuk sintesis RNA dan DNA.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
22
Beberapa jenis antikanker yang umum digunakan pada terapi
kanker adalah (Radji, 2016)
2.6.6.1 Senyawa antimetabolit
Senyawa ini dapat menghambat sintesis purin atau
pirimidin yang merupakan precursor nukleotida sehinga dapat
menghambat sintesis RNA dan DNA sel dan menyebabkan
kematian sel kanker.
2.6.6.2 Senyawa genotoksik
Senyawa genotoksik menyebabkan kelainan pada DNA
sehingga mempengaruhi replikasi DNA dan pembelahan sel
kanker.
2.6.6.3
Inhibitor spindel mitosis sel
Senyawa ini dapat menghambat pembelahan sel dengan
menghambat pembentukan spindel sel yang merupakan
komponen sitoskeletal sel sehingga sel tidak mampu
membelah diri.
2.6.6.4 Senyawa antikanker lain
Senyawa dalam golongan ini merupakan senyawa yang
dapat menghambat pembelahan sel kanker yang tidak
termaduk dalam kategori senyawa yang telah disebutkan
sebelumnya.
2.6.7
Doxorubisin
Doxorubicin adalah obat yang sering digunakan dalam
terapi kanker dan memiliki nama dagang adryamicin. Obat ini tidak
diserap oleh saluran cerna, karena obat ini sangat mengiritasi saluran
lambung. Ikatan doxorubicin dengan protein plasma adalah 75%
(Kumar et al, 2014)
Doxorubisin merupakan antibiotik golongan antrasiklin
yang banyak digunakan untuk pengobatan kanker serviks, ovarium,
endometrium, dan karsinoma mama. Antibiotik antrasiklin seperti
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
23
doxorubisin berinterkalasi dengan DNA, sehingga fungsi DNA
sebagai template dan pertukaran sister chromatid terganggu dan pita
DNA putus. Antrasiklin juga bereaksi dengan sitokrom P450 reduktase
yang dengan adanya MADPH membentuk zat perantara, yang
kemudian bereaksi dengan oksigen menghasilkan radikal bebas yang
menghancurkan sel (Nafrialdi & Gan, 2008).
2.6.8
Uji Aktivitas Antikanker
2.6.8.1
Uji 3-[4,5-dimetilthiazol-2yl]-2,5-difeniltetrazolium bromide
(MTT)
Uji MTT adalah uji yang sensitif, kuantitatif dan
terpercaya. Reaksi MTT merupakan reaksi reduksi selular yang
didasarkan pada pemecahan garam tetrazolium MTT berwarna
kuning menjadi kristal formazan berwarna biru keunguan.
Metode perubahan warna tersebut digunakan untuk mendeteksi
adanya proliferasi sel. Sel yang mengalami proliferase,
mitokondrianya akan menyerap MTT sehingga sel-sel tersebut
akan berwarna ungu akibat terbentuknya kristal tetrazolium
(formazan) (Depamede et al, 2009).
2.6.8.2
Metode Perhitungan Langsung
Metode
perhitungan
langsung
dilakukan
dengan
pengecatan menggunakan larutan biru tripan. Sel yang mati akan
menyerap warna biru tripan, sedangkan yang hidup tidak. Hal
ini disebabkan karena sel yang mati mengalami kerusakan pada
membrane selnya, mengakibatkan protein di dalam sel keluar
dan berikatan dengan biru tripan. Pemberian biru tripan
dilakukan secara bertahap untuk menghindari kemungkinan
kematian sel yang disebabkan oleh biru tripan dan hasilnya sel
yang mati akan tampak keruh tidak bercahaya (Freshney, 2010).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
24
2.6.9
Apoptosis
Apoptosis merupakan mekanisme kematian sel penting
yang telah terprogram dalam berbagai proses biologi. Proses apoptosis
yang kurang atau tidaak sempurna dapat menimbulkan berbagai
macam penyakit. Apoptosis yang terlalu banyak dapat menyebabkan
kekacauan sel, sedangkan apoptosis yang terlalu sedikit dapat
mengakibatkan poliferasi sel yang tidak terkontrol atau dapat disebut
dengan kanker (CRCC, 2009).
2.6.10
Anti Proliferasi
Uji penghambatan pertumbuhan proliferasi dilakukan
setelah diketahui nilai IC50. Tujuan pengujian antiproliferasi ini
adalah untuk mengetahui bahwa suatu senyawa dapat menghambat
pertumbuhan sel. Pada uji antiproliferasi sel dipuasakan (starvasi)
selama 24 jam dalam media kultur yang mengandung FBS dimana
FBS kaya akan nutrisi yang penting untuk pertumbuhan sel, sehingga
dengan mengurangi kadar FBS dalam media berarti terjadi
pengurangan pertumbuhan. Tujuan dari starvasi adalah mengurangi
kecepatan pertumbuhan sel, menyebabkan sel berada dalam standart
awal yang sama yaitu G0 (fase istirahat). Sel yang berada pada fase M
akan cepat berhenti dan mencapai fase G0, sedangkan pada fase G1
akan meneruskan daur sel sehingga pada G0 akan berhenti. Sel kanker
merupakan sel yang tidak terkontrol pertumbuhannya karena dapat
memenuhi sendiri kebutuhan akan signal pertumbuhan (Muhammad,
2018)
2.7
GC-MS (Gass Chomatography – Mass Spectrocopy)
Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) merupakan
instrumen yang mendukung untuk menganalisis suatu senyawa dalam
konsentrasi yang kecil salah satu instrument yang dapat mendeteksi suatu
senyawa hingga < 1 ng/g . GC adalah suatu teknik kromatografi yang hanya
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
25
dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa yang mudah
menguap. Cara kerja mesin ini adalah suatu fase gerak yang berbentuk gas
mengalir di bawah tekanan melewati pipa yang dipanaskan dan disalut
dengan fase diam cair atau dikemas dengan fase diam cair yang disalut pada
suatu penyangga padat. Seiring dengan berkembang nya zaman dan
kemajuan teknologi, instrument GC di gunakkan bersamaan dengan
instrument lain seperti Mass-Spectrometer. Mass-Spectrometer atau yang
biasa disebut spektrometer masa dapat digunakkan untuk menentukan bobot
molekul dan juga menentukan rumus molekul. Prinsipnya adalah pengionan
senyawa-senyawa kimia untuk menghasilkan molekul bermuatan dan
mengukur rasio massa atau muatan (Ari, 2016).
