PENDAHULUAN

ANTIOKSIDAN SENYAWA BARU DARI GUAIAKOL
DENGAN BIOKATALIS ENZIM LAKTASE JAMUR TIRAM PUTIH
(Pleurotus ostreatus)
A. Herry Cahyana1, Niken Wulandari2
ABSTRACT
Natural products consist of plant phenolic compounds and
have recently attracted special interest become they provide as
source of biological active compounds in acting as natural antioxidant.
In the course of screening for the new natural compounds having of
antioxidant activity, we have modified a new type of antioxidant
starting from phenolic structure, guaiacol. Crude laccase extracted
from edible Indonesian local mushroom (Pleurotus ostreatus)
performed reaction that catalyzed the oxidative coupling of aromatic
compound guaiacol. Spectroscopic evidence showed that guaiacol
dimer were linked through the ring performed biphenyl C-C dimer,
4,4'-biguaiacol. The new compound exhibited antioxidant activity
higher than those of original guaiacol, as measured by ^-carotene
bleaching method.
Keywords: antioxidant; laccase, mushroom (Pleurotus ostreatus),
guaiacol, dimerization.
PENDAHULUAN
Ensim lakase (Laccase) adalah ensim yang diketahui dapat
mengkatalisis suatu reaksi oksidasi dari senyawa yang bersifat
reduktor dan sekaligus terjadi bersamaan dengan tereduksinya 0 2
Ensim ini pada awalnya diketahui untuk mendegradasi komponen
lignin, dan mudah ditemukan dalam jamur. Penelitian lanjut
mengemukakan bahwa selain bersifat degradatif, lakase mempunyai
karaktekdapat mengkatalisis reaksi oksidatif sekaligus (Wang, 2004).
Fenomena ini dapat dimanfaatkan antara lain dalam teknologi
pangan yaitu untuk meningkatkan mutu sifat alir tepung wheat karena
1
2
Dosen Jurusan Kima F-MIPA Ul dan Dosen Tidak Tetap UPH
Alumni Jurusan Kima F-MIPA Ul
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
13
enzim ini dapat mengoksidasi komponen asam ferulat , bagian dari
arabinoxylan yang larut air, detoksifikasi limbah (Bollag, 2003), dan
pembuatan polimer (Uyama, 2002).
02
H20
Lakase
Lakase(0x)
Substrates)
Substrat
Gambar 1. Sifat katalitik enzim lakase
Karena kapasitas tersebut maka lakase menarik untuk diteliti
lanjut, yang berkaitan dengan penerapannya dalam menggunakan
senyawa organik fenolik sebagai substratnya secara tidak langsung.
Diketahui bahwa senyawa fenolik mempunyai sifat reduktor karena
kemudahannya menymbangkan proton dari gugus alkohol yang
dimiliknya. Fenomena ini bila dikaitkan dengan sifat antioksidan suatu
senyawa apapun yang berbasis struktur fenolik dapat dikaji lanjut
terhadap perubahan kapasitas antioksidannya.
Tujuan penelitian ini adalah identifikasi senyawa antikosidan
dari hasil reaksi guaiakol yang dikatalisis oleh enzim lakase dari
jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus).
METODOLOGI
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah jamur tiram putih yang
diperoleh dari pasar lokal di Jakarta kromatografi lapis tipis (Merck),
Folin Ciocalteau (Merck), larutan buffer pH 6,0, (NH 4 ) 2 S0 4 , dan
bahan kimia bmnya kualitas pro-analisis. Alat yang digunakan adalah
14
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
spektrofotometri UV-Vis, Infrared
spektrometri massa (GC-MS).
(IR)
dan
kromatografi
gas
Metode Penelitian
Isolasi Enzim kasar lakase
Isolasi enzim kasar lakase dilakukan sesuai dengan prosedur
(Hernandez et al, 2001) dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 500
gram jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) ditambahkan sedikit air,
dihancurkan dengan cara diblender. Kemudian dicampurkan dengan
buffer fosfat pH 6,0 dalam keadaan dingin, dan homogenat disaring,
filtrat yang diperoleh kemudian disentrifugasi.Filtrat yang diperoleh
ditambahkan dengan (NH4)2S04, endapan yang terjadi diambil dan
diencerkan kembali kedalam bufernya. Aktivitas enzim dilakukan
secara spektrofotometri dengan menggunakan metode katekol dan
kadar protein enzim dilakukan dengan metode Lowry dan Folin
Ciocalteau. Aktivitas spesifik diukur dengan metode Worthington
Manual Enzyme yang dimodifikasi.
