Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase dari Sumber Air

Jurnal Penelitian Sains
Edisi Khusus Desember 2009 (D) 09:12-15
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase
dari Sumber Air Panas Danau Ranau Sumatera Selatan
Muharni
Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia
Intisari: Penelitian tentang isolasi dan identifikasi bakteri termofilik penghasil kitinase dari sumber air panas Danau
Ranau Sumatera Selatan dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan isolat bakteri termofilik penghasil kitinase. Bakteri diisolasi dari lokasi sumber air panas Kota Batu Kecamatan Banding Agung, Kabupaten Ogan Komering Ulu
Selatan dan skrining dilakukan dengan menggunakan media agar kitin. Hasil penelitian didapatkan dua isolat yang
mampu menghasilkan kitinase dengan indeks kitinolitik 0,89 dan 1,25. Berdasarkan karakteristik morfologi dan fisiologi
isolat, menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri termofilik penghasil kitinase yang diidentifikasi termasuk ke dalam genus
Bacillus
Kata kunci: kitinase, bakteri termofilik
Abstract: The research on isolation and identification of chitinase producing thermophilic bacteria from Lake Ranau
hot springs of South Sumatra has been done to get isolate of chitinase producing thermofilic bacteria. Bacteria were
isolated from Kota Batu hot springs, Banding Agung district, South OKU Residence and screening by chitin solid media.
The results of this research were found two isolates that can produce chitinase by chitinolytic index 0.89 and 1.25. Based
on morphological and physiological character, shows that both isolates chitinase producing thermofilic bacteria identified
as a member of genus Bacillus.
Keywords: chitinase, thermophilic bacteria
Desember 2009
1
PENDAHULUAN
ikroorganisme termofilik mampu mensintesis
M
molekul stabil pada kondisi panas, termasuk
molekul enzim. Bioteknologi umumnya tertarik pada
enzim dari mikroorganisme yang mendukung untuk
bekerja dibawah kondisi normal dimana enzim dari
mikroorganisme mesofilik akan mengalami denaturasi.
Dengan alasan inilah enzim ini menjadi sasaran termasuk kelayakannya sebagai model untuk penelitian dan
penyelidikan protein-protein yang bersifat termostabil dan kemampuannya sebagai biokatalis pada bioteknologi modern [1] .
Aplikasi enzim didalam bioteknologi semakin menuntut enzim yang bersifat tahan lingkungan. Karena
faktor utama yang paling merusak enzim adalah suhu,
maka usaha pertama yang akan dilakukan adalah mencari mikroba penghasil enzim-enzim termofilik dari
berbagai sumber alam [2] . Hal ini berkaitan dengan
keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi
dilakukan pada suhu tinggi, diantaranya adalah mengurangi kontaminasi, meningkatkan kecepatan transfer massa dan menurunkan viskositas dari larutan [3] .
Kitinase adalah enzim yang mendegradasi kitin
c 2010 FMIPA Universitas Sriwijaya
menjadi N-asetilglukosamin, degradasi kitin dapat
dilakukan oleh organisme kitinolitik dengan melibatkan enzim kitinase. Organisme pendegradasi kitin
umumnya berasal dari kelompok mikroorganisme diantaranya adalah dari kelompok bakteri. Bakteri
yang dilaporkan memiliki aktivitas kitinolitik adalah
seperti, Vibrio furnissi [4] , Serratia marcescens [5] ,
Bacillus circulans dan Pseudomonas aeruginosa [6] .
Enzim kitinase yang dihasilkan oleh mikroorganisme kitinolitik mempunyai potensi tinggi untuk
mendegradasi limbah yang mengandung kitin, karena
dengan adanya enzim kitinase memungkinkan konversi
kitin yang melimpah menjadi produk yang berguna.
Bakteri kitinolitik pada bidang pertanian berfungsi
sebagai agen biokontrol terhadap fungsi patogen
maupun serangga hama yang umumnya memiliki komponen kitin pada dinding selnya [4] .
Pada bidang farmasi aplikasi kitinase sangat potensial, dimana hidrolisis kitin oleh kitinase menghasilkan
N asetil glukosamin yang dapat dikonversi menjadi hexa-N-kitobiosa yaitu suatu oligosakarida yang
memiliki aktivitas antitumor [7] . Sedangkan di bidang
medis kitinase digunakan untuk terapi penyakit yang
disebabkan oleh fungi.
0912-15-73
Muharni/Isolasi & Identifikasi Bakteri . . .