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
BAB III
Metodologi Penelitian
3.1
Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental
laboratorik.
3.2
Tempat dan Waktu
Penelitian di lakukan di Laboratorium Universitas 17 Agustus 1945
Jakarta yang beralamat di Jalan Sunter Permai Raya, Jakarta Utara; Pusat
Studi satwa Primata yang berlokasi di Bogor, Jawa Barat; Pusat Studi
Biofarmaka Propika IPB di Kampus IPB Taman Kencana, Bogor. Penelitian
ini berlangsung dalam waktu 5 bulan terhitung dari bulan Oktober 2019
sampai dengan bulan Maret 2020
3.3
Sampel
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah
mangga kasturi (Mangifera casturi)
3.4
Alat dan Bahan
3.4.1 Alat
Alat
yang
digunakkan
dalam
penelitian
ini
adalah
Spektrofotometer UV-Vis , peralatan maserasi, Rotary Evaporator,
erlenmeyer, labu ukur, botol penampung berbagai ukuran, batang
pengaduk, cawan uap, blender, kertas saring, corong pisah,
alumunium foil, pipet, timbangan, penjepit kayu, lemari pendingin,
microplate 96 sumuran , haemocytometer, microplate reader, tissue
cultur flack, tabung falcon, hot plate, GC-MS, Lampu UV, Elisa
reader,
26
UNIVERSITAS 17 AGUSTUS 1945
27
3.4.2
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa kulit buah
mangga kasturi (Mangifera casturi) matang, etanol 70%, etil asetat, nheksan,
NaOH,𝐻2 𝑆𝑂4 pekat, dan serbuk Mg-HCl pekat, kloroform,
amoniak, pereaksi mayer, pereaksi dragendorff, pereaksi wagner, asam
sulfat, metanol, anhidra asetat, larutan besi (III) klorida 10%, plat
KLT, n-butanol, DPPH, DMSO, larutan metanol proanalisa, vitamin
C, aquadest, sel kanker payudara (MCF7),
MTT [3-(4,5-
dimetiltiazolil-2)-2,5- difeniltetrazolium bromida] (Sigma), media
penumbuh RPMI (Rossewell Park Memorial Institute), PBS
(Phosphate buffer Saline) pH 7,4 Sodium Dodesil Sulfat (SDS) 10%,
Fetal bovine serum (FBS) 10%, Natrium subkarbonat (NaHCO3) 2 g/l,
HCl 0,1 N, trypan blue dan trypsin EDTA 0,5%, doxorubisin,
kuersetin, asam galat, 𝐴𝑙𝐶𝑙3, 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3, Fenol Folin-Ciocalteu,
Working Solution etidium bromida-akridin oranye,
3.5
Prosedur Kerja
3.5.1
Determinasi Simplisia
Mangifera casturi yang akan digunakan diambil dari kabupaten
Banjar, Kalimantan Selatan dan dilakukan determinasi di Pusat
Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI),
Kebun Raya Bogor.
3.5.2
Ekstraksi
Pertama, dilakukan pemisahan antara daging dan kulit buah
mangga kasturi. Kemudian kulitnya dikeringkan dan di haluskan
sebanyak 600g. Kemudian dilakukan ekstraksi dengan metode
maserasi dengan pelarut etanol 70% (1:1). Maserasi dilakukan 3 x 24
jam (3 kali pengulangan). Maserat yang diperoleh kemudian
dipekatkan dengan Rotary Evaporator. Setelah itu diuapkan di atas
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
28
waterbath. Sehingga dihasilkan ekstrak kental etanol 70% dan
dilakukan perhitungan rendemen.
3.5.3
Fraksinasi
Ekstrak etanol difraksinasi menggunakan pelarut n-heksan, etil
asetat, dan metanol. Fraksinasi dilakukan dengan cara 30 g ekstrak
kental kulit buah kasturi dilarutkan dalam 100 mL metanol-air (4:1)
kemudian difraksinasi menggunakan 100 mL n-heksan (Tanaya et al,
2015), kocok campuran tersebut sampai terbentuk dua lapisan.
Pisahkan lapisan n-heksan dan metanol-air dengan cara dituang dari
corong pisah ke erlenmayer. Lakukan perlakuan tersebut sebanyak 6
kali
sampai
jernih.
Selanjutnya
fraksi
n-heksan
dipekatkan
menggunakan rotary evaporator. Fase metanol-air difraksinasi
menggunakan etil asetat 100 mL, kocok campuran tersebut sampai
terbentuk dua lapisan. Pisahkan fraksi etil asetat dan metanol dengan
cara dituang dari corong pisah ke erlenmeyer. Lakukan perlakuan
tersebut sebanyak 5 kali sampai jernih. kemudian fraksi yang didapat,
dipekatkan dipekatkan menggunakan rotary evaporator. Fraksi nheksan, etil asetat dan metanol-air yang diperoleh ditimbang dan
dihitung rendemen (Munawaroh et al, 2018)
3.5.4
Skrining Fitokimia
Skrining atau pengujian fitokimia yang dilakukan adalah uji
flavonoid, alkaloid, terpenoid, triterpenoid dan steroid, glikosida,
tanin, saponin, dan fenolik.
Tabel 1. Skringing Fitokimia
No
1.
Identifikasi
Alkoloid
Cara Identifikasi Senyawa
Teori
1.Ekstrak kental 0,1g +
Senyawa alkaloid
10ml kloroform amoniakal
ditunjukkan oleh :
(kocok lalu saring)
-Tabung pertama (adanya
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
29
2. Tambah asam sulfat 2N,
pisah kan menjadi dua
lapisan
3. Lapisan bagian atas
(asam) dimasukkan
kedalam masing-masing
endapan putih)
-Tabung kedua (adanya
endapan coklat kemerahan)
-Tabung ketiga (adanya
endapan coklat kemerahan)
(Kristianti et al, 2008)
tiga tabung reaksi.
