Isolasi dan Identifasi Mikroba Rumen Penghasil Antihistamin

8
Biosfera 26 (1) Januari 2009
Isolasi dan Identifasi Mikroba Rumen Penghasil Antihistamin
“Histamine Methyl Transferase“
Ning Iriyanti, Budi Rustomo, Efka Aris Rimbawanto
Fakultas Peternakan UNSOED
Jl. dr. Soeparno Kotak Pos 110 Purwokerto 53123
Abstract
The aim of this research was to find antihistamine ”Histamine Methyl Transferase” of microbe
producers through isolation and testing of their activities on various substrates. The isolation
process found four putative isolates i.e. N2k, N2b, N3 and N5. Their general characteristics were
round, big and formed regular colonies; regular edge and wavy colonies. Colonies were whitish,
shiny and had low convex elevation. N2k, N2b, and N5 isolates were Gram negative bacteria
whereas N3 was Gram positive. Those isolates were non-motile. Further tests were conducted to
examine the isolate capability to produce catalase and utilize citric acid as the carbon source to
which they showed positive result. Nitrate reduction test showed positive results for N2b and N5
but not for N2k and N3. The ability to ferment sugars into acid and gas indicated that all isolates
except N3 were capable of fermenting glucose and lactose. However, only N2k was capable to
produce gas.
Key words: Antihistamine, histamine methyl transferase, bacteria
Pendahuluan
Bahan pakan ternak terutama bungkil kedele, jagung, dan tepung ikan sampai
sekarang masih merupakan bahan pakan impor, sehingga ketersediaannya bergantung
pada pasokan dari luar negeri, sedangkan tepung ikan yang berasal dari dalam negeri
kurang dapat dimanfaatkan karena kualitasnya rendah dengan kadar garam dan air yang
cukup tinggi. Prosesing dan penyimpanan tepung ikan yang kurang tepat akan
menyebabkan histamin yang terkandung cukup tinggi. Menurut Kose dan Hall (2003),
kadar histamin pada tepung ikan mencapai 127,93-415,24 mg/100g, sedangkan Brinker
et al. (2002), kadar histamin pada tepung ikan kering dapat mencapai 273 mg/kg.
Histamin merupakan senyawa amin aktif dalam produk ikan dan daging, dibentuk dari
perombakan histidin menjadi histamin oleh enzim histidin dekarboksilase.
Histamin pada kadar tertentu dapat menyebabkan toksik, seperti alergi, sakit
kepala, sesak napas, diare, dan gangguan pencernaan yang lain. Tiga faktor yang
mempengaruhi pembentukan histamin di dalam makanan yaitu: (a) tersedianya asam
amino bebas; (b) kehadiran dan perkembangan bakteri penghasil enzim dekarboksilase;
dan (c) adanya kondisi yang mendukung pertumbuhan mikroba serta proses
dekarboksilasi asam amino tersebut (Halasz et al.,1994).
Histamin adalah bioaktif amin dengan kadar tertentu dapat menyebabkan toksik.
Histamin dibentuk dari histidin dengan bantuan enzim histidin dekarboksilase, dan
diproduksi pada sel mast (mast cells) di jaringan peritoneal dan jaringan konektif
Histamin banyak terdapat pada sebagian besar jaringan sebagai granula pada Mast
Cells atau basophil (Marieb, 2001). Histamin dibentuk karena adanya enzim histidin
dekarboksilase mikroba yang tumbuh optimum pada suhu 25 C (Kim et al., 1999) atau
pada suhu 15-30 C dan aktivitas enzim histidin dekarboksilase masih berlangsung,
meskipun disimpan pada suhu 0-5 C (Ahmed, 1991). Histamin melalui metabolisme
nutrien akan menghasilkan asam lambung, tetapi apabila mencapai dosis tertentu, maka
dapat bersifat toksik (Taylor, 1986). Kadar histamin yang terdapat pada ikan dapat dipakai
sebagai indikator tingkat kerusakan produk perikanan. Apabila kadar histamin lebih dari
15 mg/100g sudah mulai terbentuk kerusakan, pada kadar 50 mg/100g atau lebih sudah
9
Biosfera 26 (1) Januari 2009
berbahaya untuk kesehatan, dan kadar 100 mg/100g atau lebih sudah bersifat racun pada
manusia (SNI 01-2360, 1991). Menurut Scoging (1998), produk perikanan dengan kadar
histamin kurang dari 10 mg/100g masih aman untuk dikonsumsi.
Kadar histamin dapat ditekan melalui pemberian obat-obatan antihistamin atau
dengan mengendalikan aktivitas enzim histidine dekarboksilase. Dengan keberadaan
Histamine Methyl Transferase (HMT) dan Diamine oxsilase (DAO), histamin penyebab
toksik dapat dicegah seminimal mungkin dan histamin dapat masuk ke dalam aliran darah
(Taylor, 1986). Kerja antihistamin adalah mengurangi gejala alergi dengan cara memblokir
kerja enzim histamin (Greene, 1998). Enzim HMT atau enzim DAO/Histaminase mikroba
banyak terdapat pada saluran pencernaan (Kerr et al., 2002).