Adanya mikroorganisme yang unggul merupakan
salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim. Oleh karena itu, penggalian mikroorganisme indigenous penghasil kitinase perlu dilakukan di Indonesia. Keragaman hayati yang tinggi memberikan peluang yang besar untuk mendapatkan mikroorganisme
yang potensial untuk dikembangkan sebagai penghasil
enzim [8] .
Mengingat pentingnya peranan kitinase dalam industri, maka berbagai usaha akan dilakukan untuk
meningkatkan produktivitas dan aktivitasnya antara
lain, mencari dan mengembangkan mikroorganisme
baru yang memiliki kemampuan memproduksi kitinase serta menseleksi strain mikroorganisme penghasil
kitinase yang tinggi.
Sumatera Selatan mempunyai beberapa sumber air
panas, salah satunya adalah Danau Ranau yang terletak 260 km dari Kota Palembang memiliki suhu air
panas berkisar antara 37, 3 − 63, 7◦ C yang berpotensi
untuk mendapatkan bakteri termofilik. Mengingat besarnya potensi pemanfaatan aktivitas kitinase pada
industri, maka perlu dilakukan penelitian untuk mencari isolat-isolat lokal yang selama ini belum banyak
dilakukan, khususnya dari ekosistem sumber air panas
Danau Ranau. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan
untuk mendapatkan isolat bakteri termofilik penghasil
kitinase dari sumber air panas Danau Ranau, Sumatera Selatan
2
2.1
JPS Edisi Khusus (D) 09:12-15
berukuran 250 ml. Sampel air yang telah diambil disuspensikan sebanyak 10 ml ke dalam 90 ml larutan fisiologis steril sampai homogen dan dilakukan pengenceran sampai 106 . Diambil 1 ml sampel dan dimasukkan
ke dalam cawan petri, kemudian dituangkan media
agar yang masih cair dan mempunyai suhu ±40◦ C sebanyak 10 ml. Setelah media membeku diinkubasi selama 48 -72 jam pada suhu 60◦ C. Koloni bakteri yang
tumbuh dan mempunyai karakter morfologi berbeda
ditetapkan sebagai isolat terpilih untuk dilanjutkan uji
aktivitas protease.
Seleksi Isolat Termofilik Penghasil Kitinase
Isolat-isolat yang diperoleh pada tahap isolasi, dipindahkan ke media agar kitin dengan cara dibotolkan,
dan biarkan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 60◦ C.
Isolat bakteri yang menghasilkan kitinase ditandai
dengan adanya zona bening disekitar koloni, selanjutnya zona bening yang terbentuk diukur diameternya
untuk ditentukan indeks kitinolitiknya. Semua isolat
bakteri termofilik yang menghasilkan kitinase selanjutnya akan dikarakterisasi.
Karakterisasi Bakteri Termofilik [9] Karakterisasi isolat bakteri termofilik penghasil kitinase meliputi, makroskopis koloni, mikroskopis sel, motilitas
dan uji biokimia
• Makroskopis koloni seperti, bentuk , elevasi dan
tepian koloni.
METODE PENELITIAN
• Mikroskopis sel seperti, bentuk sel, sifat Gram
dan ada tidaknya endospora.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - April
2007, di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Genetika & Bioteknologi Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Sriwijaya.
2.2
• Motilitas
• Uji Biokimia seperti, Hidrolisis pati, hidrolisis
kasein, fermentasi glukosa, fermentasi sukrosa,
fermantasi laktosa, produksi H2 S, produksi indol, produksi urease, produksi katalase, uji metil
merah, uji Voges-Prokauer, uji TSIA, uji Simmon’s sitrat.
Bahan yang digunakan
Bahan yang digunakan dalam penelitiaan ini antara lain, sampel air panas Danau Ranau, medium
Luria Bertani, medium agar kitin, media uji fisiologis
(medium triple sugar iron agar (TSIA), medium simon sitrat, medium indol, medium semi solid, medium
MR-VP broth, medium urea broth), reagen pewarnaan Gram (pewarna Gram A, Gram B, Gram C dan
Gram D) dan pewarna endospora (Malachite Green
dan Safranin).
Identifikasi Hasil karakterisasi dari masing-masing
isolat diidentifikasi dengan menggunakan Bergey’s
Manual of Determinative Bakteriology
3
3.1
2.3
Cara Kerja
Isolasi Bakteri Termofilik Sampel diambil dari
air yang berasal dari sumber air panas dengan cara
menggerus batu-batuan atau sedimen yang terdapat di
dalam air, lalu dimasukkan kedalam botol sampel yang
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik
Penghasil Kitinase
Hasil isolasi dan seleksi bakteri termofilik penghasil
kitinase dari sumber air panas Danau Ranau, diperoleh 8 isolat bakteri termofilik seperti yang terdapat
pada Tabel 1.