- Tabung peratama (+3
tetes pereaksi Mayer)
- Tabung kedua (+3 tetes
pereaksi Dragendorff)
- Tabung ketigas (+3 tetes
pereaksi Wagner)
2.
Flavonoid
1. Ekstrak kental 0,1 g + 10
Senyawa flavonoid di
mL metanol
tunjukkan oleh perubahan
2. Bagi menjadi empat
warna yang terjadi pada
tabung ( kontrol,
masing-masing tabung
NaOH,𝐻2 𝑆𝑂4 pekat, dan
(Tapas, 2008)
serbuk Mg-HCl pekat)
3. Masing-masing tabung
di bandingkan dengan
tabung kontrol.
1. Ekstrak kental yang telah Senyawa saponin
3.
Saponin
diencerkan 1:1 dengan air
ditunjukkan dengan adanya
2. Dikocok secara vertikal
busa yang dihasilkan stabil
(±15menit)
setelah didiamkan selama 15
menit (Marliana, 2005)
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
30
4
Triterpenoid
4.
5.
& Steroid
Tanin
1.0,1 g sampel dilarutkan
a.Senyawa terpenoid
dengan metanol, uapkan di
ditunjukkan dengan
atas waterbath
terbentuk cincin kecoklatan
2. Filtrat digerus, larutkan
atau violet.
dengan 2 mL kloroform
b. Senyawa sterois
3. Tambah anhidra asetat
ditunjukkan dengan
10 tetes
terbentuk cincin yang
4. Tetesi dengan ,𝐻2 𝑆𝑂4 3
berwarna hijau. (Nugrahani,
tetes
2016)
Larutan uji sebanyak 1ml
Senyawa tanin ditunjukkan
direaksikan dengan larutan
dengan adanya warna biru
besi (III) klorida 10%
tua atau hitam kehijauan. (
Halimah, 2010)
6.
Glikosida
1.Ekstrak kental 1g
Senyawa glikosida
2. Tambahkan dengan 5ml
ditunjukkan dengan adanya
asam asetat anhidrat P
cincin berwarna ungu
3. Tambahkan dengan asam kemerahan (Sawhney,2005)
sulfat P (10tetes)
7.
Fenolik
1.Larutan ekstrak
Senyawa fenolik ditunjukkan
ditotolkan pada plat KLT
dengan adanya noda warna
dan dielusi dengan
hijau, merah, hitam yang
menggunakan pelarut n-
kuat (Aktsar,2015)
butanol : asam asetat : air
(4:1:5)
2. amati bercak pada lampu
UV dan disemprot dengan
reagen besi (III) klorida
(𝐹𝑒𝐶𝑙3)
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
31
3.5.5
Uji Total Kandungan Flavonoid
1. Penentuan panjang gelombang maksimum kuersetin
Penentuan panjang gelombang kuersetin dilakukan dengan running
larutan kuersetin pada range 400-450nm. Hasilnya menunjukan
panjang gelombang maksimum kuersitin adalah 435nm. Panjang
gelombang ini dibunakkan untuk mengukur serapan dari sampel uj.
2. Pembuatan kurva standart kuersetin
Timbang 25 mg kuersetin, larutkan dalam 25 mL etanol. Larutan
dipipet sebanyak 1mL lalu ditambahkan etanol hinggal 10 mL (100
ppm). Lalu buat pengenceran konsentrasi 6 ppm, 8 ppm, 10ppm, 12
ppm, dan 14 ppm. Dari masing-masing konsentrasi dipipet 1 mL.
Kemudian di tambahkan 1 mL 𝐴𝑙𝐶𝑙3 2% dan 1 mL kalium asetat
120 mM. Sampel diinkubasi selama satu jam pada suhu kamar.
Absorbansi ditentukan menggunakan metode spektrofotometri UVVis pada panjang gelombang maksimum 435 nm
3. Penetapan kadar flavonoid total ekstrak etanol kulit buah mangga
kasturi (Mangifera casturi)
Timbang 15 mg ekstrak, dilarutkan dalam 10 mL etanol, sehingga
diperoleh konsentrasi 1500 ppm. Dari larutan tersebut dipipet 1mL
kemudian ditambahkan 1 mL larutan 𝐴𝑙𝐶𝑙3 2% dan 1 mL kalium
asetat 120 mM. Sampel diinkubasi selama satu jam pada suhu
kamar.
Absorbansi
ditentukan
menggunakkan
metode
spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang maksimum 435
nm. Sampel dibuat dalam 3 replika untuk setiap analisis dan
diperoleh nilai rata-rata absorbansi (Stankoviv, 2011).
4. Analisis kandungan flavonoid total :
%=
𝐶𝑝 (𝐴𝑢 − 𝐴𝑏𝑢 )
100
𝑥 1,25 𝑥
𝐴𝑝 − 𝐴𝑏𝑝
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒
% = Falvonoid total
𝐶𝑝 = konsentrasi larutan pembanding
𝐴𝑢 = Absorbansi larutan uji dengan alumunium klorida
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
32
Abu= Absorbansi larutan uji tanpa alumunium klorida
Ap = Absorbansi larutan pembanding dengan alumunium klorida
Abp= Absorbansi larutan pembanding tanpa alumunium klorida
1,25 = Faktor konstan
3.5.6
Uji Total Kandungan Fenolik
1.
Pembuatan reagen
a. Pembutan larutan induk asam galat
Timabng 50 mg asam galat, tambahkan 1mL etanol 96%.
Kemudian tambahkan dengan aquadst hingga volume akhir
50mL.
b. Pembuatan larutan 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 10%
Timbang 10g 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 , tambahkan aquadest sampai 20mL.
Diamkan selama 24 jam.
2.
Pembuatan kurva kalibrasi asam galat dengan reagen Fenol FolinCiocalteu
Larutan induk asam galat 50 ml (1mg/mL) di pipet 1 mL; 1,25
mL; 1,5 mL; 1,75 mL; dan 2 mL secara berturut-turut. Kemudian
ditambahkan dengan aquadest dengan volume akhir 10mL
sehingga dihasilkan konsentrasi 100, 125, 150, 175, 200µg/ml
asam galat. Dari masing-masing konsentrasi dipipet 0,2 mL lalu
ditambahkan 15,8 mL aquadest dan 1 mL Reagen Folin-Ciocalteu
kemudian kocok sampai homogen (diamkan selama 8 menit).