Pencegahan histidin menjadi histamin antara lain menggunakan enzim yang
dihasilkan oleh mikroba yaitu enzim HMT atau DAO yang mampu mencegah
pembentukan histamin dari histidin, sehingga tidak bersifat toksik baik pada pakan
maupun pangan. Mikroba tersebut dapat diisolasi dari rumen sapi, yang sampai saat ini
para peneliti belum ada yang meneliti sampai seberapa jauh peranan dan jenis mikroba
antihistamin yang sesuai.
Materi dan Metode
Cairan rumen sapi, histamin (difco), anthihistamin, media Tryptone Soya Agar (TSA)
yang terdiri dari 0,5% tryptone, 0,5 yeast extract, 2,7% L-histidin-2HCl, 0,5% NaCl, 0,1%
CaCO3, 2% agar, dan 0,006% bromocresol purple (pH 5,3) disterilisasi dengan autoclave
pada suhu 121 C selama 15 menit.
Isolasi tahap I dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1 g cairan rumen
sapi dimasukkan dalam 9 ml garam fisiologis (0,85% larutan NaCl). Seri pengenceran
dengan garam fisiologis sampai 10-6 dilakukan. Suspensi dari 3 pengenceran terakhir
diambil 0,1 ml dan ditabur secara tabur ulas (spreadplating) pada media TSA. Inkubasi
dilakukan pada pada suhu 37C selama 2-3x24 jam, mikroba yang tumbuh dihitung,
hasilnya ditampilkan sebagai colony forming unit/g (CFU/g) .
Isolasi tahap II dilakukan untuk mikroba penghasil Antihistamin (Niven et al., 1981;
Yoshinaga and Frank, 1982; Pousti et al., 2002). Hasil Isolasi Tahap I ditumbuhan pada
media TSA agar yang diperkaya dengan Histamin. Pembuatan media TSA agar dengan
bahan yaitu 0,5% tryptone (Difco), 0,5 yeast extract (Difco), 2,7% L-histidin-2HCl, 0,5%
NaCl, 0,1% CaCO3, 2% agar, dan 0,006% bromocresol purple (pH 5,3), dan histamin.
Bahan disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121C selama 15 menit. Jika
pertumbuhan pada pada TSA yang diperkaya histamin menunjukkan hasil yang lebih baik
berarti bakteri tersebut mampu menggunakan histamin
Isolasi selanjutnya adalah isolat ditumbuhkan pada media Glukosa 10% diperkaya
dengan Histamin, setelah tumbuh. Untuk menentukan bahwa isolat hanya mampu tumbuh
pada media yang mengandung histamin, isolat selanjutnya ditumbuhkan pada media TSA
maupun Glukosa 10% yang diperkaya dengan antihistamin 10%. Apabila isolat
pertumbuhannya sangat minimal pada media yang mengandung anthihistamin berarti
isolat tersebut hanya mampu tumbuh apabila substrat mengandung histamin. Setelah
isolat-isolat tersebut diyakini kemurniannya (jika diperlukan dilakukan goresan berulang
untuk mendapatkan kultur murni), isolat-isolat tersebut ditumbuhkan pada medium TSA
yang mengandung histamin. Selanjutnya, isolat ditumbuhkan lagi pada media TSA atau
Glukosa agar 10% dengan cara cap (stamped method). Inkubasi dilakukan pada suhu
37C selama 24 jam
Identifikasi isolat bakteri dilakukan melalui pengamatan secara mikromorfologi dan
uji biokimiawi berpedoman pada Cowan and Steel's Manual for the Identification of
Medical Bacteria (Barrow dan Feltham, 1993) serta Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology (Holt, 1994). Pengamatan mikromorfologi meliputi bentuk sel, sifat Gram,
motilitas. Uji-uji biokimiawi meliputi kemampuan memproduksi katalase, reduksi nitrat,
fermentasi gula-gula glukosa, laktosa dan pembentukan gas, serta kemampuan
menggunakan asam sitrat sebagai sumber C.
