Vol.14.No.1.Th.2007 Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila

Vol.14.No.1.Th.2007
Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)
Evaluation of non-specific defence of Tilapia (Oreochromis sp) injected with LPS
(Lipopolysaccharides) of Aeromonas hydrophilla.
Sri Dwi Hastuti *
Jurusan Perikanan, Fakultas Peternakan – Perikanan, Universitas Muhammadiyah Malang
Jl. Raya Tlogomas No.246 Malang, Telp. (0341) 464318
ABSTRACT
Background : Intensif farming of Tilapia often resulted in the diseases causing by microorganisms wheter bacteria or
viruses. Using antibiotic as a terapeutic agents found ineffective, therefore the new alternatif for combating diseases
problem in aquaculture is needed. It has been known that fish has nonspecific defence which can be stimulated with
immunostimulant such as LPS extracted from gram negative bacteria. Hence, this research is important to evaluate the
effect of LPS injection with different dosage to hematocrite, leucocrite, and NBT (Nitroblue Tetrazolium) of Tilapia
blood.
Method : Method using in this research was experiment with completed randomized design, whereas data analized with
ANAVA.
Conclusion : From the research it can be found that hematocrite level and NBT (Nitroblue Tetrazolium) activity
increase with the increase of LPS dosage, while leucocrite level was fluctuated. It is suggested that parameter measured
were influenced by physiological condition of fish at the time sampling and fish size.
Key words : Nonspecific defence mechanism, Hematocrite, Leucocrite, NBT (Nitroblue Tetrazolium) activity
Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp) yang Diinjeksi dengan LPS
(Lipopolysaccahrida) Bakteri Aeromonas hydrophila.
ABSTRAK
Latar Belakang : Pada budidaya ikan nila secara intensif seringkali ditemukan serangan penyakit yang diakibatkan
oleh bakteri atau virus. Penanggulangan dengan antibiotik seringkali tidak efektif, sehingga perlu alternatif baru dalam
pemecahan masalah penyakit ini. Diketahui bahwa ikan mempunyai respon kekebalan non spesifik yang bisa
dirangsang dengan pemberian immunostimulant seperti LPS dari bakteri. Diharapkan LPS yang diberikan dapat
meningkatkan respon kekebalan non spesifik pada ikan sehingga meningkatkan resistensinya terhadap serangan
patogen. Oleh karena itu penelitian ini perlu dilakukan untuk mengevaluasi sistem kekebalan non spesifik pada ikan nila
pada penyuntikan dosis LPS yang berbeda dengan melihat indikator-indikator seperti hematokrit dan leukokrit, NBT,
dan total protein plasma pada darah ikan yang disampling.
Metode : Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen dengan rancangan acak lengkap (RAL).
Sementara data yang diperoleh akan dianalisa dengan ANAVA (Analisa Variansi).
Kesimpulan : Untuk level hematokrit didapatkan hasil bahwa semakin tinggi dosis LPS yang disuntikkan maka level
hematokritnya semakin tinggi pula, dan pola ini ditemui juga pada kekebalan non spesifik ikan dalam aktivitas
NBTnya. Level leukokrit didapatkan hasil yang fluktuatif dan setelah diuji ANAVA ternyata tidak berbeda. Hal ini
karena hasil sangat dipengaruhi oleh kondisi fisiologis ikan ketika disampling dan ukuran ikan.
Kata Kunci : Sistem pertahanan non spesifik, Hematokrit, Leukrokit, aktivitas NBT (Nitroblue Tetrazolium)
* Jurusan Perikanan, Fakultas Peternakan – Perikanan, Universitas Muhammadiyah Malang
79
Hastuti
PENDAHULUAN
Salah satu jenis ikan air tawar yang banyak
dibudidayakan di Indonesia adalah ikan nila gift
(Oreochromis sp). Jenis ikan ini banyak disukai
oleh konsumen dan permintaannya terus tinggi
walaupun banyak jenis ikan budidaya lain sebagai
pilihan. Sudah sejak lama ikan nila dibudidayakan
secara intensif, dan biasanya pada budidaya
intensif kemunculan serangan penyakit seringkali
ditemukan. Tingginya padat tebar dan pakan
yang digunakan menjadi pendorong bagi
timbulnya penyakit akibat menurunnya kualitas
air karena timbunan bahan organik dari sisa pakan
maupun ekskresi ikan. Sementara itu ikan menjadi
stress sehingga rentan terhadap serangan penyakit,
khususnya penyakit infeksius seperti yang
disebabkan oleh bakteri (Angka, 1990) maupun
virus.