Ditambahkan 3 mL larutan 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 10% lalu kocok sampai
homogen dan diamkan selama 2 jam pada suhu kamar. Ukur
serapan geombang pada serapan maksimum 765 nm dengan
spektrofotometer UV-Vis (DeBeer, 2004)
3.
Penetapan kandungan fenol total dengan metode Folin-Ciocalteu
(Orak, 2006)
Timbang 100 mg ekstrak kemudian dilarutkan sampai 10 mL
dengan aquades sehingga diperoleh konsentrasi 10 mg/mL.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
33
Kemudian pipet 1 mL dan ditambahkan dengn aquadest hingga
10 mL (1 mg/mL). Pipet 0,2 mL ekstrak, tambahkan 15,8 mL
aquadest dan 1 mL regaen Folin-Ciocalteu lalu dikocok.
Didiamkan selama 8 menit kemudian ditambahkan 3 mL 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3
10%. Setelah itu diamkan selama 2 jam pada suhu kamar. Ukur
serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang maksimum 765. Dilakukan tiga kali pengulangan
(triplo).
4.
Analisis kandungan total fenolik menggunakan rumus :
%=
𝐶𝑝 𝑥
𝐴𝑢−𝐴𝑏
𝑥𝑓𝑥𝑣
𝐴𝑝−𝐴𝑏
𝑊
𝑥 100%
Au = Absorbansi larutan uji
Ap = Absorbansi larutan standart
Ab = Absorbansi larutan kosong
Cp = Konsentrasi larutan standart
V = Volume larutan uji sebelum pengenceran
W = Bobot ekstrak (gram)
F = Faktor pengenceran larutan uji
3.5.7
Uji Antioksidan
1. Pembuatan larutan DPPH ( 100 ppm)
Ditimbang
10
mg
DPPH
(1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
(BM=394,33) dilarutkan dalam 100 mL methanol proanalisis lalu
dihomogenkan dan ditempatkan dalam botol berwarna gelap.
2. Penentuan kurva serapan larutan DPPH
Diukur serapan dan panjang gelombang maksimum larutan DPPH
pada panjang gelombang 400-800 nm dengan blanko metanol (Pro
analisa).
3. Penyiapan seri larutan uji fraksi kulit buah mangga kasturi
(Mangifera casturi)
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
34
Sampel ditimbang 250 mg kemudian di tambahkan methanol pro
analisa sampai 500 ml (500 ppm). Buat konsentrasi pengenceran
fraksi kulit buah mangga kasturi (Mangifera casturi) , fraksi nheksana, fraksi etil asetat, dan fraksi metanol dengan konsentrasi
500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 ppm yang dibuat dalam pelarut
metanol pro analisa.
4. Pembuatan larutan pembanding vitamin C
Sejumlah 2,5 mg Vitamin C ditimbang, lalu dilarutkan
menggunakan metanol proanalisis sampai 25 mL (100 ppm).
Kemudian dibuat dengan konsentrasi 0,5; 1; 2; 4; 8; 16 ppm.
5. Pengukuran serapan perendaman radikal bebas DPPH
Pada tabung reaksi dimasukkan 1,5 ml larutan uji. Kemudian
ditambah 0,5 ml larutan pereaksi DPPH dikocok sampai homogen,
disimpan selama 30 menit ditempat gelap. Kemudian ukur serapan
larutan blanko, larutan uji, dan kontrol positif pada panjang
gelombang maksimum 517 nm.
6. Analisis antioksidan
Presentasi peredaman radikal bebas DPPH dihitung dengan rumus :
𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒
% inhibisi = (
𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
) 𝑥 100%
Aktivitas penangkapan radikal bebas dari ekstrak dan fraksi
ditentukan dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi efektif yang
dibutuhkan
untuk
menurunkan
50%
intensitas
serapan
dibandingkan larutan pereaksi DPPH. IC50 dihitung dari persen
(%) peredaman serapan berbagai konsentrasi dengan menggunakan
regresi linier. Pengujian antioksidan dilakukan triplo dengan
menggunakkan microplate 96 well. Dengan menggunakkan larutan
DPPH konsentrasi 100 ppm. Dan dihitung serapan nya dengan
spektrofotometri
UV-Vis.
Serapan
dihitung
pada
panjang
gelombang 517 nm.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
35
3.5.8
Uji Antikanker
3.5.8.1 Persiapan Larutan Uji
1. Larutan Uji Fraksi
Sebanyak 1 mg sampel uji ditimbang dan dilarutkan dengan
50 μl DMSO 0,1%, lalu ditambahkan DMSO 0,1% ad 1000
μl sehingga diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Selanjutnya
dibuat larutan uji dengan seri konsentrasi 500; 250; 125;
62,5; 31,25; dan 15,625 ppm dari larutan stok
2. Persiapan Kontrol Positif
Doxorubisin dipakai sebagai kontrol positif, dibuat larutan
dengan mempipet sebnyak 3,75 μl dari larutan induk 2000
ppm,
dan
ditambahkan
1496,25
μl
media
DMEM
(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) sehingga diperoleh
konsentrasi doxorubisin 5 ppm.
3. Kontrol DMSO (Kontrol Negatif)
Buat pengenceran DMSO 99,5% dengan DMSO pro analisis
menjadi konsentrasi 0,1%. Kemudian saring dengan
menggunakkan Syiringe filter membrane non pyrogenic.
