metode penelitian

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini berlangsung dari bulan Januari 2011 s.d. Februari 2012.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Embriologi Departemen Anatomi
Fisiologi dan Farmakologi dan UPT Hewan Laboratorium Fakultas Kedokteran
Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan mencit (Mus musculus albinus) betina
sebanyak 32 ekor dan jantan sebanyak 4 ekor berumur 8-10 minggu.
Metode Penelitian
Prosedur kerja penelitian ini adalah sebagai berikut:
a. Superovulasi
b. Koleksi sel telur
c. Koleksi embrio fertilisasi
d. Aktivasi partenogenetik
e. Kultur in vitro
f. Evaluasi embrio
Superovulasi
Superovulasi dilakukan dengan menyuntikkan hormon Pregnant Mare’s
Serum Gonadotropin (PMSG, Folligon®, Intervet, Netherlands) 5 IU secara
intraperitoneal untuk menstimulasi folikulogenesis. Kemudian 46-48 jam
setelahnya dilakukan penyuntikan hormon human Chorionic Gonadotropin (hCG,
Chorulon®, Intervet, Netherlands) 5 IU secara intraperitoneal untuk menginduksi
ovulasi.
Koleksi Sel Telur
Koleksi sel telur dilaksanakan pada 14-18 jam setelah penyuntikan hCG
(Otaegui et al. 1999). Koleksi sel telur dilakukan dengan cara menyayat ampula
tuba Falopii. Sel telur diletakkan dalam cawan petri dan dicuci sebanyak tiga kali
dalam medium M2 (Hogan et al. 1994). Sel telur yang masih dikelilingi oleh selsel kumulus ditempatkan dalam kombinasi M2 dengan hyaluronidase 0,02% dan
diinkubasi selama 5-10 menit hingga ikatan antara sel kumulus terlepas dan sel
telur dapat dikoleksi. Sel telur yang telah terlepas dari Cumulus Oocyte
Complexes (COC) dipindahkan ke dalam medium CZB tanpa glukosa kemudian
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% dengan suhu 37oC selama 10-20 menit.
Kemudian sel telur yang ada dihitung jumlahnya dan diamati sel telur berkualitas
baik dan kurang baik. Sel telur yang berkualitas baik (viable), ditunjukkan dengan
keadaan sitoplasma bulat dengan granulasi yang homogen sedangkan sel telur
berkualitas kurang baik ditunjukkan dengan keadaan sitoplasma yang fragmentasi
atau degenerasi (Rumiyati 2001).
Koleksi Embrio Fertilisasi
Mencit betina yang telah dilakukan superovulasi digabungkan dengan
mencit jantan dengan perbandingan 1:1. Identifikasi mencit betina yang telah
melakukan perkawinan dengan mencit jantan dilakukan dengan memeriksa
sumbat vagina (vaginal plug) 15-18 jam setelah penyuntikan hCG (Hine 2009).
Koleksi embrio dilakukan pada hari kedua setelah penyuntikan hCG
dengan mencacah tuba Falopii di dalam medium M2 menggunakan bantuan
mikroskop stereo. Embrio yang telah membelah menjadi dua sel atau lebih
dimasukkan ke dalam cawan petri dan dicuci sebanyak tiga kali dalam medium
Chatot Ziomec Bavister (CZB) tanpa glukosa.
Aktivasi Partenogenetik
Aktivasi partenogenetik menggunakan kombinasi medium CZB tanpa Ca2+
dan Mg2+ dengan cytochalasin B (Sigma, C6762, St. Louis, MO, USA) 5 µg/ ml
dan strontium chlorida (SrCl2) (Sigma, 255521, St. Louis, MO, USA) 10 mM
(Murti et al. 2009). Aktivasi dilakukan dengan tiga jenis perlakuan: 1)
menggunakan medium aktivasi tanpa HDACi, 2) kombinasi medium aktivasi
dengan TSA 5 nm, 3) kombinasi medium aktivasi dengan scriptaid 5 nm. Sel telur
dipindahkan ke dalam medium tetes sebanyak 50 µl pada masing-masing
perlakuan tersebut kemudian diinkubasi selama 6 jam dalam inkubator CO2 5%
dengan suhu 37oC.
Kultur In Vitro
Embrio yang telah teraktivasi dari masing-masing medium dipindah ke
medium CZB tanpa glukosa untuk kontrol positif, kombinasi CZB tanpa glukosa
dengan TSA untuk perlakuan pertama, dan kombinasi CZB tanpa glukosa dengan
scriptaid untuk perlakuan kedua kemudian diinkubasi selama 4 jam (Kishigami et
al. 2006) dalam inkubator CO2 5% dengan suhu 37 oC. Setelah itu, embrio
dikultur pada medium CZB tanpa glukosa dalam medium tetes sebanyak 50 µl
yang disiapkan dalam cawan petri 35 mm (Falcon 3002) dan ditutupi dengan
mineral oil (Sigma; M8410) (Haydar et al. 2001). Medium tetes tersebut
diekuilibrasi dalam inkubator CO2 5% dengan suhu 37oC selama semalam
sebelum dimasukkan embrio. Embrio dikultur hingga mencapai tahap 2-8 sel.