Upaya penanggulangan penyakit yang
disebabkan bakteri Aeromonas hydrophila telah
banyak dilakukan baik dengan cara pengobatan
dengan antibiotik maupun memakai cara
pencegahan dengan vaksin untuk meningkatkan
kekebalan ikan terhadap serangan bakteri patogen.
Pada umumnya studi yang dilakukan dalam
bidang imunologi ikan kebanyakan didasarkan
pada
produksi
antibodi,
namun
pada
kenyataannya beberapa penelitian tidak dapat
mendeteksi keberadaan antibodi pada ikan yang
diimunisasi dengan bakteri A. hydrophila (Baba,
et.al., 1988). Beberapa penelitian menunjukkan
bahwa antigen dari A. hydrophila dapat
merangsang mekanisme pertahanan tubuh nonspesifik pada ikan melawan berbagai macam
bakteri dari genus Aeromonas (Stevenson, 1988;
Karunasagar, et.al., 1991).
MATERI DAN METODE PENELITIAN
Ikan nila gift, dalam penelitian ini
digunakan ikan nila gift dengan ukuran panjang
lebih kurang 10 – 12 cm berasal dari satu induk
dan berada dalam kondisi sehat. Alkohol
digunakan untuk mensterilkan alat-alat. Aquadest
sebagai pelarut bahan atau media. Nutrient Broth
(NB) sebagai media kultur bakteri. Phosfat Buffer
Saline (PBS). Minyak cengkeh. EDTA atau
heparin. Tabung kapiler hematokrit. Nitroblue
Tetrazolium (NBT). Bovine Serum Albumine
(BSA) 100 mg/ml. Protein test kit (Biorad).
Pakan ikan yang digunakan adalah pakan buatan
80
Jurnal Protein
berbentuk pellet yang besarnya disesuaikan
dengan lebar bukaan mulut benih ikan. Alat-alat
penelitian yang digunakan Pinset untuk
mengambil bahan yang berukuran kecil.
Timbangan analitik untuk mengukur berat media.
Inkubator untuk menumbuhkan bakteri pada suhu
yang sesuai dengan persyaratan pertumbuhannya.
Kulkas untuk menyimpan menyimpan biakan
bakteri dan LPS. Spuit 1ml dan jarum suntik
untuk injeksi ikan dan sampling darah ikan. Pipet
mikro dan tipnya untuk pengambilan bahan.
Erlenmeyer untuk wadah saat memasak media
agar untuk bakteri. Pembakar Bunsen untuk
sterilisasi jarum ose pada saat kultur bakteri.
Akuarium sebagai wadah pemeliharaan ikan
selama penelitian, Coverslip, Tabung appendorf,
Spektrofotometer untuk pengukuran aktivitas
NBT dan total protein plasma, Penggaris untuk
mengukur level hematokrit, Autoclaf untuk
sterilisasi alat dan media, Aerator digunakan
untuk menyediakan oksigen pada air media
pemeliharaan, Filter : untuk menjaga kondisi
kualitas air dalam aquarium tetap bersih. Metode
penelitian yang digunakan adalah metode
eksperimen. Pada metode ini, percobaan ditujukan
untuk melihat suatu hasil yang menggambarkan
hubungan kausal variabel-variabel yang diselidiki
(Surakhmad,
1989),
dengan
melakukan
serangkaian percobaan untuk melihat suatu hasil.