Reaksi pembentukan senyawa baru
Reaksi pembentukan senyawa antioksidan dilakukan dengan
pencampuran langsung antara enzim lakase dengan guaiakol, produk
yang diperoleh diekstrak dengan etil asetat.dianalisis awal dengan
KLT (kromatografi lapi s tipis) dan dimumikan dengan kolom
kromatografi.
Identifikasi dengan instrumentasi.
Identifikasi hasil isolasi dilakukan dengan instrumetasi UV-Vis, IR
(Infra Red) dan GC-MS (kromatografi gas - spektrometri massa).
Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode (3-carotene
bleaching (Kulisic, 2004) dengan sedikit modifikasi. Ditimbang 25 mg
P-carotene dilarutkan dalam 5 ml_ kloroform. Kedalam 100 mL
campuran kloroform-etanol (3:7) ini ditambahkan 3 mL larutan BJumal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
15
carotene dan 50 mg asam linoleat. Campuran tersebut diambil
sebanyak 5 ml_ dan dimasukkan ke dalam botol vial, ditambahkan
sampel guaiakol dan senyawa uji sebanyak 2 mL dengan variasi
konsentrasi 0,05, 0,1, 0,15 dan 0,20 mg/mL, dan sebagai kontrol
hanya ditambahkan kloroform, BHT dan BHA digunakan sebagai
pembanding. Botol vial yang berisi campuran tersebut diinkubasi
dalam oven pada suhu 60°C selama 6 hari. Setiap hari sampel diukur
nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 456 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas enzim lakase
Perlakuan ekstraksi dilakukan untuk memperoleh enzim lakase
secara kasar, dan diketahui jamur tiram putih ( Pleurotus ostreatus)
mengandung enzim lakase yang ditunjukkan dengan uji katekol
sebagai substratnya. Reaksi ini dipantau secara spektrometrik karena
menghasilkan produk berwama, dan dari hasil perhitungan diketahui
ekstrak kasar lakase mempunyai aktivitas spesifik sebesar 15,02
U/mg. Nilai ini selanjutnya diujicobakan apakah mampu sebagai
biokatalis pembentukan senyawa baru dengan substrat guaiakol.
Dari hasil pencampuran ekstrak kasar enzim lakase dengan
substrat guaiakol dapat diperoleh massa yang berwama kemerahan
yang mempunyai tingkat kelarutan yang rendah yang ditunjukkan
adanya kekeruhan. Hal yang sama pernah dilakukan dalam penelitian
sebelumnya bahwa enzim yang lain yaitu peroksidase dari sawi hijau
(Brassica juncea) menghasilkan kemampuanh yang sama. Dari data
ini dapat dipertimbangkan bahwa lakase menurut kemampuannya
merupakan salah salah enzim dengan kemampuan mendegradasi
senyawa organik (Podzdnyakova,2004), tetapi pada sisi yang lain
menunjukkan kemampuan yang berbeda, hal ini menarik untuk diteliti
lanjut bahwa kemampuan ini terlihat mirip dengan enzim peroksidase,
tetapi tidak
membutuhkan substrat H 2 0 2 (D'Acunzo,2002).
1R
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
Selanjutnya produk kemerahan tersebut diekstrak dengan etil asetat,
dipekatkan, dengan menguapkan pelarut etil asetat menggunakan
rotatory evaporator. Ekstrak pekat yang diperoleh dianalisis dengan
KLT silika gel, dengan eluen n - heksana : etil asetat (5:2) dengan
hasil seperti Gambar 2.