0912-15-74
Muharni/Isolasi & Identifikasi Bakteri . . .
Tabel 1: Hasil Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik Penghasil Kitinase
No Kode Aktivitas
Indeks
Isolat Kitinase Kitinolitik
1.
CN1
+
1,25
2.
CN2
-
-
3.
CN3
-
-
4.
CN4
-
-
5.
CN5
+
0,89
6.
CN6
-
-
7.
CN7
-
-
8.
CN8
-
-
JPS Edisi Khusus (D) 09:12-15
Kitin sebagai substrat juga akan menginduksi aktivitas enzim kitinase, enzim juga diatur melalui pengendalian genetis yang melibatkan induksi sintesis
enzim pada taraf genetis. Untuk terjadinya sintesis enzim dibutuhkan suatu induser yakni berupa substrat
atau senyawa yang sekerabat dengan substrat dari
reaksi yang dikatalis oleh enzim tersebut. Wang dan
Chang [11] menyatakan, bakteri menghasilkan kitinase
untuk menghidrolisis kitin yang akan dimanfaatkan
oleh mikroba sebagai sumber karbon.
3.2
Pada tabel 3.1 dapat dilihat bahwa sebanyak 8 isolat bakteri termofilik yang didapatkan hanya 2 isolat bakteri termofilik yang memiliki aktivitas kitinase, dengan indeks kitinolitik tertinggi pada isolat CN1 sebesar 1,25 dan yang terendah pada isolat
CN5 sebesar 0,89. Adanya aktivitas kitinase ditandai
dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni bakteri pada mdium agar kitin (Gambar 1). Zona bening
terbentuk karena terjadinya pemutusan ikatan β − 1, 4
homopolimer N-Asetilglukosamin pada kitin oleh kitinase menjadi monomer N-asetilglukosamin. Perbedaan indeks kitinolitik dari isolat disebabkan perbedaan aktivitas enzim kitinase dari masing-masing isolat tersebut. Susi [10] menyatakan bahwa, besarnya
zona bening yang dihasilkan tergantung pada jumlah monomer N-asetilglukosamin yang dihasilkan dari
proses hidrolisis kitin dengan memutus ikatan β −
1, 4 homopolimer N-Asetilglukosamin. Semakin besar
jumlah monomer N-asetilglukosamin yang dihasilkan
maka akan semakin besar zona bening yang terbentuk
di sekitar koloni
Karakterisasi Bakteri Termofilik
Penghasil Kitinase
Hasil karakterisasi makroskopis koloni, mikroskopis
sel, motilitas dan uji biokimia dari isolat bakteri termofilik penghasil protease dapat dilihat pada Tabel 2.
Hasil karakteristik makroskopis menunjukkan
bahwa bentuk koloni bulat dengan tepian bervariasi
serta elevasi low convex dan convex, mikroskopis sel
diketahui sel berbentuk batang, Gram positif dan
memiliki endospora, uji motilitas menunjukkan 1
isolat bersifat motil dan 1 isolat nonmotil, dan uji
biokimia semua isolat menunjukkan sifat fisiologis
yang sama. Berdasarkan karakter tersebut semua
isolat termasuk kedalam genus Bacillus.
Bacillus merupakan genus yang sering dijumpai dari
kelompok bakteri termofilik yang berhasil diisolasi
dari berbagai tempat yang bersuhu ekstrim. Seperti
yang telah dinyatakan oleh Brock & Madigan [12] ,
Bacillus merupakan jenis yang sering dijumpai pada
kisaran suhu yang luas. Bacillus mampu hidup pada
suhu minimum 30◦ C, optimum 60◦ C dan maksimum
72◦ C dan menghasilkan enzim secara ekstraseluler.
4
KESIMPULAN
Isolasi dan identifikasi bakteri termofilik penghasil
kitinase dari sumber air panas Danau Ranau Sumatera Selatan, diperoleh 2 isolat yang mampu menghasilkan kitinase dengan indeks kitinolitik tertinggi
sebesar 1,25 dihasilkan oleh isolat CN1, dan isolat CN5
dengan indeks kitinolitik sebesar 0,89. Kedua isolat
bakteri termofilik yang mampu menghasilkan kitinase
tergolong dalam genus Bacillus.
