IDENTIFIKASI FLAVONOIDA HASIL FRAKSINASI
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI IDENTIFIKASI FLAVONOIDA HASIL FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM VAKUM EKSTRAK METANOL-AIR HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Anita Devi Ariesnawati NIM : 038114057 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI “Being Aware of Ignorance is the First Step to Develop……” Dedicated to: Papa, Mama and Mas Aris… iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI INTISARI Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) dipercayai dapat mengobati sakit kuning (hepatitis), batu empedu, kencing batu, infeksi saluran kencing, batuk, sesak nafas, sariawan, radang tenggorokan, amandel, infeksi telinga tengah (Anonim, 2005). Dimungkinkan bahwa flavonoida berperan dalam mengatasi penyakit di atas. Anonim (2005) menyebutkan adanya kandungan flavonoida dalam pegagan embun yaitu hiperin. Penelitian ini diarahkan untuk menentukan golongan flavonoida lain yang ada dalam herba pegagan embun dan diharapkan hasil penelitian ini dapat memberi informasi tentang kandungan aktif senyawa obat alami Serbuk diekstraksi dengan metanol-air (9:1 dan 1:1) dan penyarian dilakukan dengan maserasi. Fraksinasi flavonoida dari ekstrak dilakukan dengan kromatografi kolom vakum. Fase diam yang digunakan adalah selulosa, sedangkan fase geraknya adalah BAW (4:1:5 v/v,fase atas). Pemeriksaan kandungan flavonoida dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fase diam dan fase gerak yang sama dengan yang digunakan pada kromatografi kolom. Deteksi bercak dilakukan dengan sinar ultraviolet λ 365 nm dan uap amonia. Identifikasi menggunakan KLT menghasilkan dua bercak yaitu ungu (Rf 0,86 yang selanjutnya disebut isolat flavonoida) dan biru (Rf 0,76). Isolasi bercak dilakukan dengan KLTP. Bercak ungu dikerok kemudian dilarutkan dalam metanol dan disaring, lalu diuji kemurniannya. Pemeriksaan kemurnian isolat flavonoida menggunakan kromatografi multi eluen yang menunjukkan bahwa isolat flavonoida sudah murni secra kromatografi. Pemeriksaan dilanjutkan menggunakan reaksi warna dan spektroskopi ultraviolet dengan penambahan pereaksi geser. Berdasarkan analisis data dari KLT, reaksi warna dan spektroskopi ultraviolet menunjukkan bahwa isolat flavonoida diduga mempunyai golongan flavon dengan kemungkinan struktur parsial 7,3’,4’ trihidroksi flavon atau 7,4’,5’ trihidroksi flavon. Kata kunci : flavonoida, kromatografi, spektroskopi, Hydrocotyle sibthorpioides. vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Pegagan embun (Hydrocotyle sbthorpioides. Lmk) is believed can cure hepatitis, kidney stone, urethra infection, cough, short winded, ulcer, throat inflammation, tonsil, middle chamber ear infection, (Anonym, 2005). It is possible that flavonoid plays important roles in curing such diseases. Anonym (2005) mentions that pegagan embun contains flavonoid, which is hyperin. This research is aimed at determining another type of flavonoid that exists in the pegagan embun herbs and it is hoped that the finding of the research will provide information to invent new medicine. Powder is extracted using methanol – water (9:1 and 1:1) and the extraction is done using maseration. Flavonoid fractionation from the extract is done using vacuum column chromatography. Stationer phase used is cellulose, while mobile phase is BAW (4:1:5 v/v, upper phase). The investigation of flavonoid content is done by employing thin layer chromatography (TLC) using stationer and mobile phase similar to what is used in the vacuum column chromatography. The spot detection is done using ultraviolet ray λ 365 nm and ammonia steam. Identification using TLC results two spots, they are purple ( Rf 0,86 which is called flavonoid isolate then) and blue (Rf 0,76). Spot isolation is done by using Preparative Thin Layer Chromatography (PTLC). The purple spot is scrapped and dissolved in the methanol and filtered, and then the genuineness is tested. The genuineness check up of flavonoid isolate is using multi eluen chromatography that indicates that flavonoid isolate is genuine in terms of chromatography. The check up continues with color reaction and ultraviolet spectroscopy with an addition of shift reagent. Based on the data analysis from TLC, color reaction and ultraviolet spectroscopy shows that flavonoid isolate has flavone type with the possibility partial structure 7,3’,4’ trihydroxy flavone or 7,4’,5’ trihydroxy flavone. Keywords: flavonoid, chromatography, spectroscopy, Hydrocotyle sibthorpioides. vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus yang telah memberikan limpahan kasih-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “Identifikasi Flavonoida Hasil Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Vakum Ekstrak Metanol-Air Herba Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.)”. Penyusunan skripsi ini dimaksudkan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam penyusunan dan menyelesaikan skripsi ini penulis telah banyak memperoleh bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah dengan sabar membimbing dan mengarahkan penulis baik pada penyusunan usulan penelitian, penelitian dan penyusunan skripsi ini. 3. Erna Tri Wulandari, M.Si. selaku dosen penguji yang memberikan masukan, kritik, dan saran dalam skripsi ini. 4. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Ketua Panitia Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma sekaligus dosen penguji yang banyak membantu serta memberikan masukan, kritik, dan saran dalam skripsi ini. viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5. Dr. Pudjono selaku dosen Farmasi Universitas Sanata Dharma yang memberikan bantuan dan masukan yang berharga. 6. Seluruh staf dan karyawan Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 7. Seluruh staf dan karyawan Laboratorium Kimia Analisis dan Kimia Analisis Instrumen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 8. Papa, Mama dan Mas Aris yang telah memberikan doanya, dukungan dan cinta sehingga memotivasi penulis dalam menyelesaikan studi dan skripsi ini. 9. Timur Pamenang dengan segala kesabarannya telah mendampingi dan banyak membantu dalam menyelesaikan skripsi ini. 10. Mbok Nah dan Yu Dhar, yang sudah setia menemani saya sejak sebelum saya lahir hingga sekarang. 11. My best friends, Komang, Ocha, Titien, Ratna, Anin, Madya, Hartono, Essy, Hani, Tata, Silih, Nia, Jule, Bodonx, Phian and Pharmacy 2003 fellows for your support, time, laughter, hatred and every lesson we have learned to grow together. 12. Every single person that I have met, who has supported me so much so that I can compile this thesis, who I never met but has given an obvious lesson during my study, who I cannot mention his or her name here and now. ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Penulis menyadari, skripsi ini jauh dari sempurna, untuk itu penulis membuka diri untuk menerima kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, penulis berharap hasil peneltitan ini dapat bermanfaat dan memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu dan pengetahuan. Yogyakarta, 15 Agustus 2007 Penyusun Anita Devi Ariesnawati x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. iii HALAMAN MOTTO DAN PERSEMBAHAN .................................................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... v INTISARI ............................................................................................................. vi ABSTRACT ......................................................................................................... vii KATA PENGANTAR ......................................................................................... viii DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi DAFTAR TABEL ................................................................................................. xv DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN......................................................................................... xviii BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................... 1 A. Latar Belakang ......................................................................................... 1 B. Permasalahan ........................................................................................... 3 C. Keaslian Penelitian ................................................................................... 3 D. Manfaat Penelitian ................................................................................... 3 E. Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4 xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .................................................................. 5 A. Tanaman Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) ............... 5 1. Keterangan Botani .............................................................................. 5 2. Nama Lokal ........................................................................................ 5 3. Morfologi Tanaman ........................................................................... 5 4. Penyebaran ......................................................................................... 6 5. Kegunaan ........................................................................................... 