• o
Gambar 2. Analisis dengan KLT hasil reaksi
Gambar diatas menunjukkan bahwa berdasarkan hasil KLT dari hasil
reaksi menunjukkan adanya empat spot yang berwama coklat
seperti gambar KLT pada sisi kanan, dibandingkan dengan sisi kiri
adalah guaiakol. Spot-spot tersebut adalah indikasi adanya
komponen-komponen yang terbentuk dari guaiakol oleh enzim
lakase, membentuk senyawa yang kurang polar yang ditandai oleh
nilai Rf yang lebih rendah serta timbulnya warna kemerahan. Untuk
mengetahui lebih lanjut terhadap komponen yang terbentuk tersebut,
selanjutnya dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom silika
gel yang bertujuan untuk memurnikannya. Dari hasil pemurnian
diperoleh satu isolat berupa
kristal jarum coklat keputihan.
Selanjutnya untuk mengetahui struktur kimiawi hasil isolat dilakukan
pengukuran dengan menggunakan alat instrumentasi UV, IR, dan
GC-MS.
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
17
Identifikasi senyawa baru secara spektrometri
Identifikasi dilakukan dengan UV-Vis menunjukkan daerah spektrum
UV antara 200 - 400 nm, diperoleh nilai A max dari guaiakol sebesar
285 nm dan A max dari senyawa baru sebesar 293 nm, seperti terlihat
pada gambar 3 adanya pergeseran serapan ke sebelah kanan. Hal
ini menunjukkan bahwa telah terjadi perubahan yang ditandai
dengan terjadinya pergeseran kimia ke arah panjang gelombang
yang lebih besar (efek batokromik) dan juga adanya kenaikan
intensitas warna yang lebih kuat. Perubahan ini disebabkan oleh
pembentukan kromofor baru yaitu ikatan tak jenuh dari cincin berizen
yang terkonjugasi membentuk sistem diena yang cukup dan
mengakibatkan terjadinya pergeseran kimia ke panjang gelombang
yang lebirvbesar bial dibandingkan dengan guaiakol.
R ;
5
SB
ft
>'• ,'iM
\
v.
••
K
'83.6
CURS0 R« |
•
4S«.e
5 19
. S U M
5»8.0
"
m,i
I , 7 6 6 ft b ;;
Gambar 3. Spetra UV-Vis senyawa hasil reaksi
Identifikasi lanjut dengan spektrofotometri inframerah (IR)
yang bertujuan untuk penentuan gugus-gugus fungsi, menunjukkan
adanya gugus -OH : 3503 - 3407 cm"1; =C-H benzena :3055 - 3090
cm"1 ;C=C :1453 -1443 cm"1; C-O-C : 1219 -1211 cm"1; C-O dari COH :1027 - 1018 cm"1 dan benzena dengan 2-3 tersubstitusi : 740 841 cm"1 dari senyawa yang terisolasi. Dari data ini dimungkinkan
bahwa struktur guaiakol sebagai substrat telah mengalami perubahan
dengan adanya pergeseran nilai gugus-gus fungsi tersebut.
Identifikasi selanjutnya dilakukan dengan kromatografi gas untuk
18
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
mengetahui massa relatifnya. Dari kromatogram diketahui adanya
puncak paling tinggi memiliki waktu retensi sebesar 19,57 menit
dengan luas area sebesar 92,96% seperti Gambar 4.
"VW,
8000
:so
: »tS?J
>A?:L^
UJi-ndJince
4?
*1*:CS0:
«o
soa
: 3 , I ' -}-jpj:*nyl ' - -i. S *
rfi;>n
. •<»
•, s ' -<:!<:«*•?-Z22
,^'-xv- us,—a
^CA
I
L,
r 't
'
£l
60
»_|
^1_^J
L._L_i
, „ . , w | ,•• V . r v l . , •, K r r + r
I
Gambar 4. Kromatogram analisis GC-MS isolat senyawa baru.
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
19
Dari data di atas terlihat adanya nilai m/z = 246, dan hasil
konfirmasi lanjut dengan membandingkan nilai m/z tersebut dengan
standar yang ada, dengan tingkat kemiripan 9 1 % diketahui bahwa
senyawa baru hasil biokatalisis menggunakan enzim lakase tersebut
mempunyai struktur 4,4'-Biguaiakol, merupakan suatu senyawa hasil
reaksi penggabungan molekul awal guaiakol pada posisi para-para
sepert iilustrasi dibawah ini. Penggabungan ini dimungkinkan karena
suatu senyawa fenolik yang mengalami perubahan secara radikal
oleh aksi enzim lakase, akan mengalami penataan-ulang yang
difasilitasi oleh struktur aromatiknya, menyebabkan kestabilan akan
terjadi para posisi para-para yang bergabung untuk saling
menstabilkan, sehingga terbentuk senyawa baru.