Hasil tersebut akan menjelaskan bagaimana
kedudukan hubungan antara variabel yang
diselidiki. Tujuan dari penelitian eksperimen
adalah untuk menyelidiki kemungkinan saling
hubungan sebab akibat dengan cara mengenakan
kepada satu atau lebih kelompok eksperimen, satu
atau lebih kondisi perlakuan dan membandingkan
hasilnya (Suryabrata, 1995). Teknik pengambilan
data dilakukan dengan cara observasi langsung,
yaitu pencatatan pengamatan secara sistematik
fenomena-fenomena
yang
diselidiki
baik
pengamatan itu dilakukan dalam situasi yang
sebenarnya maupun situasi buatan yang khusus
diadakan (Surakhmad, 1989).
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Level Hematokrit dan Leukokrit
Kondisi kesehatan ikan dapat diketahui
dari pemeriksaan darah, yaitu dengan melihat
perbandingan
jumlah
eritrosit
dan
leukositnya.
Untuk
mengetahui
level
hematokrit dan leukokrit digunakan tabung
Vol.14.No.1.Th.2007
Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)
kapiler darah. Sampel darah dimasukkan
dalam tabung kapiler kemudian dilakukan
sentrifugasi sehingga terjadi pemisahan antara
sel darah merah, sel darah putih dan
plasmanya. Pengukuran dilakukan dengan
mengukur panjang masing-masing lapisan
dengan
menggunakan
mistar.
Level
hematokrit ditentukan dengan cara hasil
pengukuran panjang pada bagian sel darah
merah dibagi dengan total panjang darah pada
tabung kapiler kemudian dikalikan 100%,
sehingga didapatkan level hematokrit dalam
bentuk persen. Cara ini juga berlaku untuk
penentuan level leukokrit. Hasil pengukuran
terhadap level hematokrit ikan uji disajikan
pada gambar di bawah ini :
Level Hematokrit (%)
Level Hematokrit
23,33
25,00
19,81
20,00
15,37
13,07
15,00
10,00
5,00
0,00
1
Dosis LPS (0,25%,50%,100%)
Gambar 1. Level Hematokrit Ikan Uji selama Penelitian
Volume sel darah merah dalam darah
ikan dapat menggambarkan kesehatan ikan.
Pada ikan Rainbow Trout yang sehat level
hematokritnya sekitar 30-40% (Anderson dan
Siwicki, 1994). Pada studi ini level hematokrit
yang dimiliki oleh ikan uji pada beberapa
perlakuan menunjukkan bahwa semakin
tinggi dosis nampaknya level hematokritnya
semakin meningkat. Namun demikian level
hematokrit yang dihasilkan masih tergolong
rendah jika dibandingkan dengan hematokrit
pada ikan Rainbow Trout sehat. Sayangnya
belum ada penelitian yang bisa dijadikan
acuan untuk level hematokrit pada ikan nila
gift.
Anderson
dan
Siwicki
(1994)
menyatakan
bahwa
pemberian
Immunostimulant
mempunyai
pengaruh
terhadap persentase hematokrit walaupun
tidak begitu besar. Semakin tinggi level
hematokrit yang dihasilkan menunjukkan
bahwa semakin tinggi dosis penyuntikan
maka imunostimulant semakin efektif dalam
merangsang sistem kekebalan ikan nila. Level
hematokrit untuk masing-masing individu
bisa dipengaruhi oleh kondisi ikan awal dan
penanganan saat penyamplingan darah ikan
yang dapat menyebabkan stress sehingga akan
menurunkan level hematokrit. Selanjutnya
dikatakan bahwa ikan yang mengalami
anemia mempunyai persentase hematokrit
serendah-rendahnya adalah 10%. Rendahnya
hematokrit
juga
dapat
menunjukkan
terjadinya kontaminasi, ikan kekurangan
makan, kandungan protein pakan rendah,
kekurangan vitamin atau terjadi infeksi.
Hematokrit yang tinggi dapat menunjukkan
juga adanya kontaminan, adanya masalah
osmolarity dan stress. Fujaya (2004)
menyatakan bahwa ada korelasi yang kuat
antara hematokrit dan jumlah hemoglobin
darah, semakin rendah jumlah sel-sel darah
merah, maka semakin rendah pula kandungan
hemoglobin dalam darah.