DAFTAR PUSTAKA
Gambar 1: Aktivitas kitinase isolat bakteri termofilik
pada medium agar kitin setelah 48 jam inkubasi pada suhu
60◦ C. Keterangan: 1 = isolat CN1, 2 = isolat CN5
[1]
Andrade, C.,M.M.C Nei Pereira Jr., & G. Antranikian,
1999, Extremely thermophilic microorganisms and their
polymerhidrolytic enzyme, a reviews, Department of
Technical Microbiology, Technical University Hamburg
Germany
[2]
Suhartono, M.T., 2000, Exploration Of Indonesian
Thermophiles Producing Thermostable Chitinolytic
Enzymes, Report, Research Center For Biotechnology,
Bogor Agric. University, Bogor
0912-15-75
Muharni/Isolasi & Identifikasi Bakteri . . .
JPS Edisi Khusus (D) 09:12-15
Tabel 2: Hasil karakterisasi bakteri termofilik penghasil kitinase
Karakter Isolat
Isolat CN1
Isolat CN2
Makroskopis koloni
Irreguler,
Circuler,
Echinulate ,
Echinulate ,
Crenate , Low
Entire ,
convex
convex
Mikroskopis Sel
Sel berbentuk batang, Sel berbentuk batang,
Gram positif,
Gram positif,
menghasilkan
menghasilkan
endospora
endospora
Motil
Nonmotil
- Hidrolisis pati
Positif
Positif
- Hidrolisis kasein
Positif
Positif
Motilitas
Uji Biokimia
- Fermentasi glukosa Negatif
Negatif
- Fermentasi sukrosa Negatif
Negatif
- Fermentasi laktosa
Negatif
Negatif
- Produksi H2 S
Negatif
Negatif
- Produksi Indol
Negatif
Negatif
- Produksi Urease
Negatif
Negatif
- Produksi Katalase
Positif
Positif
- Uji metil merah
Positif
Positif
- Uji V. Proskauer
Negatif
Negatif
- Uji Simmon’s sitrat Negatif
Negatif
Nama
Bacillus sp. 2
Bacillussp.1
[3]
Kamelia, R., M. Sidumarta dan D. Natalia, 2005, Isolasi
dan Karakterisasi Protease Intraselular Termostabil dan
Bakteri Bacillus stearothermophilus RP1 , Makalah
Seminar Nasional MIPA, FMIPA Universitas Indonesia,
Jakarta
[4]
Hirano, S., 1996, Chitin Biotechnology Applications,
Biotechnol Annu Rev, 2 : 237 - 258
[12]
[5]
Suzuki, K., Taiyoji, N. Sugawara, N. Nikaidou, B.
Henrissat, and T. Watanabe, 1999, The Third Chitinase
gene (chi C) of Serratia marcescens 2170 and the
Relationship of its Product to Other Bacterial Chitinases.
Biochem. J., 343 : 587 - 596.
[6]
Folders, J., J. Algra, M.C. Roelofs, C.L. Leendert, J.
Tommassen, and W. Bitter, 2001, Characterization of
Pseudomonas aeruginosa Chitinase a Gradually Secreted
Protein, J. Bacteriology, 183 : 7044-7052
[7]
Patil, R.S., V. Ghormade, and M.V. Deshpande, 2000,
Chitinolytic Enzymes Exploration, Enzyme and Microbiol.
Technol, 26 : 473-483
[8]
Akhdiya, A., 2003, Isolasi bakteri Penghasil Enzim
Protease Alkalin Termostabil, Jurnal Buletin Plasma
Nutfah, Vol.9, 7 hlm.
[9]
Cappuccino, J.G. & N. Sherman, 1992, Microbiology a
Laboratory Manual, 3rd Edition, The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.,
California, USA, 462 hlm.
[10]
[11]
Wang, S.L. and W.T. Chang, 1997, Purification and
Characterization of Two Bifungsional
Chitinases/Lysozymes Extracellularly Produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 in a Shrimp and Crab
Shell Powder Medium, Appl. And Environ. Microbial, 63
(2) : 380 - 386
Brock, T.D. & T.M. Madigan, 1991, Biology of
Microorganism, Sixth edition, Pretice hall. International,
Inc.
Susi, 2002, Isolasi Kitinase dari Scleroderma columnae dan
Trichoderma harzianum, Jurnal Ilmu Dasar, 3(1) : 30 - 35
0912-15-76