3.5.8.2 Persiapan Kultur Sel MCF7
Dari koleksi Pusat Studi Primata Bogor, didaptkan sel
kanker MCf7 yang disimpan dalam cyro vial dari nitrogen cair
dihangatkan dengan water bath dengan suhu 370C beberapa saat
lalu di sentrifuse. Setelah itu pindahkan sel ke T-flash yang
sudah berisi 5-10 ml medium kultur DMEM,. Kemudian
diinkubasi pada inkubator CO2 5 % dengan suhu 37ºC, sampai
sel tumbuh dan menempel (±24 jam) (diamati dengan
mikroskop apakah sel sudah tumbuh dan menempel). Kemudian
media dibuang dan masukan PBS untuk membilas.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
36
3.5.8.3 Uji Proliferasi Sel MCF7 dengan Metode MTT
Kemudian sel yang telah dikultur diberi perlakuan
sampel dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu :
Kelompok Perlakuan 1 (KE1)
: dosis 500 ppm
Kelompok Perlakuan 2 (KE2)
: dosis 250 ppm
Kelompok Perlakuan 3 (KE3)
: dosis 125 ppm
Kelompok Perlakuan 4 (KE4)
: dosis 62,5 ppm
Kelompok Perlakuan 5 (KE5)
: dosis 31,25 ppm
Kelompok Perlakuan 6 (KKN)
: Sel tanpa perlakuan
Kelompok Perlakuan 7 (KN)
: DMSO 0,1%
Kelompok Perlakuan 8 (KKP)
: Doxorubisin 5 ppm
Dilakukan pengulangan masing-masing triplo untuk
berbagai konsentrasi, termasuk kontrol negatif (kontrol pelarut)
dan kontrol positif, dengan volume akhir 100 μL/well.
Mikroplate diinkubasi kembali selama 48 jam pada 37°C dalam
inkubator dengan kelembabkan 5% CO2. , masing-masing well
ditambahkan 10 μL reagen MTT (5 mg /mL).
Diinkubasi pada suhu 37°C selama 4 jam. Terjadi
perubahan warna kuning menjadi ungu terbantuk kristal
formazan. Jika sudah terbentuk kristal formazan tambahkan
dengan SDS 10%. Plate dibungkus dan diinkubasi selama 24
jam. Kristal formazon dilarutkan dengan etanol 96% dan
kamudian
di
ukur
dengan
ELISA
(Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) reader pada panjang gelombang 595 nm.
Setelah itu lakukan perhitungan hasil dan menghitung
penghambatan sampel ( % inhibisi) dengan rumus :
% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 =
𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝑥 100%
𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
3.5.8.4 Apoptosis
Sel MCF-7 ditanam pada coverslips yang dimasukan
dalam microplate 24 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 3 X
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
37
104 sel/sumuran dan diinkubasi sampai 50-60% konfluen.
Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24, 48, 72
jam. Medium diambil, dicuci dengan PBS. Cover slip yang
memuat sel diangkat, diletakan di atas object glass dan
ditambahkan 10 μL 1 X Working Solution etidium bromidaakridin oranye kemudian didiamkan selama 5 menit. Sel segera
diamati di bawah mikroskop flouresens (Zeiss MC 80). Sel
hidup berfluoresensi hijau (dengan akridin orange) dan sel mati
berfluoresensi orange (dengan etidium bromida). (Gow-Chin
Yen, 2017).
3.5.8.5 Perhitungan Persen Inhibisi
Dengan
metode
MTT
3-[4,5-dimetilthiazol-2yl]-2,5-
difeniltetrazolium bromide , selisih absorbansi kontrol negatif
dengan absorbansi sampel uji dibagi absorbansi kontrol negatif
dikali dengan 100% merupakan perhitungan untuk mendapatkan
presentasi kematian sel. Perhitungan kematian sel (Zakaria,
2011)
% Penghambatan Proliferasi = (
𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝑠𝑒𝑟𝑎𝑝𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖
𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
) 𝑥 100%
3.5.8.6 Analisa Data
Hasil yang diperoleh dari pengukuran serapan sampel
dianalisis menggunakan persamaan regresi linier. Persamaan
regresi
linier
(y=a+bx)
menggunakan
hubungan
antara
konsentrasi dengan % inhibisi. Kemudian dari hasil regresi linier
yang diperoleh dihitung IC50. Untuk mengetahui harga IC50
(Konsentrasi
daya
hambat
50%)
ditentukan
dengan
menggunakan persamaan regresi linier.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
38
3.5.9
Identifikasi Kandungan Senyawa Fraksi Kulit Buah Kasturi
(Mangifera casturi) dengan menggunakkan Gass Chomatography –
Mass Spectrocopy (GC-MS)
Fraksi aktif antioksidan kulit buah kasturi (Mangifera casturi)
dianalisis menggunakan Gas Chromatograpy–Mass Spectroscopy
(GC-MS) Shimadzu QP 5000. Sampel sebanyak 1 μL diinjeksikan ke
GC-MS yang dioperasikan menggunakan kolom kaca panjang 25 m,
diameter 0,25 mm dan ketebalan 0,25 μm dengan fasa diam CP-Sil
5CB dengan temperatur oven diprogram antara 70-270 °C dengan laju
kenaikan temperatur 10 °C/menit, gas pembawa Helium bertekanan
12 kPa, total laju 30 mL/menit dan split ratio sebesar 1:50.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Amelia, P. (2011). Isolasi , elusidasi struktur dan uji aktivitas antioksidan
senyawa kimia dari daun Garcinia benthami Pierre. 2–3.
Andriyani S. 2013. Upaya konservasi kasturi (Mangifera casturi), Badan
penelitian
dan
pengembangan
kehutanan,
bogor,
http://forplan.or.id/images/File/Apforgen/flyer/2010/kasturi.pdf[3desember
2017].
Apak R, Kubilai GI, Zyrek M, Karademir SE. 2013. “Novel total antioxidant
capacity index for dietary poliphenols and vitamin C ang E, using their
cupric ion reducing in the presence neocuproine: cuprac method”. J Agric
Food
Ari, K., & Darmapatni, G. (2016). Pengembangan Metode Gc-Ms Untuk
Penetapan Kadar Acetaminophen Pada Spesimen Rambut Manusia. Jurnal
Biosains Pascasarjana Vol. 18 (2016) Pp ©, 18(3), 1–13.
Benzie IFF, Strain JJ. 1996. “The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a
measure of Antioxidant Power: the FRAP assay”. Analitical Biochemistry
239. Academic in Pr
Chung, H.S. dan Woo, W.S., 2001. A quinolone alkaloid with antioxidant activity
from the aleurone layer of anthocyanin-pigmented rice. Journal of natural
products, 64: 1579–1580.
Comşa, Ş., Cîmpean, A. M., & Raica, M. (2015). The story of MCF-7 breast
cancer cell line: 40 Years of experience in research. Anticancer Research,
35(6), 3147–3154.