Iriyanti, dkk., Isolasi dan Identifikasi Mikroba Rumen Penghasil Antihistamin: 8 - 13
10
Hasil dan Pembahasan
Dari hasil isolasi pada media TSA diperoleh 19 isolat bakteri. Selanjutnya, isolat
ditumbuhkan pada media TSA-agar yang diperkaya dengan Histamin dan diperoleh 10
isolat. Tahap berikutnya ditumbuhkan pada media TSA dan media Glukosa 10% yang
diperkaya dengan Antihistamin dan diperoleh 4 isolat yang menunjukkan pertumbuhan
koloni paling tipis (miskin pertumbuhannya) pada media tersebut. Hal ini berarti bahwa
isolat tersebut hanya mampu tumbuh apabila substrat mengandung histamin dan akan
mengubah histamin menjadi histidin. Dari hasil isolasi bakteri penghasil antihistamin yaitu
“Histamine Methyl Transferase” diperoleh empat isolat unggulan. Hasil identifikasi
selengkapnya disajikan pada Tabel 1 dan 2; serta Gambar 1-4.
Pengamatan terhadap makromorfologi dilakukan dengan melihat ciri-ciri koloni yang
meliputi bentuk, tepi, warna, permukaan dan elevasi koloni bakteri. Hasil pengamatan
morfologi koloni ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil identifikasi secara makroskopis isolat penghasil antihistamin
Table 1. Results of microscopic identification of the isolates producing antihistamine
Kode
Isolat
Bentuk Koloni
N2k
Besar teratur
Berlekuk
Putih keruh
Mengkilap
Cembung rendah
N2b
Besar teratur
Berlekuk
Jernih
Mengkilap
Cembung rendah
N3
Bulat
Bergelombang
Mengkilap
Cembung rendah
N5
Besar
Teratur
Mengkilap
Cembung rendah
Tepi Koloni
Warna koloni
Putih keruh
tidak tembus
cahaya
Putih keruh
tembus cahaya
Permukaan
koloni
Elevasi koloni
Untuk keperluan identifikasi, pengamatan mikromorfologi dan uji-uji biokimiawi
berpedoman pada Barrow dan Feltham (1993) dan Holt (1994) dilakukan pula.
Pengamatan mikromorfologi meliputi bentuk sel, sifat Gram, motilitas. Uji-uji biokimiawi
yang dilakukan meliputi kemampuan memproduksi katalase, reduksi nitrat, fermentasi
glukosa, laktosa dan produksi gas, serta kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai
sumber C. Hasil pengamatan tersebut ditunjukkan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Identifikasi dari isolasi mikroba rumen penghasil antihistamin
Table 2. Identification results of isolated rumen microbes producing antihistamine
Kode
Isolat
N2k
N2b
N3
N5
Bentuk Sel
Cocco bacill
Coccus
Bacil
Coccus
Gram
(-)
(-)
(+)
(-)
Katalase
Motilitas
Reduksi
Nitrat
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
Fermentasi
As
glu lak
gas
(+) (+)
(+)
(+) (+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+) (+)
(-)
Sitrat
(+)
(+)
(+)
(+)
Berdasarkan pada ciri-ciri makro dan mikromorfologi serta uji-uji biokimiawi, ke
empat isolat adalah N2k. (Gambar 1), N2b (Gambar 2), N3 (Gambar 3), dan N5
(Gambar 4).
11 Biosfera 26 (1) Januari 2009
Gambar 1. Isolat N2k
Figure 1. N2k isolate
Gambar 3. Isolat N3
Figure 3. N3 isolate
Gambar 2. Isolat N2b
Figure 2. N2b isolate
Gambar 4. Isolat N5
Figure 4. N5 isolate
Pemanfaatan isolat-isolat tersebut sebagai agensia penghasil antihistamin dalam
produksi pakan ternak berkualitas masih memerlukan uji lanjut yaitu uji patologis.
Tahapan uji patologis ini penting untuk mengetahui potensi isolat-isolat bakteri tersebut
dalam menimbulkan penyakit. Hanya bakteri-bakteri yang tidak bersifat patogen yang
aman digunakan dalam proses produksi pakan.
Tabel 2 menunjukkan bahwa isolat N2k, N2b, dan N5 merupakan bakteri Gram
negatif, sedangkan N3 sebagai bakteri Gram positif. Hal ini sesuai pendapat Takahashi et
al. (2003) bahwa bakteri rumen mempunyai sifat Gram negatif dan positif. Semua isolat
bersifat non-motil. Hasil identifikasi bakteri pendegradasi histamin yang diperoleh
Takahashi et al. (2003) menunjukkan bakteri bersifat Gram negatif. Dari 37 isolat yang
diperoleh dan hasil PCR menunjukkan bahwa bakteri
menghasil histidinedecarboxylating merupakan bakteri Gram-negatif yang diduga Citrobacter braakii.
Sebagian besar bakteri penghasil histamin adalah bersifat Gram negatif seperti
Morganella morganii, Klebsiella spp., dan Enterobacter spp.
Uji lanjut adalah uji kemampuan isolat dalam menghasilkan enzim katalase yang
menunjukkan bahwa semua isolat positif menghasilkan katalase. Semua isolat diketahui
mampu menggunakan asam sitrat sebagai satu-satunya sumber C. Pengujian
kemampuan reduksi nitrat menunjukkan bahwa isolat N2b dan N5 mampu, sedangkan
N2k dan N3 tidak mampu mereduksi nitrat. Semua isolat kecuali N3 mampu
memfermentasi glukosa dan laktosa yang ditunjukkan dengan pembentukan asam.