6 B. Flavonoida ................................................................................................ 7 C. Penyarian .................................................................................................. 9 1. Cairan Penyari .................................................................................... 9 2. Ekstraksi ............................................................................................. 9 D. Kromatografi Kolom Vakum …………………………………………… 11 E. Kromatografi Lapis Tipis ......................................................................... 12 F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ........................................................ 13 G. Identifikasi Flavonoida ............................................................................ 13 1. Reaksi Warna ..................................................................................... 13 2. Kromatografi Lapis Tipis…………………………………………… 14 3. Spektroskopi Ultraviolet .................................................................... 15 H. Keterangan Empiris .................................................................................. 24 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 25 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................... 25 B. Definisi Operasional ................................................................................ 25 C. Bahan Penelitian ....................................................................................... 25 D. Alat Penelitian .......................................................................................... 26 E. Jalannya Penelitian ................................................................................... 26 F. Tata Cara Analisis Hasil ........................................................................... 32 BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN .................................... 33 A. Determinasi Tanaman .............................................................................. 33 B. Ekstraksi Herba Pegagan Embun ............................................................. 33 C. Isolasi dengan Kromatografi Kolom Vakum ........................................... 34 D. Isolasi Flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis .............................. 35 E. Isolasi Flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ............. 37 F. Pemeriksaan Kemurnian Isolat Flavonoida ............................................. 38 G. Identifikasi Flavonoida dengan Reaksi Warna ........................................ 42 H. Identifikasi Spektrum Isolat Flavonoida dengan Spektroskopi Ultraviolet ................................................................................................ 43 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 56 A. Kesimpulan .............................................................................................. 56 B. Saran ......................................................................................................... 56 xiii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 57 LAMPIRAN ......................................................................................................... 59 xiv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL I. Penafsiran bercak dari segi struktur flavonoida ............................................. 14 II. Reaksi warna beberapa golongan flavonoida ................................................ 15 III. Rentangan serapan spektrum UV pada flavonoida.................................................... 18 IV. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOH...... 21 V. 22 Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc.... VI. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc dan H3BO3 ....................................................................................... 22 VII. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan AlCl3 serta AlCl3 dan HCl ............................................................................................... 23 VIII.Data kromatogram dari bercak fraksi herba pegagan embun menggunakan fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas) deteksi dengan sinar UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia .......................................... 37 IX. Reaksi warna isolat flavonoida herba pegagan embun .................................. 42 X. Data spektrum dan pergeseran yang terjadi setelah diberi pereaksi – pereaksi kimia .............................................................................................................. 44 XI. Perbandingan data spektrum isolat flavonoida dengan hiperin dalamn MeOH dan NaOMe..................................................................................................... 46 XII. Perbandingan data spektrum isolat flavonoida dengan hiperin dalamn MeOH dan AlCl3/ HCl................................................................................................ 50 xv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI XIII.Perbandingan data spektrum isolat flavonoida dengan hiperin dalamn MeOH dan NaOAc/ H3BO3........................................................................................ 54 xvi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR 1. Struktur hiperin ……………………………………………………………… 6 2. Tata cara penomoran flavonoida ……………………………………………. 7 3. Penggolongan umum flavonoida ……………………………………………. 8 4. Kerangka dasar flavonoida .............................................................................. 17 5. Reaksi antara Flavon dengan amonia .............................................................. 36 6. Kromatogram isolasi flavonoida dengan KLTP .............................................. 39 7. Kromatogram pemeriksaan kemurnian isolat flavonoida ................................ 40 8. Kromatogram pemeriksaan kemurnian isolat flavonoida ................................ 41 9. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOH ................................ 45 10. Spektrum UV hiperin dalam MeOH dan NaOMe .......................................... 46 11. Reaksi antara Flavon dengan NaOH ................................................................ 47 12. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan AlCl3 ............................... 48 13. Spektrum UV isolat flavonoida dalam AlCl3 dan HCl .................................... 49 14. Spektrum UV hiperin dalam MeOH dan AlCl3/HCl ....................................... 50 15. Reaksi antara Flavon dengan AlCl3/HCl ......................................................... 51 16. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOAc .......................... 52 17. Reaksi antara Flavon dengan NaOAc ............................................................. 52 18. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOAc/ H3BO3 ............. 53 19. Spektrum UV hiperin dalam MeOH dan NaOAc/ H3BO3 .............................. 54 20. Reaksi antara Flavon dengan NaOAc/ H3BO3 ................................................ xvii 55 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Determinasi tanaman pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) .................................................. 60 Lampiran 2. Kromatogram pemeriksaan kandungan flavonoida dengan kromatografi lapis tipis........................................................................................... 61 Lampiran 3. Alat kromatografi kolom vakum ...................................................... 62 Lampiran 4. Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) ....................... 63 Lampiran 5. Reaksi warna isolat flavonoida herba pegagan embun..................... 64 xviii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB I PENDAHULUAN A. Latar belakang Indonesia yang kaya dengan berbagai macam sumber alam telah memanfaatkan tumbuh-tumbuhan sebagai bahan obat tradisional secara turuntemurun. Akan tetapi hanya sedikit tumbuhan yang berkhasiat sebagai bahan obat tersebut yang telah diteliti kandungan kimia dan efek farmakologinya. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian tentang zat aktif yang terkandung dalam tumbuhan tersebut, untuk selanjutnya tumbuhan yang semula digunakan sebagai obat tradisional dapat digunakan dalam bentuk sediaan obat modern. Tumbuhan tersebut salah satunya adalah pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) yang belum banyak dikenal masyarakat. Pegagan embun tumbuh merayap, ramping, subur di tempat lembab, terbuka maupun teduh di pinggir jalan, pinggir selokan, lapangan rumput dan tempat lain sampai setinggi kira-kira 2.500 m dari permukaan laut (Anonim, 2005). Pegagan embun dapat dimanfaatkan untuk mengobati sakit kuning (hepatitis), batu empedu, kencing batu, infeksi saluran kencing, batuk, sesak nafas, sariawan, radang tenggorokan, amandel, dan infeksi telinga tengah (Anonim, 2005). Kandungan kimia yang diketahui terdapat dalam pegagan embun, antara lain minyak atsiri, kumarin, hiperin (Anonim, 2005). Hiperin (kuersetin 3-O-galaktosida) merupakan salah satu senyawa flavonoida yang 1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2 disebutkan sebagai salah satu kandungan kimia yang terdapat dalam pegagan embun. Pada umumnya suatu tanaman yang memiliki kandungan flavonoida memiliki lebih dari satu jenis senyawa flavonoida (Markham,1988). Dimungkinkan masih terdapat kandungan senyawa flavonoida lain yang ada dalam pegagan embun selain hiperin. Flavonoida merupakan salah satu kandungan zat aktif yang banyak terkandung dalam tumbuh-tumbuhan dan mempunyai berbagai macam aktivitas biologis. Senyawa flavonoida berkhasiat sebagai anti radang, bersifat bakterisid, anti jamur, dan anti histamin (Harborne, 1984). Kandungan flavonoida di dalam herba pegagan embun dimungkinkan berperan penting dalam pengobatan beberapa penyakit yang telah disebutkan di atas. Oleh karena itu perlu dilakukan upaya untuk mengisolasi dan mengidentifikasi kandungan flavonoida yang ada dalam suatu tumbuhan. Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi flavonoida lain dalam herba pegagan embun. Metode fraksinasi yang digunakan adalah kromatografi kolom vakum karena dapat memisahkan suatu senyawa dengan cepat. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi tentang kandungan aktif senyawa obat alami. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3 B. Permasalahan Permasalahan yang ada dalam penelitian ini adalah : 1. Golongan flavonoida apa yang terdapat dalam herba pegagan embun selain hiperin ? 2. Bagaimana prakiraan struktur parsialnya ? C. Keaslian Penelitian Sejauh pengetahuan peneliti yang berdasar pada penelusuran terhadap beberapa sumber, telah dilakukan penelitian mengenai kandungan flavonoida dalam pegagan embun. Hasil penelitian mengenai kandungan flavonoida sebelumnya menyatakan bahwa hiperin terdapat dalam pegagan embun (Anonim, 2005). Penelitian ini berusaha untuk mengisolasi dan mengetahui golongan flavonoida lain yang terkandung dalam herba pegagan embun. D. Manfaat Penelitian Penelitian yang dilakukan terhadap ekstrak metanol-air herba pegagan embun diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai berikut : 1. Secara praktis Untuk memberikan informasi dalam bidang ilmu kefarmasian khususnya dalam bidang farmakognosi tentang golongan flavonoida yang terkandung dalam herba pegagan embun. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4 2. Secara teoritis Diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah terhadap eksplorasi kandungan aktif senyawa obat alami . E. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui golongan flavonoida yang terkandung dalam herba pegagan embun selain hiperin dan melakukan prakiraan struktur parsialnya. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Pegagan Embun 1. Keterangan botani Pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) merupakan salah satu anggota familia Umbelliferae (Apiaceae). Pegagan embun mempunyai sinonim H.rotundifolia Roxb.,dan H.formosana Masamune (Anonim, 2005). 2. Nama lokal : Pegagan embun, antanan beurit, antanan lembut (Sunda) ; andem, katepa’n, rending, semanggi (jawa), salatun ; take cena (Madura), tikim, patikim ; tian hu sui (China) (Anonim,2005). 3. Morfologi tanaman Pegagan embun tumbuh merayap, ramping, subur di tempat lembab, terbuka maupun teduh di pinggir jalan, pinggir selokan, lapangan rumput dan tempat lain sampai setinggi kira-kira 2.500 m dari permukaan laut (Anonim, 2005). Tumbuhan pegagan embun mempunyai batang lunak dan bercabang-cabang. Daunnya majemuk menjari tiga yang anak daunnya berbentuk jantung dengan warna hijau muda. Bunga keluar dari ketiak daun, berwarna kuning berbentuk payung kecil-kecil. Buah berupa kotak lonjong, tegak, bagian ujungnya seperti paruh, bila sudah masak berwarna coklat merah yang pecah bila disentuh (Anonim, 2004). 5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6 4. Penyebaran Tanaman pegagan embun tumbuh liar pada tempat-tempat yang lembab, terbuka maupun yang teduh di sisi jalan atau lapangan rumput. Di pulau Jawa tumbuhan ini terdapat dari pantai sampai pegunungan dengan ketinggian 3.000 meter diatas permukaan laut (Anonim, 2004) 5. Kegunaan Pegagan embun dapat digunakan untuk mengobati sakit kuning (hepatitis), batu empedu, batu dan infeksi saluran kencing, batuk dan sesak nafas, sariawan, radang tenggorokan, amandel, infeksi telinga tengah (Anonim, 2005). Kandungan kimia yang diketahui terdapat dalam pegagan embun, antara lain minyak atsiri, kumarin, hiperin (Anonim, 2005). Hiperin mempunyai nama lain kuersetin 3-O-galaktosida (Gambar 1) (Anonim,2007). OH OH HO O O galaktosa OH O Gambar 1. Struktur hiperin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7 B. Flavonoida Flavonoida adalah golongan senyawa alam yang strukturnya terdiri dari 2 cincin aromatik yang dihubungkan oleh tiga atom karbon membentuk rangka dengan sistem C6-C3-C6; masing-masing C6 merupakan cincin benzene. Untuk memudahkan dalam penomoran cincin diberi tanda A, B dan C, serta angka “beraksen” untuk cincin B (Gambar 2) (Markham, 1988). 3' 2' 4' B 8 O A C 1' 2 7 5' 6' 3 6 4 5 O Gambar 2. Tata cara penomoran flavonoida (Markham,1988) Flavonoida adalah senyawa fenol alam yang terdapat dalam hampir semua tumbuhan dari bangsa algae hingga Gimnospermae. Di dalam tumbuhan, flavonoida biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosida. Molekul yang berikatan dengan gula disebut aglikon. Di alam dikenal hampir lebih dari 500 aglikon dan kurang lebih 200 flavonoida (Mursyidi, 1990). Flavonoida merupakan kandungan khas tumbuhan hijau dengan mengecualikan alga dan hornwort. Flavonoida sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga, buah buni, dan biji (Markham, 1988). Perbedaan penggolongan di dalam kelompok flavonoida dibedakan dengan penambahan rantai oksigen heterosiklik dan gugus hidroksil. Senyawa PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8 flavonoida meliputi katekin, leukoantosianidin, flavanon, flavanonol, flavon, antosianidin, flavonol, khalkon, auron, dan isoflavon (Gambar 3) (Kaufman dkk, 1999). O O OH OH Katekin OH Leukoantosianidin O O OH O O Flavanon Flavanonol O OH O O Flavonol Khalkon O O O O Auron Isoflavon Gambar 3. Penggolongan umum flavonoida (Kaufman dkk, 1999) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9 Flavonoida mempunyai aktivitas estrogenik, diuretik, hipotensif, anti histamin, bersifat bakterisida dan anti jamur. Flavonoida juga dapat berkhasiat sebagai anti radang, zat ini terutama berguna dalam menjaga kesehatan (Harborne, 1984). Flavonoida sering merupakan pereduksi yang baik, menghambat banyaknya reaksi oksidasi, baik secara enzim maupun nonenzim. Flavonoida tertentu mempunyai aktivitas anti oksidan yang digunakan secara tradisional mengobati penyakit hati (Robinson, 1995). C.Penyarian 1. Cairan penyari Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor antara lain: mudah atau murah diperoleh, mudah menguap, tidak mudah terbakar, selektif yaitu hanya mengekstraksi zat yang berkhasiat yang diinginkan, dan tidak mempengaruhi zat berkhasiat, bereaksi netral, stabil secara fisika dan kimia (Anonim,1986). 2. Ekstraksi Cara penyarian dapat dibedakan menjadi infundasi, maserasi, perkolasi dan penyarian berkesinambungan (Anonim,1986). a.Infundasi Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia dengan air pada suhu 90ْ C selama 15 menit. Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. b. Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan diluar sel dan di dalam sel. c. Perkolasi Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prinsip perkolasi adalah serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. d. Penyarian berkesinambungan Penyarian berkesinambungan memiliki prinsip menghasilkan ekstrak cair yang kemudian dilanjutkan dengan proses penguapan cairan penyari. Cairan penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan pada tabung dari kertas saring atau tabung yang berlubang-lubang dari gelas, baja tahan karat atau bahan lain yang cocok. Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih, uap PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11 penyari akan mengembun karena didinginkan oleh pendingin balik kemudian embun turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu. Cairan akan menguap kembali berulang proses seperti diatas. D. Kromatografi Kolom Vakum Isolasi flavonoida dapat ditingkatkan hampir ke skala industri dengan menggunakan kromatografi kolom. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) di atas kolom yang berisi serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok (Markham, 1988). Kromatografi kolom vakum merupakan metode yang sederhana dan memerlukan waktu yang relatif singkat untuk melakukan pemisahan. Metode ini dapat digunakan untuk pemisahan campuran baik dalam jumlah sedikit maupun banyak. Pemilihan sistem pelarut yang tepat didapat dengan percobaan analisis kromatografi lapis tipis. Metode kromatografi kolom vakum menggunakan sebuah perlengkapan yang sederhana dan murah yang dapat diterapkan pada laboratorium manapun (Pelletier et al, 1986). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12 E. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembangan campur. Pemilihan pengembangan atau pelarut pengembangan campur sangat dipengaruhi pelarut oleh macam dan polaritas zat-zat kimia yang dipisahkan (Mulja, 1995). Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa di samping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada pelat dan merupakan keuntungan bila kita menelaah senyawa labil. Akhirnya, kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran μg (Harborne, 1987). Bilangan Rf adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi, nisbi terhadap garis depan. Bilangan Rf diperoleh dengan mengukur jarak antara titik awal dan pusat bercak yang dihasilkan senyawa, dan jarak ini kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan (yaitu jarak yang ditempuh cairan pengembang). Bilangan ini selalu berupa pecahan dan terletak antara 0,01 dan 0,99 (Harborne, 1987). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 13 F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif KLT Preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai pengganti lapisan penjerap yang tipis (0,10-0,25 mm). Pelat preparatif yang dibuat oleh pabrik dapat dibeli. Kandungan yang sudah dipisah dapat diperoleh kembali dengan cara mengerok penjerap di tempat yang sesuai pada pelat yang telah dikembangkan, lalu serbuk dielusi dengan pelarut seperti eter, dan akhirnya dipusingkan untuk menghilangkan penjerap (Harborne, 1987). G. Identifikasi Flavonoida 1. Reaksi Warna Flavonoida dapat dideteksi dengan amoniak, jika tidak bercampur dengan pigmen lain. Reaksi ini memberikan warna spesifik untuk masing-masing golongan. Flavon, flavonol dan xantin memberikan warna kuning kemerahan, antosianin menunjukkan warna biru, flavonol berwarna orange sampai coklat, warna merah dan lembayung akan timbul mendadak pada suasana asam disebabkan adanya khalkon dan auron (Robinson, 1995). Penelitian fitokimia lazimnya diawali dengan pengujian kimiawi tertentu, seperti larutan natrium hidroksida, asam sulfat pekat, besi (III) klorida, logam magnesium, asam klorida (Venkataraman, 1962; Harborne,1984). Uji warna selanjutnya didukung analisis spektroskopi ultraviolet, inframerah, spektroskopi inti dan massa (Mabry dkk,1970; Markham,1988; Harborne, 1984). Uji warna flavonoida (Tabel II) (Venkataraman, 1962). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 14 2. Kromatografi Lapis Tipis Identifikasi flavonoida dengan kromatografi lapis tipis dilakukan dengan mengamati warna bercak sebelum dan sesudah diuapi amonia dengan dibandingkan dengan pustaka (Tabel I) (Markham,1998). Tabel I. Penafsiran bercak dari segi struktur flavonoida (Markham, 1988) Warna bercak dengan UV 366 nm Jenis flavonoida yang mungkin tanpa NH3 dengan NH3 Lembayung gelap Kuning, hijau-kuning a. Biasanya 5-OH flavon atau flavonol (tersulih pada atau hijau 3-O dan mempunyai 4’-OH) b. Kadang-kadang 5-OH flavanon dan 4’-OH khalkon tanpa OH pada cincin B Perubahan warna a. Biasanya flavon atau flavonol tersulih pada 3-O sedikit atau tanpa mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas perubahan warna b. Beberapa 6- atau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH c. Isoflavon, dihidroflavon, biflavonil dan beberapa flavanon yang mengandung 5-OH d. Khalkon yang mengandung 2- atau 4-OH bebas Biru muda Beberapa 5-OH flavanon Merah atau jingga Khalkon yang mengandung 2- dan/atau 4-OH bebas Fluoresensi biru Fluoresensi hijau- a. Flavon dan Flavanon yang tidak mengandung 5muda kuning atau hijau-biru OH, misalnya 5-OH-glikosida b. Flavanol tanpa 5-OH bebas tetapi tersulih pada 3OH Perubahan warna Isoflavon yang tidak mengandung 5-OH sedikit atau tanpa perubahan Fluoresensi murup Isoflavon yang tak mengandung 5-OH bebas biru muda Tak tampak Fluoresensi biru muda Isoflavon tanpa 5-OH bebas Kuning redup dan kuning, atau fluoresensi jingga Perubahan sedikit atau perubahan Fluoresensi kuning Hijau-kuning, hijau-biru, atau hijau Jingga atau merah Merah jingga redup atau merah senduduk Merah jambu atau fluoresensi kuning Biru Auron yang mengandung 4’-OH bebas dan beberapa 2- atau 4-OH bebas warna a. Auron yang tak mengandung 4’-OH bebas dan tanpa flavanon tanpa 5-OH bebas b. Flavanol yang mengandung 3-OH bebas dan disertai atau tanpa 5-OH bebas Antosianidin 3-glikosida Biru Sebagian besar antosianidin 3,5-diglikosida Perubahan sedikit atau perubahan warna tanpa Flavonol yang mengandung 3-OH bebas dan mempunyai atau tak mempunyai 5-OH bebas (kadang-kadang dari dihidroflavonol) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15 Tabel II. Reaksi warna beberapa golongan flavonoida (Venkataraman, 1962) Tipe flavonoida Reaksi warna H2SO4 pekat Khalkon Jingga, merah Dihidrokhalkon Agak kuning Logam Mg dan HCl Jingga, merah, atau Tidak berwarna magenta Tidak berwarna Agak kuning Auron Merah-ungu Merah-magenta Flavanon Jingga Kuning-jingga, jika dingin merah, dipanaskan ungu Flavon Kuning Flavonol Kuning-jingga Kuning-jingga, bila teroksidasi dengan fluoresensi coklat Merah-magenta Flavanonol Kuning cepat Agak merah-kuning menjadi coklat Merah-magenta Leukoantosianin Kuning Merah tua Merah muda Antosianidin dan antosianin Biru-violet Kuning-jingga Merah-merah muda Katekin Kuning berubah Merah merah/coklat Isoflavon Kuning Kuning Kuning Isoflavanon Kuning Kuning Tidak berwarna NaOH Kuning-jingga Tidak berwarna Merah-magenta, violet, biru Kuning, merah Tidak berwarna 3. Spektroskopi Ultraviolet Dasar metode ini adalah interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan atom, molekul atau ion, di daerah ultraviolet dan daerah sinar tampak. Energi yang diserap menyebabkan elektron tereksitasi dari orbital tingkat dasar ke orbitel yang berenergi tinggi (Sastroamijoyo,1985; Silverstein, 1986). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16 Beberapa istilah dalam spektroskopi ultraviolet (Sastrohamidjojo, 2001): a. Kromofor Suatu gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerahdaerah ultraviolet dan terlihat. Contoh: C=C, C=O. b. Auksokrom Suatu gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Ciri auksokrom adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor, misal: -OCH3, -Cl, -OH dan NH2. c. Pergeseran batokromik (pergeseran merah) Pergeseran serapan kearah panjang gelombang yang lebih panjang disebabkan substitusi atau pengaruh pelarut. d. Pergeseran hipsokromik (pergeseran biru) Pergeseran serapan kearah panjang gelombang yang lebih pendek disebabkan substitusi atau pengaruh pelarut. e. Efek hiperkromik Kenaikan dalam intensitas serapan. f. Efek hipokromik Penurunan dalam intensitas serapan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 17 Struktur flavonoida terdiri dari dua cincin aromatik dan ikatan rangkap terkonjugasi, sehingga dapat menunjukkan pita serapan pada spektrum ultraviolet dan serapan sinar tampak (Gambar 4). Flavonoida merupakan senyawa yang mempunyai struktur sebagian besar dengan pola flavon (Mabry dkk, 1970). 3' 2' 8 7 A O B 5' 6' C 6 3 5 Sistem konjugasi 2 1' 4' 4 O Benzoil Sistem konjugasi Cinnamoyl Gambar 4. Kerangka dasar flavonoida (Mabry dkk, 1970) Energi ultraviolet dapat diukur karena spektrum serapan timbul dari transisi elektronik tunggal mengandung garis yang tunggal dan terputus-putus. Garis ini tidak akan terlihat jika serapan elektronik berhimpit pada sub tingkat putaran dan getaran. Spektrum molekul sederhana mengandung puncak serapan yang sempit menggambarkan suatu transisi dari kombinasi tertentu dari tingkat dasar elektronik dengan yang sesuai di dalam tingkat tereksitasi. Kekhasan dari pita serapan adalah letak dan intensitasnya. Pola spekrum flavonoida biasanya memberikan dua puncak pada rentang λ 240 – 285 nm (puncak I) dan λ 300 – 350 nm (puncak II). Panjang gelombang dan besarnya absorbsi akan memberikan informasi yang berharga mengenai PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 18 sifat dan pola oksigenasi flavonoida. Ciri khas spektrum tersebut memberikan puncak relatif rendah pada pita I untuk golongan: hidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon dengan kedudukan pita I dalam spektrum: khalkon, auron, dan antosianin terdapat pada panjang gelombang yang relatif tinggi. Ciri ini tidak berubah meskipun pada oksigenasi berubah. Petunjuk mengenai letak puncak maksimum (Tabel III) (Markham, 1988). Tabel III. Rentangan serapan spektrum UV pada flavonoida (Markham, 1988) Pita II (nm) 250-280 250-280 250-280 245-275 275-295 230-270 (kekuatan lemah) 230-270 (kekuatan kuat) 270-280 Pita I (nm) 310-350 330-360 350-385 310-330 320-329 300-330 340-390 Jenis Flavonoida Flavon Flavonol (3-OH tersubstitusi) Flavonol 3-OH bebas Isoflavon Isoflavon 5-deoksi-6,7 dioksigenasi Flavanon dan dihidroflavonol Khalkon 380-430 Auron 465-560 Antosianin, antosianidin Flavon, isoflavon dan dihidroflavanol memberikan spektrum UV yang mirip karena senyawa ini tidak mempunyai sistem konjugasi cinnamoil dengan cincin B antara C-2 dan C-3. Isoflavon memberikan spektrum UV dengan puncak II pada daerah λ 245 – 270 nm dan puncak I pada λ 310 – 330 nm. Flavon dan dihidroflavonol memberikan puncak II pada λ 275 – 295 nm dan puncak I λ 310 – 330 nm (Geissman, 1967; Harborne,1984; Markham, 1988). Senyawa flavon dan flavonol dalam metanol memberikan spektrum UV dengan puncak I λ 300 – 380 nm dan puncak II λ 240 – 280 nm penambahan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 19 NaOMe pada senyawa menyebabkan gugus hidroksi pada inti aromatik akan terionisasi dan mengakibatkan terjadinya pergeseran puncak I dan puncak II menjadi pergeseran batokromik. Efek yang timbul akibat penambahan pereaksi geser : a. Efek hidroksilasi Penambahan gugus OH dalam cincin A pada flavonol menghasilkan pergeseran batokromik yang nyata pada pita puncak I dan efek puncak serapan II. Bila gugus 5-OH tidak terdapat dalam flavonol dan flavon maka puncak tersebut mempunyai panjang gelombang (λ) yang pendek dibanding gugus 5-OH pada posisi 3,5,4’ yang mempunyai sedikit atau tidak sama