CRCC (Community College Research Center). 2009. Prosedur Tetap Uji
Sitotoksik Metode MTT. Yogyakarta: Fakultas Farmasi, UGM.
Davey, Patrick. (2005). At A Glance Medicine. Jakarta: Erlangga
De Beer, D., Harbertson, J. F., Kilmartin, P. A., Roginsky, V., Barsukova, T.,
Adams, D. O., & Waterhouse, A. L. (2004). Phenolics: A comparison of diverse
analytical methods. American Journal of Enology and Viticulture, 55(4), 389–
400.
39
40
Depamede, S.N Rosyidi, A. 2009. Penghambatan Proliferasi Limfosit Mencit
Balb/C oleh Ekstrak Testis Sapi Bali : Peran TGF-β. Media Peternaka.
32(2): 95-103
DiPiro JT, Talbert RL, Yee GC, Matzke GR, Wells BG, Posey LM. 2009.
Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach 7th Ed. United States
(US): McGraw-Hill Companies
Farmakope Indonesia edisi IV tahun (1995). Departemen Kesehatan Republik
Indonesia. Jakarta.
Freshney, R.I. 2010. Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique and
Specialized Application 6th Edition. New Jersey: John Wiley & Sons
Gawlik-Dziki, U., Świeca, M., Sułkowski, M., Dziki, D., Baraniak, B., & Czyz, J.
(2013). Antioxidant and anticancer activities of Chenopodium quinoa leaves
extracts - In vitro study. Food and Chemical Toxicology, 57, 154–160.
https://doi.org/10.1016/j.fct.2013.03.023
Hamdani., R. A. Seprima., Suranto dan D. Wiranda. 2009. Laporan Praktek Kerja
Lapangan Pengolahan Teh. Universitas Sumatera Utara Press. Medan.
Hanani, E. 2015. Analisis Fitokimia. Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
Hery Winarsi. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta:
Kanisius. Hal. 189-90
Irawan, B., 2010. Peningkatan Mutu Minyak Nilam dengan Ekstraksi dan
Destilasi pada Berbagai Komposisi Pelarut, Tesis, Universitas Diponegoro,
Semarang, Indonesia
Khairiah, K., Taufiqurrahman, I., & Putri, D. K. T. (2018). Antioxidant activity
test of ethyl acetate fraction of binjai (Mangifera Caesia) leaf ethanol
extract. Dental Journal (Majalah Kedokteran Gigi), 51(4), 164.
https://doi.org/10.20473/j.djmkg.v51.i4.p164-168
Kosir, M.A. 2015. Breast Cancer, USA: Merck. Diakses melalui :
http://www.merckmanuals.com/professional/gynecologyandobstetrics/breast
disorders/breastcancer (Accessed 12 November 2018)
Kumar, M. K., Nagaraju, K., Satyabrata, B., & Sudhakar, M. (2014). Formulation
and Evaluation of Sublingual Tablets of Terazosin Hydro- Chloride.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
41
International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 5(10),
4117–4128. https://doi.org/10.13040/IJPSR.0975-8232.5(10).4117-28
Kristanti, A. N., N. S. Aminah, M. Tanjung, dan B. Kurniadi. 2008. Buku Ajar
Fitokimia. Surabaya: Airlangga University Press. Hal. 23, 47.
Lauricella, M., Galbo, V. Lo, Cernigliaro, C., Maggio, A., Piccionello, A. P.,
Calvaruso, G., … D’Anneo, A. (2019). The anti-cancer effect of mangifera
indica L. Peel extract is associated to γH2Ax-mediated apoptosis in colon
cancer cells. Antioxidants, 8(10). https://doi.org/10.3390/antiox8100422
Macabeo, A. P. G., Krohn, K., Gehle, D., Read, R. W., Brophy, J. J., Franzblau, S.
G., & Aguinaldo, M. A. M. (2008). Activity of the extracts and indole
alkaloids from Alstonia scholaris against Mycobacterium tuberculosis
H37Rv. Philippine Agricultural Scientist, 91(3), 348–351.
Ministry of Health Republic of Indonesia. (2015). Data and information on cancer
situation (Data dan Informasi Kesehatan Situasi Penyakit Kanker). Buletin
Kanker, 1(1), 1–5. https://doi.org/10.1007/s13398-014-0173-7.2
Molyneux P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl
(DPPH) for estimating anti-oxidant activity. Songklanakarin Journal of
Science and Technology, 26(May), 211–219.
Mongkolsilp, S., Pongbupakit, I., Sae-lee, N., Sitthithaworn, W. 2004. Radical
Scavenging activity and total phenolic content of medical plants used in
primary health care. Jurnal of Pharmacy and Science. 9(1) :32-35.
Mukhriani. 2011 “Ekstraksi, pemisahan senyawa, dan identifikasi senyawa aktif,”
UIN Allaudin Press. Medan.
Munawaroh, R., Siswadi, S., Setyowati, E. P., Murwanti, R., & Hertiani, T.
(2018). Correlation Between Total Flavonoid Contents and Macrophage
Phagocytosis Activity of Fractions From Faloak (Sterculia quadrifida R.Br.)
Barks Ethanolic Extract In Vitro. Majalah Obat Tradisional, 23(1), 47.
https://doi.org/10.22146/mot.30882
Mutiasari, IR. 2012. Identifikasi Golongan Senyawa Kimia Fraksi Aktif, Journal.
Jakarta: FMIPA-UI
Ningsih, D. R. (2017). EKSTRAK DAUN MANGGA (Mangifera indica L.)
SEBAGAI ANTIJAMUR TERHADAP JAMUR Candida albicans DAN
IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWANYA. Jurnal Kimia Riset, 2(1),
61. https://doi.org/10.20473/jkr.v2i1.3690
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
42
Nugrahani, R., Andayani, Y., & Hakim, A. (2016). SKRINING FITOKIMIA
DARI EKSTRAK BUAH BUNCIS (Phaseolus vulgaris L) DALAM
SEDIAAN SERBUK. Jurnal Penelitian Pendidikan IPA, 2(1).
https://doi.org/10.29303/jppipa.v2i1.38
Oliveira, L. M. B., Bevilaqua, C. M. L., Costa, C. T. C., Macedo, I. T. F., Barros,
R. S., Rodrigues, A. C. M., … Navarro, A. M. C. (2009). Anthelmintic
activity of Cocos nucifera L. against sheep gastrointestinal nematodes.