Tabel 1. Level Leukokrit Ikan Uji Selama Penelitian
ULANGAN
DOSIS LPS
TOTAL Rata-rata
1
2
3
0%
11,11 7,69
7,27
26,07
8,69
25 %
10,34 8,88
2,32
21,54
7,18
50 %
1,66
3,22
6,25
11,13
3,71
100 %
TOTAL
5,00
4,16
18,75
27,91
86,65
9,30
81
Vol.14.No.1.Th.2007
Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)
Hasil pengukuran leukokrit pada ikan
nila
uji
menunjukkan
adanya
ketidakkonsistenan dari leukokrit ikan akibat
pengaruh penyuntikan LPS. Dapat dilihat
pada tabel diatas Leukokrit tertinggi diperoleh
pada perlakuan dosis LPS 100%, namun pada
dosis LPS 50% leukokrit ditemukan yang
terendah, sementara pada konsentrasi 0%
(tanpa LPS) leukokritnya hampir mendekati
nilai pada dosis 100%. Leukokrit yang rendah
bisa disebabkan oleh infeksi kronis, kualitas
nutrisi rendah, kekurangan vitamin dan
adanya
kontaminan.
Sementara
itu
meningkatnya leukokrit bisa menunjukkan
adanya infeksi pada tahap awal atau ikan
dalam kondisi stress. Kondisi leukokkrit ikan
juga sangat tergantung pada kondisi ikan pada
saat disampling, lama waktu antara sampling
dan pengukuran darah serta prosedur
pengukuran yang digunakan (Anderson dan
Siwicki, 1994). Dari data diatas kemudian
dianalisis dengan ANAVA.
Level leukokrit dalam darah ikan dapat
memberikan petunjuk tentang kesehatan ikan
dan menentukan adanya ketidaknormalan
karena pengaruh pemberian imunostimulant.
Hasil
penelitian
menunjukkan
bahwa
leukokrit
pada
berbagai
perlakuan
menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata
diantara perlakuan setelah diuji ANAVA.
Oleh karena itu tidak dilanjutkan dengan Uji
BNT.
2. Aktivitas NBT
NBT akan direduksi oleh formazan
pada reaksi dengan radikal oksigen yang
diproduksi dari neutrofil dan monosit. Analisa
produksi
radikal
oksigen
dengan
menggunakan NBT (nitroblue tetrazolium)
dilakukan
dengan
menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombag
540 nm. Hasil pengamatan Aktivitas NBT
dapat dilihat berikut ini :
Aktivitas NBT pada OD
540
Aktivitas NBT
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
-
0,615
0,421
0,514
0,485
Series1
Series2
Series3
Series4
1
Dosis LPS (0, 25, 50 100 persen)
Gambar 2. Aktivitas NBT
Berdasarkan
hasil
pengukuran
diperoleh data bahwa semakin meningkat
dosis penggunaan LPS maka aktivitas NBT
semakin meningkat. Hasil tertinggi didapat
pada perlakuan penyuntikan dengan dosis
100% LPS diikuti dengan dosis 50 %, 25 %
dan ikan uji tanpa LPS menunjukkan aktivitas
NBT yang paling rendah.
Semakin tingginya nilai aktivitas NBT
menunjukkan bahwa produksi radikal oksigen
bebas semakin besar. Produksi radikal bebas
ini digunakan untuk melawan patogen.
Sebagaimana dikatakan oleh Irianto (2005)
bahwa
ikan
mempunyai
mekanisme
membunuh oleh sel-sel fagosit melalui
oksigen bebas dalam vakuola lisosom yang
93
mampu meningkatkan permeabilitas sel
bakteri sehingga bisa menyebabkan masuknya
substansi dan cairan dalam sel bakteri yang
kemungkinan bisa menyebabkan plasmolisis.