sekali efek pada spektrum UV. b. Efek metilasi dan glikosilasi Terjadi pada pola resapan flavon dan flavonol. Bila gugus 3,5 atau 4’-OH pada flavon dan pergeseran hipsokromik pada puncak I, maka pergeseran itu terjadi 12-17 nm atau dapat pula mencapai 22 – 25 nm pada flavon yang tidak mempunyai gugus 5-OH. Efek asetilasi bila gugus OH fenolik diasetilasi maka efek dari gugus itu akan hilang. c. Efek natrium metoksida Penambahan basa menyebabkan pergeseran yang khas pada kebanyakan flavonoidaa yaitu batokromik. Natrium-metoksida merupakan basa kuat yang dapat mengionisasi gugus OH pada inti flavonoidaa. Penambahan Na-metoksida pada flavon dan flavonol dalam metanol menyebabkan pergeseran batokromik yang besar pada puncak serapan pergeseran tersebut 40 – 65 nm pada puncak I PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 20 tanpa penurunan intensitas menunjukkan gugus 4’-OH bebas. Flavonol mengalami pergeseran batokromik 50 – 60 nm pada puncak I dengan penurunan intensitas disebabkan oleh adanya 3-OH bebas. Flavonol mempunyai 5 dan 4’ OH bebas maka spektrumnya dengan Na-metoksida mengalami dekomposisi. d. Efek natrium asetat Merupakan basa lemah akan mengionisasi gugus yang keasamannya tinggi, digunakan untuk mendeteksi adanya gugus 7-OH bebas. Flavon dan flavonol dengan gugus 7-OH bebas menunjukkan pergeseran batokromik sebesar 5 – 20 nm pada puncak serapan II dengan natrium asetat. Adanya natrium asetat dan asam borat akan membentuk kompleks dengan gugus ortohidroksi pada semua posisi kecuali pada atom C-5 dan C-6 (Mabry dkk, 1970). e. Efek alumunium klorida Adanya alumunium klorida maka gugus OH pada C-3 dan C-5 flavon dan flavonol akan membentuk kompleks yang stabil dengan penambahan asam. Kompleks antara alumunium klorida dengan C4-keto dan atau 5-OH tetap stabil dengan adanya asam. Adanya gugus ortohidroksi pada cincin B dapat diketahui dengan penambahan AlCl3 menghasilkan pergeseran hipsokromik panjang gelombang 20 -30 nm pada pita I (I.a terdiri dari dua puncak). Adanya pergeseran batokromik pada I.a dalam AlCl3 dan HCl dibandingkan denga pita I dalam metanol sebesar panjang gelombang 35 – 55, menunjukkan adanya 5-OH flavon atau flavonol 3-OH tersubtitusi (Mabry dkk, 1970). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 21 Tabel IV. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOH (Markham, 1988) Jenis Flavonoida Flavon Flavonol Pergeseran tampak Pita I Pita II Kekuatannya menurun terus Mantap ±45-65 nm kekuatan tidak menurun Mantap ±45-65 nm kekuatan menurun Pita baru (bandingkan dengan MeOH) Isoflavon, Tidak ada flavanon, dan pergeseran dihidroflavono Kekuatan menurun l Auron Khalkon 3’,4’OH, o-diOH pada cincin A dan pada cincin B: 3OH yang berdampingan 4’-OH 3-OH, tidak ada 4’OH bebas 7-OH Tidak ada OH pada cincin A o-di OH pada cincin A (penurunan) lambat; O-diOH pada cincin B) dan Bergeser dari ±280 Flavanon nm ke ±325 nm, dihidroflavonol dengan 5,7-OH, 7kekuatan meningkat ke 330- OH tanpa 5-OH bebas 340 nm 4’OH (auron) 6-OH + 80-95 nm tanpa oksigenasi (kekuatan meningkat) pada 4’ (auron) +60-70 (kekuatan 6-OH dengan naik) pergeseran kecil oksigenasi pada 4’ (auron) 4’OH (auron) +60-100nm (kekuatan naik) tanpa kekuatan kenaikan +40-50 nm Antosianidin Antosian Petunjuk penafsiran Semuanya terurai kecuali 3deoksiantosianin 2-OH atau 4’OH dan tanpa 4’OH 4’OH (2’OH atau 4’OH) Nihil PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 22 Tabel V. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc (Markham, 1988) Jenis flavonoida Flavon Pergeseran yang tampak Pita I Pita II +5-20 nm (berkurang bila Flavonol ada oksigenasi pada 6/8) Isoflavon Kekuatannya berkurang dengan bertambahnya waktu Flavanon +35 nm Dihidroflavonol +60 nm Kekuatannya berkurang dengan bertambahnya waktu Pergeseran batokromik atau bahu pada panjang gelombang yang lebih panjang Petunjuk Flavonoidaa 7-OH -OH di 6,7 atau 7,8 atau 3,4’ 7-OH (dengan 5-OH) 7-OH (tanpa 5-OH) -OH di 6,7 atau 7,8 4’-OH dan atau 4OH (khalkon) 4’-OH dan atau tanpa 6-OH (Auron) Tabel VI. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc dan H3BO3 (Markham, 1988) Jenis flavonoida Flavonol, Auron, Khalkon Isoflavon, Flavanon, Dihidroflavonol Pergeseran Tampak Pita I Pita II +12-36 nm (nisbi terhadap spektrum metanol), pergeseran lebih kecil Petunjuk penafsiran o- di OH pada cincin B o- di OH cincin A atau 7,8) +10-15 nm (nisbi o- di OH terhadap spektrum cincin A metanol) atau 7,8) pada (6,7 pada (6,7 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23 Tabel VII. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan AlCl3 serta AlCl3 dan HCl (Markham, 1988) Jenis flavonoida (Pereaksi) Flavanon dan flavonon (AlCl3 dan HCl) (AlCl3) Isoflavon, flavanon, dan dihidroflavonol (AlCl3 dan HCl) (AlCl3) Auron, Khalkon (AlCl3 dan HCl) (AlCl3) Antosianidin, Antosianin (AlCl3) Pergeseran yang tampak Pita I Pita II +35 sampai 55 nm +17 sampai 20 nm Tak berubah + 50 sampai 60 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 30 sampai 40 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 20 sampai 25 nm +10 sampai 14 nm +20 sampai 26 nm Pergeseran AlCl3/HCl, tambah 11 sampai 30 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 30 sampai 38 nm +48 sampai 64 nm +40 nm +60 sampai 70 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 40 sampai 70 nm Penambahan lebih kecil +25 sampai 35 nm (Pada pH 24) Pergeseran lebih besar Petunjuk penafsiran 5- OH 5-OH dengan oksigenasi pada 6 Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6 Mungkin 3-OH (dengan atau tanpa 5-OH) o-diOH pada cincin B o-di OH pada cincin A (Tambahan pada pergeseran odi OH pada cincin B) 5-OH (Isoflavon) 5-OH (Flavanon, dihidroflavonol) o-diOH pada cincin A (6,7 dan 7,8) Dihidroflavonol tanpa 5-OH (tambahan pada sembarang pergeseran o-di OH) 2’-OH (khalkon) 2’-OH (Khalkon oksigenasi pada 3’ 4-OH (Auron) dengan o- diOH pada cincin B Mungkin o-diOH pada cincin A o-diOH Banyak o-diOH atau o-diOH (3-deoksi antosianidin) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24 H. Keterangan Empiris Dari ekstrak metanol herba pegagan embun dapat diidentifikasi jenis flavonoida dan gambaran struktur parsial flavonoida tersebut. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental yang dilakukan di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. B. Definisi Operasional 1. Herba pegagan embun adalah seluruh bagian tanaman pegagan embun yang berada di atas tanah. 2. Ekstrak metanol-air adalah ekstrak yang diperoleh dari penyarian herba pegagan embun secara maserasi dengan metanol-air (9:1 dan 1:1). 3. Struktur parsial merupakan kerangka dasar dari segi struktur senyawa dengan gugus-gugus tersubstitusi pada bagian struktur tersebut. C. Bahan Penelitian Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah bahan kimia yang berderajat pro analisis (p.a), kecuali dinyatakan lain. 1. Bahan tanaman : herba segar dari pegagan embun (yang telah dikeringkan dan diserbuk). 25 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 26 2. Bahan kimia untuk penyari : bahan yang digunakan adalah metanol dan aquadest (lokal). 3. Bahan untuk kromatografi : kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam selulosa, n-butanol, aquadest (lokal), asam asetat, amonia pekat. 4. Bahan pereaksi identifikasi warna flavonoida : serbuk Mg, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, natrium hidroksida (NaOH). 5. Pereaksi diagnostik untuk penentuan struktur flavonoida secara spektroskopi ultraviolet : natrium hidroksida (NaOH), alumunium klorida (AlCl3), natrium asetat (CH3COONa), asam borat (H3BO3). D. Alat Penelitian 1. Alat pengeringan, penyerbukan dan penyarian : oven, blender, ayakan, kertas saring, alat-alat gelas (pipet tetes, gelas ukur, Beaker glass, corong, pengaduk). 2. Alat kromatografi dan spektroskopi Ultraviolet : seperangkat alat spektroskopi UV-Vis (Genesys 6), vakum, pipa kapiler, lampu 365 nm, seperangkat alat kromatografi kolom, alat-alat gelas (corong pisah, Beaker glass, gelas ukur, pipet), kertas saring. E. Jalannya Penelitian 1. Determinasi tanaman pegagan embun Determinasi dilakukan terhadap tanaman pegagan embun di laboratorium Farmakognosi Fitokimia menurut Backer dan Backhuizen van de Brink (1963). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27 2. Pengumpulan bahan Herba segar dari pegagan embun dikumpulkan pada bulan januari 2006 pada musim penghujan dari daerah Paingan, Yogyakarta. Pencucian dilakukan terlebih dahulu untuk menghilangkan kotoran yang menempel seperti debu dan serangga. Bagian herba juga dipisahkan dari bagian tanaman lain yang terikut saat pengumpulan. 3. Pengeringan herba pegagan embun Herba pegagan embun dikeringkan tanpa dirajang terlebih dahulu karena herba yang tipis.Pengeringan dilakukan dalam oven pada suhu 40ºC selama 5 jam. Dikatakan kering jika herba pegagan embun sudah dapat hancur ketika diremas dengan tangan. 4. Penyerbukan herba pegagan embun Herba pegagan embun yang telah dikeringkan kemudian diserbuk menggunakan blender, lalu diayak. 5. Ekstraksi herba pegagan embun Penyarian dilakukan dengan memaserasi terlebih dahulu simplisia yang telah digiling menjadi serbuk dengan campuran pelarut pertama yaitu metanol : air (9 :1) secukupnya hingga terbentuk bubur cair. Campuran dibiarkan selama 6 – 12 jam, di tempat yang terlindung cahaya pada suhu kamar. Untuk pemisahan serbuk dan cairan hasil penyarian, dilakukan penyarian menggunakan corong dengan kapas. Bagian serbuk disari lagi dengan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28 pelarut metanol : air (1:1), dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Kedua hasil penyarian dicampur, diuapkan hingga tinggal sepertiga atau pelarutnya hampir menguap semua (Mursyidi, 1990). 