Pembentukan gas dalam substrat gula ditunjukkan oleh isolat N2k dan N3, tetapi tidak
oleh N2b dan N5.
Kesimpulan
Penelitian menghasilkan 4 isolat yang menunjukkan kemampuan menggunakan
histamin. Hal ini diduga karena isolat-isolat tersebut menghasilkan Histamine Methyl
Transferase. Hasil identifikasi menunjukkan isolat terdiri dari 3 bakteri Gram negatif yaitu
N2k (Acinetobacter sp.), N2b (belum diketahui), N5 (belum diketahui) dan 1 isolat bakteri
Gram positif yaitu N3 (Corynebacterium sp.).
Iriyanti, dkk., Isolasi dan Identifikasi Mikroba Rumen Penghasil Antihistamin: 8 - 13
12
Ucapan Terima kasih
Artikel ini merupakan sebagian hasil penelitian yang didanai oleh Hibah
Fundamental tahun I (2007/2008). Terima kasih kami sampaikan kepada pemerintah
Republik Indonesia melalui Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi yang telah membiayai
penelitian ini.
Daftar Pustaka
Ahmed, F., 1991. Scrombroid (histamine) fish poisoning. Committee on evaluation of the
safety of fishery products, National Academy Press, Washington.
Barrow, G.H. and Feltham, R.K.A., 1993. Cowan and steel's manual for identification of
medical bacteria. Third edition. Cambridge University Press, Cambridge.
Brinker, C., Kerr, M., and Rayner, C., 2002. Investigation of biogenic amines in fish and
fish product. Feed Mix.2 1-17. Public health division. Victorian Government
Departemen of Human Services. Ed.1. www. Foodsafety.vic.gov.au
Greene,
1998.
Anti-histamine
organics.
http://www.dietitian.com/allergie.html.
Food,
herb,
vitamin
sources.
Halasz, A., Barath, A., Simon-Sarkadi, L., and Holzapel, W., 1994. Biogenic amines and
their production by micro-organism in food-Review. Trends in Food Science and
Tecnology, 5:42-49.
Holt, J.G., 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Lippincott
Williams & Wilkins, Baltimore.
Kim, S.H., An, H., and Price, R.J., 1999. Histamine formation and bacterial spoilage of
albacore harvested off the U.S. Northwest coast. Journal of Food Science, 64(2):
340-343.
Kerr, M., Lawicki, P., Aguirre, S. and Rayner, C., 2002. Effect of storage conditions on
histamine formation in fresh and canned tuna. Public health division. Victorian
Government Departemen of Human Services. Ed.1. www. Foodsafety.vic.gov.au.
Kose, S. and Hall, P.Q.G., 2003. Change in the level of histamine during processing
and storage of fish meal. Anim Feed Sci. and Tech., 107: 161-172
Marieb, E., 2001. Human anatomy and physiology. 5th Ed. Benjamin Cumming, San
Francisco.
Niven, C.C.G., Da Ponte, D.J.B., and Enes Dapkevivius, M.L.N., 1981. Storage
temperature effect on histamine formation in big eye tuna and skipjack. Jornal of
Food Science, 63(4): 644-647.
Pousti, A., Malihi, G., Bakhtiarian, A., and Abdollahi, Z., 2002. The comparative effect of
four anthistamines on isolated rat atria. Irianian Journal of Pharmacology and
Therapeutics, 1(2): 20-23.
Scoging, A.C., 1998. Scombrotoxic (histamine) fish poisoning in the United Kingdom.
Communicable Diseases and Public Health, 1(3): 204-205.
BSN., 2009. SNI
2354.10:2009: Cara uji kimia - bagian 10 - penentuan kadar histamin pada produk
perikanan dengan spektroflorometri dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)
pada produk perikanan ICS.67.050. Badan Standarisasi Nasional, Jakarta.
Takahashi, H., Kimura, B., Yoshikawa, M., and Fujii, T., 2003. Cloning and sequencing of
the histidine decarboxylase genes of Gram-negative, Histamine-producing bacteria
and their application in detection and identification of these organisms in fish. Appl
Environ Microbiol., 69(5): 2568–2579.
13 Biosfera 26 (1) Januari 2009
Taylor, S.L., 1986. Histamine food poisoning: toxicology and clinical aspects. Critical
reviews in toxicology, 17(2): 91-128.
Yoshinaga, D.H. and Frank, H.A., 1982. Histamine-producing bacteria in decomposing
skipjack tuna (Katsuwonas pelamis). Applied Environmental Microbiology, 4(2):
447-52.