Gambar 5. Senyawa 4.4'-biguaiakol
Perubahan struktur yang terjadi selanjutnya diuji aktivitas
antioksidannya dengan menggunakan fi-carotene bleaching, dan
menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi yang ditambahkan
dapat meningkatkan kapasitas antioksidannya, yang ditunjukkan
dengan semakin menghambat tingkat pemucatan warna kekuningan
larutan sampel uji. Senyawa baru, 4,4'-biguaiakol mempunyai
kapasitas antioksidan lebih baik dibandingkan dengan guaiakol, hal
ini mengindikasikan bahwa perubahan struktur tersebut dapat
meningkatkan
kemampuan
sebagai
antioksidan.
Kapasitas
antioksidan senyawa ini memperlihatkan pula adanya kesetaraan
bila dibandingkan dengan sintetik dan natural antioksidan seperti
BHT.BHA dan a-tokoferol seperti terlihat dalam Gambar 6.
20
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
Aktivitas antioksidan senyawa hasil reaksi
berbagai konsentrasi
0,2
0,15
A 0,1
0,05
0
3
i - • - Kontrol
I - * - 0 , 1 5 mg/mL
Hari
0,05 mg/mL
0,20 mg/mL
4
5
6
0,10 mg/mL
Aktivitas antioksidan
0
1
2
3 Harj 4
5
6
•-Kontroi
-± Tokoferol 0.20mg/mL
-X- BHT 0.20 mg/mL
~*~ Guaiakol 0,20 mg/mL
-•-Hasil reaksi 0,20 mg/mL
Gambar 6. Aktivitas antioksidan dengan metode fi-carotene
bleaching
KESIMPULAN
Dari penelitian diatas dapat disimpulkan bahwa jamur tiram
putih (Pleurotus ostreatus) mengandung enzim /a/case yang mampu
menggunakan senyawa fenolik guaiakol sebagai substratnya dan
menghasilkan senyawa berupa kristal jarum kemerahan dan dan
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006
21
hasil uji spektroskopik dan GC-MS diketahui sebagai senyawa 4,4'biguaiakol, yaitu bentuk dimer guaiakol melalui reaksi oksidasi
kopling. Perubahan struktur guaiakol menjadi 4,4'-biguaiakol dapat
meningkatkan kapasitas antioksidan yang diduga berkorelasi dengan
penambahan gugus hidroksil serta kenaikan konjugasi dimer yang
terfasilitasi dalam cincin dimernya.
DAFTAR PUSTAKA
Bollag, J.M, Sjoblad, R.D. 2003. Oxidation Coupling of Aromatik
Pesticide Intermediates by Fungal Phenol Oxidases, 1977,
J.App.Environt. Microb., p:906-910.
D'Acunzo, F, Gall, O, Masci, B. 2002. Oxidation of Phenols by
Laccase and Laccase- mediator Systems, Eur. J. Biochem.,
269, p: 5330-5335.
Kulisic T., Radonic R. 2004. Use of Different Methods for Testing
Antioxidative Activity of Oregano Essential Oils, Food Chem.,
85, p:633-640.
Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical
Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant
Activity, J. Sci. Techno!., 26(2), p: 211-219.
Podzdnyakova, N.N., Nowak, J. R., Turkovskaya, O.V. 2004.
Catalytic Properties of Yellow Laccase from Pleuratus
ostreatus D1, Journal Molecule. Catalysis Enzymatic, 30, P:
19-24.
Uyama, H and Kobayashi, S. 2002.
Enzyme-Catalyzed
Polymerization to Functional Polymers. Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic. 19, p: : 117-127.
Wang, H.X, Ng, T.B. 2004. A Novel Laccase with Fair Thermostability
from The Edible Wild Mushroom (Albatrella dispansus),
Biochem. Biophys Res., 319, p: 381-385.
22
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol. 4, No. 1, April 2006