Veterinary
Parasitology,
159(1),
55–59.
https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2008.10.018
Patra, A. K., & Saxena, J. (2009). The effect and mode of action of saponins on
the microbial populations and fermentation in the rumen and ruminant
production.
Nutrition
Research
Reviews,
22(2),
204–219.
https://doi.org/10.1017/S0954422409990163
Radji, Maksum. 2016. Mekanisme Aksi Molekuler Antibiotik dan Kemoterapi.
Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC
Rahman, N., Bahriul, P., & Diah, A. (2014). Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak
Daun Salam (Syzygium Polyanthum) Dengan Menggunanakan 1,1-Difenil2-Pikrilhidrazil. Jurnal Akademika Kimia, 3(3), 143–149.
Rashedy, A. A., Kheshin, M. A. El, Allatif, A. M. A., & Besinnara, H. (2014).
Histological Parameters Related to Dwarfism in Some Mango Cultivars.
World
Journal
of
Agricultural
Sciences,
10(5),
216–222.
https://doi.org/10.5829/idosi.wjas.2014.10.5.1826
Rasjidi, I. 2010. Epiemiologi Kanker Pada Wanita. Jakarta: Sagung Seto
Rosyidah, K., Nurmuhaimina, S. A., Komari, N., & Astuti, M. D. (2012).
AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI SAPONIN DARI KULIT BATANG
TUMBUHAN KASTURI (Mangifera casturi). Alchemy, 1(2), 65–69.
https://doi.org/10.18860/al.v0i0.1674
Ryan, M., Rahardhian, R., Utami, D., Farmasi, P. S., Farmasi, F., Ahmad, U., &
Yogyakarta, D. (1999). UJI SITOTOKSIK DAN ANTIPROLIFERASI
EKSTRAK ETER DAUN BINAHONG ( A ndredera cordifolia ( Tenore )
Steen .) TERHADAP SEL HeLa. 13(1), 1284–1292.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
43
Sarker SD, Latif Z, & Gray AI. 2006. Natural products isolation. In: Sarker SD,
Latif Z, & Gray AI, editors. Natural Products Isolation. 2nd ed. Totowa
(New Jersey). Humana Press Inc. hal. 6-10, 18.
Sayuti, K. (n.d.). Antioksidan, Alami dan Sintetik, 2015;(1)7-29.
Seidel V. Initial and ulkextraction. In: Sarker SD, Latif Z & Gray Al, editors.
2006. Natural product Isolation, 2nd ed. Totowa (Ney Jersey). Humana
Press Inc. hal. 31-5
Senet, M. R. M., Raharja, I. G. M. A. P., Darma, I. K. T., Prastakarini, K. T.,
Dewi, N. M. A., & Parwata, I. M. O. A. (2018). PENENTUAN
KANDUNGAN TOTAL FLAVONOID DAN TOTAL FENOL DARI
AKAR KERSEN (Mutingia calabura) SERTA AKTIVITASNYA
SEBAGAI
ANTIOKSIDAN.
Jurnal
Kimia,
13.
https://doi.org/10.24843/jchem.2018.v12.i01.p03
Septiana, E., Bustanussalam, B., Rachman, F., Hapsari, Y., & Simanjuntak, P.
(2017). Potensi Ekstrak Kapang Endofit Asal Rimpang Kunyit Sebagai
Antimalaria dan Antioksidan. Jurnal Kefarmasian Indonesia, 7(1).
https://doi.org/10.22435/jki.v7i1.5669.1-9
Shaban, A. E. A. (2009). Vegetative Growth Cycles of Some Mango Cultivars in
Relation to Flowering and Fruiting. 5(6), 751–759.
Simon K, Kerry B.(2000) Principles and Pracice of Phytotheraphy. Modern
Herbal Medicine. New York: Churchill Livingstone
Singh, J., & Basu, P. S. (2012). Non-Nutritive Bioactive Compounds in Pulses
and Their Impact on Human Health: An Overview. Food and Nutrition
Sciences, 03(12), 1664–1672. https://doi.org/10.4236/fns.2012.312218
Sirait, P. S., & Setyaningsih, I. (2019). Aktivitas Antikanker Ekstrak Sprirulina
yang Dikultur Pada Media Walne dan Media Organik. Jphpi, 22, 50–59.
Sogandi, S. & Klustiana, D. (2018). Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak dan Fraksi
Kulit Buah Mangga Kasturi (Mangifera casturi Kosterm) Terhadap bakteri
Listeria monocytogenes DNA Salmonella typhi. Universitas 17 Agustus 1945
Jakarta
Sukandar, D., Hermanto, S., & Lestari, E. (2008). Uji Toksisitas Ekstrak Daun
Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius Roxb.) Dengan Metode Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT). Jurnal Kimia VALENSI, 1(2).
https://doi.org/10.15408/jkv.v1i2.217
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
44
Sunaryati, S.S. 2011. 14 Penyakit Paling Sering Menyerang dan Mematikan.
Jogjakarta: Flash Books
Stanković, M. (2011). Total phenolic content, flavonoid concentration and
antioxidant activity of Marrubium peregrinum L. extracts. Kragujevac
Journal of Science, (33), 63–72.
Stopeck AT. 2014. Breast Cancer Risk Factors. Arizona. Medscape. Tersedia dari
http://emedicine,medscape.com.
Sutomo, S., Azhari, H., Arnida, A., Fadlilaturrahmah, F., & Yunus, R. (2017).
Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Antioksidan Dari Buah Kasturi (Mangifera
casturi
Kosterm.).
Jurnal
Pharmascience,
4(2).
https://doi.org/10.20527/jps.v4i2.5778
Syafni, N., Putra, D. P., & Arbain, D. (2012). 3,4-dihydroxybenzoic acid and 3,4dihydroxybenzaldehyde from the fern Trichomanes chinense L.; isolation,
antimicrobial and antioxidant properties. Indonesian Journal of Chemistry,
12(3), 273–278. https://doi.org/10.22146/ijc.21342
Tanaya, V., Retnowati, R., & Suratmo. (2015). Fraksi semi polar dari daun
mangga kasturi (Mangifera casturi Kosterm). Kimia Journal, 1(1), 778–784.