6. Fraksinasi flavonoida dengan kromatografi kolom vakum Kolom yang digunakan mempunyai diameter 4 cm dan mempunyai tinggi 20 cm. a. Cara membuat fase diam Sejumlah selulosa dimasukkan ke dalam Beaker glass kemudian diaduk hingga berbentuk bubur (slurry) menggunakan aquadest. Bubur selulosa dimasukkan ke dalam kolom setinggi 5 cm dengan bantuan corong dan batang pengaduk. b. Penempatan sampel Sebanyak 1,0 gram ekstrak kering diletakkan di atas fase diam. c. Pemisahan fraksi Sebanyak 25 ml fase gerak dituang di atas sampel, kemudian divakum sampai semua fase gerak tersedot keluar. Hal tersebut dilakukan 15 kali sampai fraksi yang dihasilkan berwarna bening. Masing-masing fraksi lalu dipekatkan. 7. Identifikasi flavonoida dengan KLT Kandungan flavonoida fraksi dari hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom vakum diperiksa dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi ditotolkan pada lempeng selulosa, kemudian dikembangkan dengan jarak pengembangan 8 cm dari totolan menggunakan pelarut BAW (n-butanol:asam asetat:air = 4:1:5 v/v, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29 fase atas) hingga batas yang ditetapkan. Bercak dideteksi menggunakan uap amonia, dan lampu UV 365 nm. 8. Isolasi flavonoida dengan KLT preparatif Dilakukan isolasi KLT preparatif dalam fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas). Isolat ditotolkan berupa garis yang selanjutnya dikembangkan, dan didapatkan pemisahan bercak. Hasil kerokan diekstraksi dengan metanol kemudian disaring dengan kertas saring. Maka diperoleh isolat flavonoida untuk diuji kemurnian, reaksi warna, dan spektroskopi ultraviolet. 9. Pemeriksaan kemurnian isolat senyawa flavonoida Kemurnian isolat flavonoida dapat diketahui menggunakan lempeng kromatrografi dengan menotolkan pada dua lempeng yang masing-masing dikembangkan menggunakan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas) dan asam asetat 15 %. 10. Reaksi warna flavonoida Isolat senyawa flavonoida dianalisis reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi warna : a. Natrium hidroksida 4% (larutan ini dibuat dengan melarutkan 4 g NaOH dalam air bebas CO2 hingga 100 ml), 3 tetes larutan isolat flavonoida pada droping plate ditambah dengan 1 tetes larutan natrium hidroksida, warna yang terjadi dicatat. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 30 b. Logam magnesium dan asam klorida, 3 tetes larutan isolat flavonoida pada droping plate ditambah sedikit serbuk magnesium dan asam klorida, warna yang terjadi dicatat. c. Asam sulfat pekat 98%, 3 tetes larutan isolat flavonoida pada droping plate ditambah dengan 1 tetes larutan asam sulfat pekat 98%, warna yang terjadi dicatat. 11. Identifikasi spektra senyawa flavonoida dengan spektroskopi ultra violet Tiap isolat senyawa flavonoida yang telah diperiksa kemurniannya, diencerkan dengan metanol sampai konsentrasi 0,2% dan kemudian dilakukan pembacaan absorbansi melalui tahapan sebagai berikut : a. isolat flavonoida dimasukkan dalam kuvet sampel dan ke dalam kuvet pembanding diisikan metanol. Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 200 – 500 nm. b. Penambahan pereaksi geser NaOH, pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan segera setelah penambahan 3 tetes NaOH 2 N. Untuk memeriksa apakah ada penguraian pergeseran panjang gelombang diperiksa lagi setelah 5 menit, kemudian cuplikan dibuang dan kuvet yang telah dicuci diisi dengan larutan isolat persediaan. c. Penambahan pereaksi geser AlCl3, pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan setelah penambahan larutan AlCl3 pada isolat flavonoida. Selanjutnya dibaca lagi absorbansi setelah penambahan 3 tetes HCl. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 31 d. Penambahan pereaksi geser natrium asetat, pembacaan pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan dengan cara serbuk natrium asetat dimasukkan dalam kuvet berisi 2 -3 ml isolat flavonoida lalu digojog, sedemikian rupa sehingga terdapat kira-kira 2 mm lapisan natrium asetat pada dasar kuvet. Pembacaan dilakukan setelah 2 menit penambahan natrium asetat. e. Penambahan pereaksi geser natrium asetat / H3BO3, pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan dengan cara serbuk H3BO3 dimasukkan ke kuvet berisi 2 ml isolat flavonoida, larutan dijenuhkan secepatnya dengan serbuk kasar natrium asetat lalu dibaca absorbansinya. Pembacaan absorbansi dilakukan pada kecepatan 50 nm per menit. 12. Pembuatan pereaksi geser (Markham, 1988) a. Natrium hidroksida (NaOH) Pereaksi NaOH menggunakan larutan NaOH 2 M dalam air. b. Natrium asetat (NaOAc) Digunakan serbuk NaOAc anhidrat. c. Alumunium klorida (AlCl3) Sebanyak 5 g AlCl3 ditambahkan ke dalam 100 ml metanol. d. Asam hidroklorida (HCl) Sejumlah 50 ml HCl pekat ditambahkan ke dalam 100 ml aquadest. e. Asam borat (H3BO3) Digunakan serbuk asam borat anhidrat. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 32 F. Tata Cara Analisis Hasil Analisis hasil dilakukan terhadap data yang diperoleh dari kromatografi lapis tipis, reaksi warna ,dan spektroskopi ultraviolet dibandingakan dengan pustaka Markham (1988) dan Venkataraman (1988). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman pegagan embun dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kebenaran identitas nama ilmiah tanaman pegagan embun. Determinasi pada penelitian ini dilakukan dengan cara mencocokkan keadaan tanaman dengan ciri-ciri yang terdapat pada pustaka acuan (Backer dan Backhuizen van de Brink, 1963). Tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman pegagan embun yang dideterminasi sampai tingkat spesies menurut Backer dan Backhuizen van de Brink (1963) (Lampiran 1). Berdasarkan determinasi hingga kategori spesies tersebut, maka tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar pegagan embun dengan nama ilmiah Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. B. Ekstraksi Herba Pegagan Embun Herba pegagan embun yang telah diambil kemudian dicuci dan dibersihkan dengan air untuk memisahkan kotoran , tanah dan mikroba yang melekat pada herba. Setelah itu, herba dikeringkan dalam oven pada suhu 40˚ C selama 5 jam. Pengeringan dimaksudkan untuk menghentikan reaksi enzimatik yang dapat menguraikan senyawa aktif dan mencegah tumbuhnya mikroba. Setelah kering, yang ditandai dengan herba mudah hancur ketika diremas dengan 33 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34 tangan maka herba tersebut diserbuk. Penyerbukan dilakukan untuk memperbesar luas permukaan sehingga pada waktu penyarian hasilnya akan optimal. Flavonoida merupakan polifenol yang memiliki sifat kimia fenol. Adanya gula yang terikat pada aglikon akan meningkatkan polaritas, maka flavonoida cukup larut dalam pelarut polar yaitu metanol. Adanya gula yang terikat pada flavonoida cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran metanol-air merupakan pelarut yang baik untuk melarutkan flavonoida. Maka penyarian yang dilakukan secara maserasi dengan prinsip perendaman dan penggojogan sudah dapat membuat flavonoida tersari ke dalam cairan penyari. Selain itu, maserasi dapat dikerjakan tanpa alat yang khusus dan cara kerjanya sederhana. Cairan penyari menembus membran dan masuk ke dalam rongga sel herba sehingga zat aktif herba terlarut karena terjadi perpindahan dari konsentrasi yang lebih besar ke konsentrasi yang lebih kecil dari dalam sel ke cairan penyari. Penyarian dengan maserasi dapat mencapai titik jenuh, maka penggojogan dilakukan untuk menjaga perbedaan konsentrasi di dalam sel dan di luar sel sehingga tetap terjadi perpindahan senyawa aktif dari sel tersebut. C. Isolasi dengan Kromatografi Kolom Vakum Fraksi metanol dipisahkan dengan kromatografi kolom vakum menggunakan fase diam selulosa dan fase gerak BAW. Digunakan fase diam selulosa karena selulosa ideal untuk memisahkan glikosida yang satu dari glikosida yang lain, glikosida dari aglikon, serta untuk memisahkan aglikon yang PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 35 kurang polar (Markham,1988). Sedangkan dipilih fase gerak BAW karena BAW sesuai untuk memisahkan glikosida, aglikon, dan gula (Markham,1988). Selulosa bersifat non polar dan BAW bersifat polar sehingga sesuai untuk memisahkan flavonoida dimana flavonoida akan lebih terikat dalam fase gerak Penggunaan vakum dimaksudkan untuk mempercepat proses keluarnya fraksi dari kolom. Jika fraksi yang dihasilkan sudah bening dan jika dilihat di bawah lampu UV sudah tampak tidak ada bercak warna, maka proses pemisahan dapat dihentikan. Pemisahan komponen-komponen fraksi metanol dengan kromatografi kolom vakum menghasilkan 15 fraksi. D. Identifikasi Flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Pemeriksaan selanjutnya dilakukan dengan kromatografi lapis tipis. Kromatografi lapis tipis merupakan metode yang umum dan cocok untuk memeriksa senyawa polar seperti flavonoida yang umumnya mempunyai kelarutan polar (struktur flavonoida banyak mengandung gugus hidroksi). Jumlah ekstrak yang ditotolkan menentukan kualitas pola flavonoida yang terjadi. Jika ekstrak yang ditotolkan terlalu sedikit, bercak flavonoida yang terbentuk setelah pengembangan akan sulit untuk dideteksi. Jika terlalu banyak, maka setelah dilakukan pengembangan akan terjadi pengekoran (tailing) yang akan mengganggu hasil analisis karena menurut Sastrohamidjojo (2005), ekor akan menaikkan kelebaran pita sehingga cenderung menimbulkan penindihan pita satu dengan pita lainnya (overlap). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 36 Fraksi-fraksi dari hasil kromatografi kolom vakum diperiksa dengan KLT dengan fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5, fase atas). Hasil pemisahan fraksi 3 - 12 dengan KLT menghasilkan dua bercak pemisahan yang dideteksi di bawah lampu UV 365 nm, yaitu bercak A yang berwarna ungu gelap dengan harga Rf 0,86 dan bercak B yang berwarna biru dengan harga Rf 0,76 (Lampiran 2). Reaksi antara flavonoida dengan amonia akan memperpanjang ikatan rangkap terkonjugasi sehingga intensitas warna kuning menjadi jelas (Gambar 5). Dari hasil penelitian, setelah diuapi dengan amonia maka intensitas warna kuning menjadi jelas jika dilihat secara visible. Fraksi 3 – 12 menunjukkan kromatogram yang sama, oleh karena itu fraksi-fraksi tersebut disatukan dan dipekatkan untuk kemudian dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif. Berdasarkan data tersebut yang didapat dari warna bercak dan nilai Rf pada kromatografi lapis tipis dan dibandingkan dengan pustaka ada indikasi bahwa fraksi BAW ekstrak metanol herba pegagan embun kemungkinan mengandung flavonoida (Harborne, 1984; Markham, 1988) (Tabel VIII). OH OH O- OH HO HO O -NH 4 + O + NH 3 O O OH O HO O O - Gambar 5. Reaksi antara Flavon dengan amonia PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 37 Tabel VIII. Data kromatogram dari bercak fraksi herba pegagan embun menggunakan fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas) deteksi dengan sinar UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia (Markham, 1988) Bercak Rf A 0,86 B 0,76 Warna Bercak Visible UV 365 Amonia/ visible Agak kuning Ungu gelap Kuning jelas Tidak Biru berwarna Kuning Amonia /UV 365 Ungu gelap Biru E. Isolasi flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Penggunaan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) lebih ditekankan untuk mendapatkan isolat dengan menggunakan pelarut seminimal mungkin. Keuntungan lain yang didapat yaitu penghematan waktu dan biaya yang diperlukan. Pada kromatografi lapis tipis preparatif fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak metanol-air ditotolkan berupa garis / pita 10 cm pada lempeng kromatografi dengan fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas). Penotolan diulang beberapa kali agar bercak yang diperoleh lebih jelas. Pengembangan dilakukan dengan jarak pengembangan 10 cm dari totolan awal. Bercak pita dengan harga Rf dan warna yang sama dengan bercak yang dipilih pada pemeriksaan sebelumnya, dikerok kemudian dikumpulkan dan diekstraksi dengan metanol (Gambar 6). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 38 Pada penelitian, dipilih bercak yang berwarna ungu dengan harga Rf 0,86. Pemilihan bercak dilakukan karena pertimbangan bercak yang lebih dominan. Hasil pengerokan dari kromatografi lapis tipis preparatif dari bercak tersebut selanjutnya disebut isolat flavonoida. F. Pemeriksaan Kemurnian Isolat Flavonoida Kemurnian isolat flavonoida diperiksa secara KLT multi eluen dengan menggunakan dua macam fase gerak yang mempunyai kepolaran yang berbeda yaitu BAW dan asam asetat, dimana asam asetat 15% bersifat lebih polar daripada BAW. Hasil pengembangan KLT multi eluen diperoleh bercak tunggal berwarna ungu yang mengindikasikan bahwa isolat flavonoida sudah murni dan dapat diperiksa secara spektroskopi UV. Bercak tersebut dilihat di bawah sinar UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia. Diperoleh harga Rf 0,55 untuk pengembangan dengan fase gerak BAW (Gambar 7) pengembangan dengan fase gerak asam asetat (Gambar 8). dan Rf 0,93 untuk PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 39 A B Gambar 6. Kromatogram isolasi flavonoida dengan KLTP Keterangan : Sampel : Fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak metanol-air herba pegagan embun Fase diam : Selulosa Fase gerak : BAW (4:1:5 v/v, fase atas) Bercak 1 : Bercak A (warna ungu) Rf 0,86 Bercak 2 : Bercak B (warna biru) Rf 0,76 Jarak pengembang : 10 cm PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 40 Gambar 7 . Kromatogram pemeriksaan kemurnian isolat flavonoida Keterangan : Sampel : Pita bercak (Rf 0,69) dari Fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak metanol-air herba pegagan embun Fase diam : Selulosa Fase gerak : BAW (4:1:5 v/v, fase atas) Bercak pada pengembangan : Rf 0,93 Jarak pengembang : 10 cm PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 41 Gambar 8. Kromatogram pemeriksaan kemurnian isolat flavonoida Keterangan : Sampel : Pita bercak (Rf 0,69) dari Fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak metanol-air herba pegagan embun Fase diam : Selulosa Fase gerak : Asam asetat 15 % Bercak pada pengembangan : Rf 0,55 Jarak pengembang : 10 cm PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 42 G. Identifikasi Flavonoida dengan Reaksi Warna Reaksi warna flavonoida merupakan uji pendahuluan untuk menentukan golongan senyawa flavonoida. Uji ini memberi informasi berupa gambaran umum golongan senyawa flavonoida pada hidroksilasi dan substitusinya. Penambahan NaOH yang bersifat basa menyebabkan flavonoida menjadi kuning. Warna ini timbul disebabkan oleh pembentukan garam dan terbentuknya struktur kuinoid pada cincin B pada flavonoida (Venkataraman, 1962). Adanya gugus fenol pada flavonoida akan memberikan reaksi positif antara flavonoida dengan pereaksi untuk fenol, seperti H2SO4 pekat. Reaksi ini tidak spesifik dan harus diikuti dengan reaksi warna yang lain (Venkataraman, 1962; Harborne, 1987). Flavonoida akan mengalami reduksi jika direaksikan dengan serbuk magnesium dalam asam klorida dan menghasilkan warna kuning sampai merah untuk golongan flavon (Venkataraman, 1962). Berdasarkan data dari reaksi warna yang diperoleh (Tabel IX), maka dapat disimpulkan bahwa isolat flavonoida mengarah pada golongan flavon (Venkataraman, 1962). Tabel IX. Reaksi warna isolat flavonoida herba pegagan embun Uji Warna Isolat flavonoida Flavon (Venkataraman, 1962) NaOH Kuning H2SO4 p Kuning Mg-HCl p Kuning Kuning Kuning - jingga Kuning-merah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 43 H. Identifikasi Spektrum Isolat Flavonoida dengan Spektroskopi Ultraviolet Analisis selanjutnya dilakukan pada data spektroskopi ultraviolet untuk memastikan golongan flavonoida dan struktur parsialnya. Isolat flavonoida dalam metanol yang diukur menghasilkan dua puncak serapan karena pada struktur flavonoida terdapat dua komponen penyerap, yaitu komponen penyerap benzoil dan komponen penyerap sinamoil. Komponen penyerap sinamoil merupakan puncak serapan untuk pita I, sedangkan komponen penyerap benzoil merupakan puncak serapan untuk pita II. Pita I mempunyai panjang gelombang yang lebih besar karena ikatan rangkap terkonjugasinya lebih banyak dibanding pita II. Penambahan ikatan rangkap terkonjugasi ini menyebabkan makin kecil energi yang diperlukan untuk tereksitasi sehingga akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang yang lebih besar. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44 Tabel X. Data spektrum dan pergeseran yang terjadi setelah diberi pereaksi – pereaksi kimia Pereaksi yang ditambahkan Puncak Serapan (nm) Pita I Isolat Metanol Pita II 345 260 NaOH 395 270 NaOH (5 menit) AlCl3 395 270 360 265 Isolat Metanol AlCl3 + HCl 350 265 Isolat Metanol NaOAc 385 265 Isolat Metanol Isolat Metanol Isolat Metanol H3BO3 + NaOAc 365 260 Pergeseran Puncak Serapan (nm) Pita Pita I II Prakiraan Struktur (Mabry dkk, 1970) Golongan Flavon Golongan Flavonol dengan 3-OH tersubstitusi +50* + 10 Adanya gugus OH pd atom C nomer 4’ +50* + 10 Tidak terjadi dekomposisi +15* + 5 Mengindikasikan ada ortodihidroksi di B Tidak menunjukkan adanya 3-hidroksi di cincin B (jika dibandingkan dengan 0 AlCl3) 10** JIka dibandingkan dengan metanol pada pita I. maka tidak menampakkan adanya 5 dan 3 OH +40* + 5 Adanya gugus OH pada atom C nomor 7 +20* 0 Posisi orto dihidroksi di cincin B (3’ dan 4’ atau 4’ dan 5’) Tidak adanya posisi orto dihidroksi pada cincin A Ket: * : dibandingkan dengan serapan isolat metanol ** : dibandingkan dengan isolat flavonoida dalam metanol diberi AlCl3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 45 Hasil pengukuran isolat flavonoida dalam metanol memperoleh puncak dengan serapan 345 nm pada pita I dan 260 nm pada pita II. Hal ini menunjukkan bahwa isolat flavonoida hasil isolasi mengarah pada golongan flavon dan flavonol dengan 3-OH tersubstitusi (Markham, 1988)(Tabel X). 260 270 345 395 MeOH MeOH + NaOH Gambar 9. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOH PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 46 Gambar 10. Spektrum UV Hiperin dalam MeOH dan NaOMe (Mabry,dkk. 1970) Tabel XI. Perbandingan data spektrum isolat Flavonoida dengan Hiperin dalam MeOH dan NaOMe Senyawa Pita I Pita II Isolat Flavonoida 395 270 Hiperin (Mabry,dkk. 1970) 409 272 Pada penambahan NaOH dalam larutan ini didapat puncak serapan 395 nm pada pita I dan 270 nm pada pita II. Pada pergeseran ini tidak terjadi dekomposisi, hal ini tidak menunjukkan adanya gugus yang peka terhadap basa (Tabel X). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 47 OH OH HO O + 3 NaOH - 3 Na + - 3 H2O O O- O- O O- O O O O O O- Gambar 11. Reaksi antara Flavon dengan NaOH AlCl3 dan AlCl3/HCl menyebabkan pembentukan kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tak tahan asam dengan gugus o-dihidroksil, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Pada penambahan AlCl3 ke dalam isolat flavonoida dalam metanol didapatkan puncak serapan 360 nm pada pita I dan 265 nm pada pita II. Pergeseran ini mengindikasikan adanya ortodihidroksi pada cincin B (Tabel X). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48 260 265 345 360 MeOH MeOH + AlCl3 Gambar 12. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan AlCl3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 49 265 350 360 AlCl3 AlCl3 + HCl Gambar 13. Spektrum UV isolat flavonoida dalam AlCl3 dan HCl PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 50 Gambar 14. Spektrum UV Hiperin dalam MeOH dan AlCl3/ HCl (Mabry,dkk. 1970) Tabel XII. Perbandingan data spektrum isolat Flavonoida dengan Hiperin dalam MeOH dan AlCl3/ HCl Senyawa Pita I Pita II Isolat Flavonoida 350 265 Hiperin (Mabry,dkk. 1970) 405 268 Adanya gugus 5-OH dan 3-OH dalam spektrum akan memperlihatkan pergeseran batokromik relatif terhadap metanol dengan penambahan pereaksi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 51 AlCl3/HCl. Dari analisis yang diperoleh tidak mengindikasikan adanya 5-OH dan 3-OH (Tabel X). Cl O OH O OH OH O OH O AlCl 3 O Al HCl encer O OH OH OH O O Gambar 15. Reaksi antara Flavon dengan AlCl3/HCl (Mabry dkk, 1970) Penambahan pereaksi NaOAc bertujuan untuk mendeteksi adanya 7-OH bebas dari golongan flavon dan flavonol. Keberadaan 7-OH bebas akan menyebabkan pergeseran batokromik sebesar 5 – 20 nm pada pita II (Mabry dkk, 1970). Pada penambahan NaOAc ke dalam isolat flavonoida dalam metanol diperoleh pergeseran batokromik sebesar 5 nm pada pita II. Hal ini mengindikasikan adanya: 7-OH pada golongan flavon atau 7-OH pada golongan flavonol (Tabel X). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 52 260 265 345 385 MeOH MeOH + NaOAc Gambar 16. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOAc OH OH OH O O + CH3 - C ONa - Na + - CH3COOH O OH OH OH OH -O O O O O O- Gambar 17. Reaksi antara Flavon dengan NaOAc PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 53 Penambahan pereaksi NaOAc/ H3BO3 untuk mendeteksi adanya gugus ortodihidroksi pada cincin B dan gugus ortodihidroksi pada cincin A dari golongan flavon dan flavonol. Adanya gugus ortodihidroksi pada cincin B ditunjukkan dengan pergeseran batokromik sebesar 12 – 30 nm pada pita I, sedangkan adanya gugus ortodihiroksi pada cincin A ditunjukkan dengan pergeseran batokromik kira-kira sebesar 5 – 10 nm pada pita I (Mabry dkk, 1970). Pada penambahan NaOAc/ H3BO3 ke dalam isolat flavonoida dalam metanol diperoleh pergeseran batokromik sebesar 20 nm pada pita I. Hal ini memberikan kemungkinan adanya gugus ortodihidroksi pada cincin B dan tidak menunjukkan adanya gugus ortodihidroksi pada cincin A (Tabel X). 260 345 365 MeOH MeOH + NaOAc/ H3BO3 Gambar 18. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOAc/ H3BO3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 54 Gambar 19. Spektrum UV Hiperin dalam MeOH dan NaOAc/ H3BO3 (Mabry,dkk. 1970) Tabel XIII. Perbandingan data spektrum isolat Flavonoida dengan Hiperin dalam MeOH dan NaOAc/ H3BO3 Senyawa Pita I Pita II Isolat Flavonoida 365 260 Hiperin (Mabry,dkk. 1970) 377 262 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 55 OH OH O HO O - + CH 3 C ONa - Na - CH 3C OOH O HO O OH B- OH O OHO O HO OH O OH B + - H 2O OH O O Gambar 20. Reaksi antara Flavon dengan NaOAc/ H3BO3 Berdasarkan analisis warna bercak dan Rf (Tabel VIII), analisis reaksi warna (Tabel IX), dan analisis spektroskopi ultraviolet (Tabel X) maka isolat flavonoida tersebut kemungkinan golongan flavon dengan kemungkinan struktur parsial 7,3’,4’ trihidroksi flavon atau 7, 4’,5’ trihidroksi flavon. OH OH OH HO O O 7,3’,4’ trihidroksi flavon HO O OH O 7,4’,5’ trihidroksi flavon PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Penelitian yang dilakukan yaitu isolasi dan prakiraan struktur parsial herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) secara kromatografi, reaksi warna, dan spektroskopi ultraviolet maka isolat A diduga memiliki golongan flavon, dengan kemungkinan struktur parsial 7,3’,4’ trihidroksi flavon atau 7, 4’,5’ trihidroksi flavon. OH OH OH HO HO O O OH O O 7,3’,4’ trihidroksi flavon 7,4’,5’ trihidroksi flavon B. Saran Perlu dilakukan penentuan golongan flavonoida dan prakiraan struktur parsial terhadap bercak biru yang nampak pada KLT. 56 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 57 DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, 4-6, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Anonim, 2004, Calincing untuk darah tinggi, http://www.suaramerdeka.com%20%20semata-mata%20fakta!htm, diakses, 27 April 2006. Anonim,2005, Semanggi Gunung, http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=58-15k. diakses, 26 April 2006. Anonim, 2007, Noble rhubarb, http://en.wikipedia.org/wiki/Noble_rhubarb, diakses 2 Mei 2007. Anonim,1986a, Sediaan Galenik, 1-5, 0-16, 25-28, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Backer, C.A. dan Backhuizen Van de Brink Jr., R.C., 1963, Flora of Java, Volume I, 3-9, 25-26, N.V.P. Noordhoff, Groningen, The Nederlands. Backer, C.A. dan Backhuizen Van de Brink Jr., R.C., 1963, Flora of Java, Volume II, 171-172, N.V.P. Noordhoff, Groningen, The Nederlands. Bruneton, J., 1999, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants, Edisi II, 310-326, Intercept. Ltd, New York. Creswell, C. J., Runquist, O.A., Campbell, M.M., 1982, Spectrum Analysis of Organic Compound, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, Edisi III, 46-59, Penerbit ITB, Bandung. Harborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, Edisi II, 2-28, 34-37, 47-49,69-103, Penerbit ITB, Bandung. Hostettmann, K., Hostettmann, M., Marston, A., 1995, Cara Kromatografi Preparatif, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 33-36, Penerbit ITB, Bandung. Kaufman, Peter B., dkk., 1999, Natural Products from Plants, 22-23, CRC Press LLC, United States of America. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 58 Mabry, T.J., Markham, K.R., Thomas, M.B., 1970, The Systematical Identification of Flavonoida Compound, 35 – 55, Springer Verlag, New York – Heidelberg – Berlin. Markham K.R., 1988, Techniques of Flavonoida Identification, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 15-27, 32-53, Penerbit ITB, Bandung. Mulya, M., 1995, Analisis Instrumental, Penerbit Airlangga University Press, Surabaya. Mursyidi A., 1990, Analisis Metabolit Sekunder, Cetakan I, 171-187, Penerbit PAU Bioteknologi UGM, Yogyakarta. Pelletier, S. W., Chokshi, H. P., Desai, H. K., 1986, Journal of Natural Products, Volume 49, 892, 897, The University of Georgia Athens, Georgia. Robinson, T., 1995, The Constituen of Higher Plants, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Edisi 6, 191-213, Penerbit ITB, Bandung. Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, Cetakan II, 22-23, Penerbit Liberty, Yogyakarta. Sastrohamidjojo, H. , 2005, Kromatografi, Cetakan III, 4, Penerbit Liberty, Yogyakarta. Silverstein, R.M., Basser,C.G., Morril, I.C.,1974, Spectrometric Identification of Organic Compounds, Edisi IV, 305-308, Penerbit Erlangga, Jakarta. Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi VII, 3-6, Penerbit ITB, Bandung. Venkataraman, K., 1962, Methods for Determining the Structure of Flavonoida Compounds, in Geissman, T.A. (Ed.), 70-75, The Chemistry of Flavonoida Compound. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 61 A R A B B Lampiran 2. Kromatogram pemeriksaan kandungan flavonoida dengan kromatografi lapis tipis Keterangan : Sampel : Fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak metanol-air herba pegagan embun Fase diam : Selulosa Fase gerak : BAW (4:1:5 v/v, fase atas) R : pembanding rutin, Rf 0,67 Bercak A : Bercak Rf 0,86 Bercak B : Bercak Rf 0,76 Jarak pengembang : 8 cm PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 62 Lampiran 3. Alat kromatografi kolom vakum PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 63 Lampiran 4. Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 64 Lampiran 5. Reaksi warna isolat flavonoida herba pegagan embun PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Anita Devi Ariesnawati merupakan anak kedua dari pasangan Sigit Wahono dan Sri Hartanti. Lahir di Klaten, Jawa Tengah pada tanggal 9 April 1985. Pendidikan awal dimulai di Taman Kanak-kanak Maria Assumpta Klaten pada tahun 1990-1991, kemudian melanjutkan di Sekolah Dasar Maria Assumpta Klaten pada tahun 1991-1997. Dilanjutkan ke jenjang pendidikan Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama Negeri 2 Klaten pada tahun 1997-2000. Kemudian naik ke jenjang Sekolah Menengah Umum Negeri 1 Klaten pada tahun 2000-2003. Selanjutnya pada tahun 2003 melanjutkan pendidikan ke jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta dan menyelesaikan masa studi pada tahun 2007. Selama kuliah, penulis pernah menjadi asisten dosen pada mata kuliah praktikum Farmakognosi Fitokimia I.