Radikal oksigen toksik ini dengan cepat
dikonversi menjadi hidrogen peroksida
(H2O2) yang memiliki sifat bakterisidal yang
kuat. Selain itu radikal oksigen yang bersifat
toksik terhadap patogen ini kemungkinan pula
dikonversi menjadi radikal hidroksi (OH-)
yang memiliki kemampuan mendegradasi
membran lipid. Penurunan aktivitas NBT
mengindikasikan adanya kontaminan dan
infeksi yang kronis atau ikan sedang dalam
kondisi stress. Peningkatan NBT dapat
mengindikasikan
bahwa
perlakuan
Vol.14.No.1.Th.2007
Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)
penyuntikan LPS telah efektif merangsang
sistem kekebalan tubuh ikan (Anderson dan
Siwicki, 1994). Neutrofil dan sel fagositik
yang
teraktivasi
dapat
menghasilkan
absorbance 20-30% lebih tinggi, yang
menunjukkan produksi oksigen radikal yang
lebih tinggi untuk pertahanan terhadap
penyakit.
3. Total Protein Plasma
Pengukuran total protein plasma
dilakukan berdasarkan metode kolorimetri
yang mendeteksi sejumlah nitrogen dalam
bentuk asam amino. Pengukuran total protein
plasma
dilakukan
dengan
metode
spektrofotometrik pada panjang gelombang
595 dan kemudian dibandingkan antara
sampel dengan standar BSA (Bovine Serum
Albumine). Pada pengukuran total protein
plasma ini didapatkan hasil larutan yang
berwarna biru setelah ditambahkan dengan
serum dan protein test kit (Biorad) sementara
untuk kurva standard yang dipakai adalah
larutan standar BSA. Tabel hasil pengukuran
total protein plasma ikan yang telah diinjeksi
LPS dapat dilihat pada tabel 7 berikut ini :
Tabel 2. Hasil Pengukuran Total Protein Plasma pada OD 595 nm (mg/ml)
ULANGAN
DOSIS
TOTAL
Rata-rata
1
2
3
0%
1.064,30 1.016,40 1.044,80 3.125,50
1.041,83
25 %
861,83 1.064,30 1.094,00 3.020,13
1.006,71
50 %
616,02 1.178,10 1.114,20 2.908,32
969,44
100 %
1.083,80 716,37
952,80
2.752,97
917,66
TOTAL
11.806,92
Dari hasil pengukuran tentang total
protein plasma didapatkan bahwa semakin
tinggi dosis LPS yang diinjeksikan ternyata
total protein plasmanya semakin menurun.
Hal ini tidak sesuai dengan teori dan beberapa
studi yang telah dilakukan berkenaan dengan
hubungan antara level hematokrit, leukokrit,
aktivitas NBT dan total protein plasma yang
menyatakan bahwa pada umumnya semua
indikator kesehatan ikan tersebut mempunyai
korelasi yang positif, dimana peningkatan
hematokrit, leukokrit, dan NBT biasanya akan
diikuti oleh peningkatan aktivitas kekebalan
non-spesifik yang lainnya (Anderson, 2005).
Setiap jenis ikan mempunyai respon yang
berbeda
terhadap
penyuntikan
LPS
dibandingkan pada hewan mamalia (Berczi,
1998).
Konsentrasi total protein plasma sangat
tergantung pada umur dan kondisi individu
ikan yang disampling. Penurunan total protein
plasma mengindikasikan infeksi kronis, dan
rendahnya protein dalam pakan ikan.
Sementara peningkatan total protein plasma
merupakanb respon terjadinya infeksi atau
respon pemberian stimulant dan vaksin. Total
protein pada ikan yang sehat biasanya
berkisar antara 30-50
(Anderson dan Siwicki).
mg/ml
plasma
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Dari hasil penelitian tentang evaluasi
pertahanan non spesifik pada ikan nila gift yang
diinjeksi LPS bakteri menunjukkan bahwa dari
pengukuran terhadap darah ikan didapatkan hasil
yang tidak konsisten. Untuk level hematokrit
didapatkan hasil bahwa semakin tinggi dosis LPS
yang disuntikkan maka level hematokritnya
semakin tinggi pula, dan pola ini ditemui juga
pada kekebalan non spesifik ikan dalam aktivitas
NBTnya. Level leukokrit didapatkan hasil yang
fluktuatif dan setelah diuji ANAVA ternyata tidak
berbeda, demikian pula pada total protein plasma.