Tulus Tambunan, 2003. Perkembangan Sektor Pertanian di Indoneisa, Beberapa
Isu Penting. Ghalia Indonesia Jakarta.
Vincken JP, Heng L, de Groot A, Gruppen H (2007) Saponins, classification and
occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry 68:275–297
Werdhasari, A. (2014). Peran Antioksidan Bagi Kesehatan. Indonesian Journal of
Biotechnology
Medicine,
3(2),
59–68.
https://doi.org/10.22435/jbmi.v3i2.4203.59-68
Widiyati, E. (2006). Penentuan Adanya Senyawa Triterpenoid Dan Uji Aktivitas
Biologis Pada Beberapa Spesies Tanaman Obat Tradisional Masyarakat
Pedesaan Bengkulu. Jurnal Gradien, 2(1), 116–122.
Widjaya, C. H. (2014). Peran Antioksidan Terhadap Kesehatan Tubuh. Healty
Choice: Edisi IV
Wijayakusuma, H. 2008. Atasi Kanker dengan Tanaman Obat. Jakarta : puspa
Swara.
Yadavalli, R., Ratnapuram, H., Motamarry, S., & Fathima, M. N. (2019).
Department of Biotechnology. The Grants Register 2019, 284–284.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
45
https://doi.org/10.1007/978-1-349-95810-8_400
Yen, G. C., Chen, C. S., Chang, W. T., Wu, M. F., Cheng, F. T., Shiau, D. K., &
Hsu, C. L. (2018). Antioxidant activity and anticancer effect of ethanolic and
aqueous extracts of the roots of Ficus beecheyana and their phenolic
components. Journal of Food and Drug Analysis, 26(1), 182–192.
https://doi.org/10.1016/j.jfda.2017.02.002
Yudissanta, A., & Ratna, M. (2012). Analisis Pemakaian Kemoterapi pada Kasus
Kanker Payudara dengan Menggunakan Metode. Sains Dan Seni Its, 1(1).
Retrieved
from
https://media.neliti.com/media/publications/15866-IDanalisis-pemakaian-kemoterapi-pada-kasus-kanker-payudara-denganmenggunakan-meto.pdf
Zakaria, Z. A., Mohamed, A. M., Jamil, N. S. M., Somchit, M. N., Zuraini, A.,
Rofiee, M. S., … Sulaiman, M. R. (2011). In vitro cytotoxic and antioxidant
properties of the aqueous, chloroform and methanol extracts of dicranopteris
linearis leaves. African Journal of Biotechnology, 10(2), 273–282.
https://doi.org/10.5897/AJB10.423
Zempieri, L., et al. 2002, Differential Modulation by Estradiol of P-glycoprotein
Drug Resistance Protein Expression in Cultured MCF7 dan T47D Breast
Cancer Cells. Anticancer Res.
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
46
Lampiran 1. Skema Prosedur Kerja
Determinasi
Ekstraksi Kulit Buah
Mangga Kasturi
(Mangifera casturi)
Fraksinasi
(Metanol, n-heksan,
etil asetat)
Skrining Fitokimia
Total Kandungan Fenol
&
Total Kandungan
Flavonoid
Uji aktivitas
Antioksidan
(DPPH)
Proliferasi dengan
metode MTT Assay (3[4,5-dimetilthiazol-2yl]2,5-difeniltetrazolium
bromide.
Uji sitotoksisitas
Terhadap Sel Kanker
Payudara (MCF7)
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
47
Uji Apoptosis
Identifikasi Senyawa
menggunakkan Gass
Chomatography-Mass
Spectrocopys
Lampiran 2. Skema Uji Antioksidan Fraksi Kulit Buah Mangga Kasturi
(Mangifera casturi)
Pembuatan Larutan DPPH
(10 mg DPPH dilarutkan dalam 100
mL methanol p.a)
Uji Antioksidan dilakukan
dengan metode DPPH
Penetapan Panjang
Gelombang Maksimum DPPH
Pembuatan Larutan
Kontrol Positif
Vitamin C
Penyiapan Seri Larutan Uji
( 500; 250; 125; 62,5; 31,25;
15,625 ppm)
Fraksi n-heksan
Fraksi etil asetat
Pembuatan Larutan
Blanko
(0,5 mL DPPH + 1,5 mL
Methanol p.a)
Fraksi metanol
Ukur serapan larutan kontrol
positif, larutan uji, dan larutan
blanko pada panjang gelombang
maksimum DPPH
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
48
Analisis data
% inhibisi
Nilai IC50
Lampiran 3. Skema Uji Proliferasi dengan MTT
Sel Kanker Payudara
MCF7 koleksi Pusat
Studi Primata, Bogor
Dihangatkan
dengan waterbath
suhu 37°C
Kultur pada medium DMEM.
Inkubasi pada inkubator CO2 5%.
Dengan suhu 37°C selama 24 jam.
Amati dengan
mikroskop
pertumbuhan
kultur sel
Buang media kemudian bilas
plat dengan menggunakan PBS
Beri larutan uji
dengan konsentreasi
(500; 250; 125; 62,5;
31,25; 15,625 ppm)
Kontrol Negatif
(DMSO 0,1%)
Kontrol Positif
(Doxorubicin)
Sel
Normal
Dilakukan 3 kali pengulangan (triplo)
Inkubasi kembali selama 48 jam
pada suhu 37°C dalam inkubator .
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
49
Diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37°C
Ditambah 10µL reagen MTT pada
masing masing well
Terbentuk kristal
formazon.
Tambah SDS 10%
Pembacaan Absorbansi pada
Elisa Reader
Persen Inhibisi
Larutkan kristal
dengan etanol 96%
IC50
Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta
Download
Random flashcards
Rekening Agen Resmi De Nature Indonesia

9 Cards denaturerumahsehat

sport and healty

2 Cards Nova Aulia Rahman

Secuplik Kuliner Sepanjang Danau Babakan

2 Cards oauth2_google_2e219703-8a29-4353-9cf2-b8dae956302e

Card

2 Cards

Create flashcards