Setelah 48 jam, embrio yang telah membelah tersebut dipindah ke dalam medium
CZB glukosa dalam medium tetes sebanyak 50 µl yang disiapkan dalam cawan
petri 35 mm (Falcon 3002) dan ditutupi dengan mineral oil (Sigma; M8410)
hingga tahap blastosis.
Embrio hasil fertilisasi normal dikultur pada medium CZB tanpa glukosa
dalam medium tetes sebanyak 50 µl yang disiapkan dalam cawan petri 35 mm
(Falcon 3002) dan ditutupi dengan mineral oil (Sigma; M8410) (Haydar et al.
2001). Embrio dikultur hingga mencapai tahap blastosis.
Evaluasi Embrio
Evaluasi embrio dilakukan di bawah mikroskop inverted. Evaluasi pertama
yaitu mengamati pembentukan pronukleus pada 0 jam setelah aktivasi kemudian
dicatat jumlah embrio yang tidak membentuk pronukleus, membentuk 1
pronukleus, 2 pronukleus, lebih dari 2 pronukleus, serta immadiately cleavage.
Hal serupa dilakukan pula pada 4 jam setelah aktivasi. Selanjutnya, embrio yang
telah dikultur selama 24 jam diamati perkembangannya hingga 48 jam berikutnya.
Rancangan Penelitian
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak
lengkap. Penelitian ini terdiri atas kelompok fertilisasi in vivo (kontrol negatif),
kelompok aktivasi partenogenetik tanpa HDACi (kontrol positif), dan kelompok
aktivasi partenogenetik dengan HDACi (perlakuan). Kelompok kontrol negatif
adalah embrio yang dihasilkan dari proses fertilisasi normal secara in vivo.
Kelompok kontrol positif adalah embrio yang dihasilkan dari proses aktivasi
secara in vitro menggunakan medium aktivasi tanpa disertai penambahan HDACi.
Kelompok perlakuan adalah embrio yang dihasilkan dari proses aktivasi secara in
vitro menggunakan medium aktivasi dengan disertai penambahan HDACi.
Perlakuan pertama yaitu dengan penambahan TSA dan perlakuan kedua yaitu
dengan penambahan scriptaid. Penelitian dilakukan sebanyak tiga kali
pengulangan.
Respon yang diamati adalah viabilitas embrio sejak aktivasi hingga kultur.
Viabilitas embrio meliputi kelangsungan hidup berdasarkan morfologis embrio
dan keberhasilan perkembangan setiap tahapan embrio. Perkembangan tahapan
embrio ini dinilai dari kemampuan embrio membentuk pronukleus setelah
aktivasi. Perkembangan selanjutnya diamati setelah 24 dan 48 jam pada kontrol
positif dan perlakuan sedangkan pada kontrol negatif dilakukan setelah 48 dan 72
jam. Perkembangan embrio yang diamati mulai dari tahap pembelahan (cleavage)
(2 sel, 4 sel, dan 8 sel), morula, dan blastosis.
Kelompok
Kontrol negatif
Kontrol positif
Perlakuan
Fertilisasi Aktivasi tanpa HDACi
Aktivasi dengan TSA
Aktivasi dengan scriptaid
Gambar 5 Diagram kelompok penelitian
Superovulasi
Isolasi tuba
falopii
Koleksi sel telur
6 jam dalam
medium aktivasi
(kontrol positif)
4 jam dalam CZB
tanpa glukosa
6 jam dalam
medium aktivasi +
TSA (perlakuan 1)
(perlakuan
pertama)
4 jam dalam CZB
tanpa glukosa +
TSA
6 jam dalam
medium aktivasi +
scriptaid
(perlakuan 2)
(perlakuan kedua)
4 jam dalam CZB
tanpa glukosa +
scriptaid
Kultur dalam CZB tanpa glukosa hingga 8 sel (24 jam)
Kultur dalam CZB glukosa hingga blastosis (24 jam)
Gambar 6 Diagram rancangan penelitian aktivasi embrio partenogenetik
Gambar 7 Diagram rancangan penelitian embrio fertilisasi
Analisis Data
Data pembentukan pronukleus dan perkembangan embrio disajikan dalam
bentuk persentase dan dianalisis dengan sidik ragam (Anova). Perbedaan antar
perlakuan diuji dengan uji perbandingan berganda Duncan (DMRT, Duncan
Multiple Range Test). Perhitungan statistik dilakukan menggunakan perangkat
lunak SPSS ver. 16.0.