Metode Southern Blotting

Metode Southern Blotting
Elektroforesis
Melakukan elektroforesis DNA di dalam gel agarose (0.8% tanpa ethidium
bromida/ETDA)
.
DNA diwarnai dengan merendam gel (berDNA) di dalam larutan ETDA (0.5
mg/ml, 20-30’)
.
DNA divisualisasi di atas lampu transiluminator UV dan di buat foto gel
.
Gel hasil elektroforesis direndam dgn larutan depurinasi 0.25 M HCl (10’) ->
goyang dgn 10rpm -> bilas dgn akuades
.
Gel direndam dlm larutan denaturasi (0.5 M NaOH, 500 ml) -> goyang selama
20-30’ pada 10rpm -> bilas dgn akuades
.
Gel direndam dlm larutan netralisasi (1.5 M NaCl; 0.5 M Tris HCl pH 7.2 1 nM
EDTA) sebanyak 500 ml -> goyang selama 15’ -> bilas dgn akuades
Elektroforesis (cont..)
membran nitrocelulose disiapkan sesuai ukuran gel
.
Membran dipotong pada salah satu ujungnya (utk mengetahui orientasi
membran) -> diberi label dengan pensil
.
Membran dibasahi dgn 2X SSC dan diletakan di atas alat vacummgene
.
Gel diletakan diatas membran, -> tambahkan 20X SSC hingga tergenang ->
ditutup dengan plastik
.
Gel divacuum dgn 60 mBar ± 3jam
.
Membran diambil dan dimasukan ke dlm alat crosslinker utk memfiksasi DNA
di membran pada 1200 x 100 mJoule/cm2 selama 1’
.
Membran siap untuk dilakukan hibridisasi Souther blot
Pelabelan Probe
20 µl crosslinker solution diencerkan (+ 80 µl air)
.
DNA untuk label diencerkan smp konsentrasi 10 ng/µl
.
Ambil 10 µl sample DNA dan dimasukan ke eppendorf
.
Denaturasi dlm water bath 100°C selama 5’
.
Eppendorf didinginkan di es selama 5’ -> spin down
.
Menambahkan 10 µl buffer reaksi ke dlm eppendorf -> lalu di mix -> spin
down
.
Inkubasi pada suhu 37°C selama 30’ -> Probe siap digunakan/disimpan
Prehibridisasi
Pembuatan larutan buffer prehibridisasi :
Melarutkan NaCl 0.5 M dan 5% (b/v) blocking reagent ke dlm larutan
hibridisasi
.
Kocok dgn magnetic stearer selama 1jam pada suhu ruang
.
Masukan membran ke dlm tabung hibridisasi dgn posisi DNA pada bagian
dalam gulungan
.
Tambahkan SSC 3X sebanyak 5 ml
.
Buang larutan SSC 3X -> tambahkan 15-20 ml larutan buffer prehibridisasi ke
dalam tabung
.
Lakukan prehibridisasi selama 1 jam pada suhu 42°C
Hibridisasi
Larutan buffer prehibridisasi di dlm tabung
ditambahkan dgn DNA pelacak yang sudah
dilabel dengan pipet mikro.
.
Tabung eppendorf tempat DNA pelacak dibilas
dengan larutan prehibridisasi (supaya seluruh
pelacak dapat masuk ke dalam larutan
.
Hibridisasi dilakukan pada suhu 42°C
Washing
Memanaskan larutan pembilas pertama pada suhu 42°C di
dlm oven hibridisasi (lakukan 2X)
.
Ambil membran dari tabung dan masukan ke dlm wadah yang
berisi larutan pembilas kedua dgn pinset
.
Wadah diletakan diatas shaker dan guyang selama 5’ pada
suhu ruang (lakukan 2 kali)
.
Larutan pembilas kedua dlm wadah diganti dgn yang baru
.
Inkubasikan selama 5’ pada suhu ruang
Deteksi sinyal
larutan deteksi dibuat dgn mencampurkan detection reagent 1 dan 2 (1:1)
sebanyak 0.125 ml/cm2
Plastik wrap disiapkan di atas permukaan kaca yang rata -> teteskan larutan
deteksi
.
Buang kelebihan larutan kedua
.
Permukaan membran yang mengandung DNA disentuhkan (direndam) pada
tetesan cairan pendeteksi -> inkubasi selama 1’
.
Buang kelebihan larutan deteksi -> bungkus membran dgn plastik wrap
.
Letakan membran dalam kaset dengan permukaan yang mengadung
membran menghadap ke atas.
Deteksi Sinyal (cont..)
Letakan film autoradiografi ECL seukuran membran di atas membran dan di
press di dlm film cassete (pada ruang gelap)
.
Inkubasi pada suhu kamar selama 4 jam
.
Film diangkat dari film cassete dan dicuci dengan larutan developer (kondisi
gelap, suhu kamar, 5’)
.
Cuci film dgn larutan fixer (kondisi gelap, suhu kamar, 5’)
.
Bilas film dengan air (kondisi gelap, suhu kamar, 5’)
.
Film dikeringkan pada suhu kamar
.
Sinyal yang terdapat pada film diobservasi