Hal ini karena hasil sangat dipengaruhi oleh
kondisi fisiologis ikan ketika disampling, umur
ikan dan waktu antara sampling dengan
pemeriksaan darah.
Saran
Perlu adanya pengamatan darah ikan
lengkap tidak hanya pada satu waktu tetapi darah
disampling beberapa kali sehingga dapat diketahui
perubahan-perubahan yang terjadi dan dapat
83
Hastuti
diketahui sampai berapa lama LPS efektif
memberikan respon kekebalan pada ikan nila gift.
Jurnal Protein
Yeast Glucan in Atlkantic Salmon (Salmo
salar L. Journal of Fish Disease. 16: 313325
DAFTAR PUSTAKA
1. Anderson, D. P. and A.K. Siwicki. !994.
Simplified Assays For Measuring Non
Spesific Defense Mechanisms in Fish.
2. Baba, T., Imamura, J., Izawa, K. 1988. Immune
protection in Carp (Cyprinus carpio L.)
After Immunization with Aeromonas
hydrophila Crude Lipopolysaccharide.
Journal of Fish Diseases, 11 : 237-244
3. Dalmo, R.A., B. Martinsen T.E. Horsberg, A.
Ramstad, C. Syvertsen, R. Seljelid, and K.
Ingebrigtsen. 1998. Prophylactic Effect of
B-1,3-D- glucan (laminaran) Against
Experimental Aeromonas salmonicida and
Vibrio salmonicida Infection. Journal of
Fish Disease 21:459-462
4. Irianto, A. 2005. Patologi Ikan Teleostei.
Gadjah
Mada
University
Press.
Yogyakarta.
5. Isnansetyo, A. 2006. Evaluasi Pertahanan Non
Spesifik Ikan. LAboratorium Hama Dan
Penyakit Ikan Jurusan Perikanan , Fakultas
Pertanian Universitas Gajah Mada.
6. Isnansetyo, A dan Triyanto. 2006. Sistem
Pertahanan Non Spesifik pada Ikan.
Fakultas Pertanian. UGM
7. Jorgensen, JB, H.Lunde and B. Robertsen,
1993. Peritoneal and head Kidney Cell
Response to Intraperitoneally Injected
84
8. Karunasagar, I., Rosalind, G., Karunasagar, I.
1991. Immunological Response of The
Indian Major Carps to Aeromonas
hydrophila Vaccine. Journal of Fish
Diseases, 14: 413-417
9. Kim, H.K, Y.J. Hwang, and S.C. Bai. 1999.
Resistance to Vibrio algynoliticus in
Juvenile Rockfish (Sebastes schlegeli) Fed
Diets Containing Different Doses of Aloe.
Aquaculture. 180:13-21
10. Kresno, B.S.2001. Imunology: Diagnosis dan
Prosedur Laboratorium .Ed 4. Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia.
11. Matsuyama, H., REP Mangindaan, and T.
Yano. 1992. Protective Effect of
Schizophyllan and Scleroglucan Against
Sterptococcus sp infection in Yellowtali
(Seriola quinqueradiata). Aquaculture.
101:197-203
12. Nitimulyo, K.H; A.Isnansetyo; Triyanto; M.
Murdjani; L. Sholichah. 2005. Effetiveness
of Polyvalen Vaccine to Control Vibriosis
in
Humback
Grouper
Cromileptes
altivelis). Journal Of Fisheries Sciences.
Vol VII No 2, Juli 2005.
13. Sakai, M., K Taniguchi1, K Mamoto2, H
Ogawa2 and M Tabata2. Immunostimulant
effects of nucleotide isolated from yeast
RNA on carp, Cyprinus carpio L. Journal
of Fish Diseases 2001, 24, 433-438