iii. metode penelitian

 17 III.
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Lingkungan Departemen
Budidaya Perairan, Institut Pertanian Bogor dan dilaksanakan selama 3 (tiga)
bulan dimulai dari bulan Februari sampai Mei 2011. Untuk analisis gambaran
darah dan glukosa darah dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan (LKI)
Departemen Budidaya Perairan ,Institut Pertanian Bogor.
3.2 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian dilaksanakan dalam dua tahapan yaitu : uji akut dan uji sub
kronis. Ikan uji yang digunakan adalah juvenil ikan kerapu macan (Epinephelus
fuscogutattus) berukuran 6-7 cm yang diperoleh dari Balai Benih Situbondo Jawa
Timur sedangkan pakan yang digunakan adalah pelet ( komersil) dan logam
berat timbal yang digunakan adalah timbal nitrat (Pb(NO3)2) yang diperoleh di
toko Setia Guna Bogor. Wadah yang digunakan dalam penelitian ini berupa
akuarium 20 x 20 x 30 cm, ukuran 30 x 30 x 30 cm, refraktometer, DO meter, pH
meter, termometer dan gelas ukur.
3.3 Uji Akut
Uji akut dilakukan berdasarkan konsentrasi yang diperoleh pada uji nilai
kisaran kemudian ditentukan konsentrasi untuk perlakuan uji akut berdasarkan
deret angka sebagai berikut:
Perlakuan A = Tanpa Perlakuan timbal
Perlakuan B = 20 ppm
Perlakuan C = 40 ppm
Perlakuan D = 80 ppm
Perlakuan E = 160 ppm
Pada tahap ini digunakan 150 ekor hewan uji dengan kepadatan ikan uji 10
ekor dalam setiap unit percobaan dengan 3 kali ulangan. Selama uji akut pada
akuarium diberi aerasi kecil, feses dan sisa pakan di dasar akuarium disipon setiap
hari. Pengamatan terhadap tingkah laku dan mortalitas ikan uji dilakukan setiap 2
18 jam selama 24 jam kemudian dilanjutkan tiap 6 jam selama 96 jam. Indikator
pengamatan tingkah laku ikan uji yaitu gejala Ram Jet Ventilation (mulut terbuka
secara terus menerus, dan tutup ikan terabduksi), frekuensi pernapasan yaitu gerak
membuka dan menutup insang/mulut per menit (perhitungan dimulai 30 menit
setelah pemberian bahan uji, dan selanjutnya dibandingkan dengan kontrol), pola
gerak renang dan refleksi (normal, diam di dasar, ke permukaan, tidak seimbang,
terkejut-kejut atau kehilangan gerak reflex) dan perubahan warna sisik.
Penghitungan gerak operculum akan dimulai 30 menit setelah pemberian bahan
uji, penghitungan akan dilakukan selama 1 menit dan diulangi setiap 10 menit
sampai menit ke 30.
Pengukuran kualitas air media pada setiap unit percobaan dilakukan pada
jam ke-0, 24, 48, 72 dan ke-96.
3.4 Uji sub-kronik
Penelitian ini akan dilakukan untuk melihat pengaruh konsentrasi timbal
terhadap tingkat konsumsi oksigen (TKO), Kondisi hematologi, Kelangsungan
hidup dan laju pertumbuhan. Uji ini dilakukan dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan
yaitu :
Perlakuan A = Tanpa timbal (sebagai kontrol)
Perlakuan B = 1 % dari LC50-96 jam
Perlakuan C = 5 % dari LC50-96 jam
Perlakuan D = 10 % dari LC50-96 jam
Pada tahap ini digunakan ikan uji sebanyak 240 ekor dengan masingmasing unit sebanyak 20 ekor. Percobaan dirancang dengan menggunakan
Rancangan Acak Lengkap (RAL),
Uji pengaruh logam timbal ini dilakukan
selama 30 hari. Variabel yang diamati adalah : Tingkat Konsumsi Oksigen,
glukosa darah,
respon hematologi (hematokrit, hemoglobin, eritrosit dan
leukosit), kelangsungan hidup, laju pertumbuhan, kandungan logam berat timbal
dalam daging ikan dan air laut serta pengukuran parameter kualitas air.
19 3.4.1 Tingkat Konsumsi Oksigen
Tingkat konsumsi oksigen diukur dengan menggunakan botol respirasi
pada akhir penelitian dengan menghitung rasio oksigen terlarut pada awal dan
akhir pengamatan. Tingkat konsumsi oksigen dihitung menggunakan rumus Liao
dan Huang (1975) :
TKO = { (DO awal – DO akhir)/W x t} x V
Keterangan :
TKO
= Tingkat Konsumsi Oksigen (mg O2/gr tubuh/jam)
DO awal = Oksigen terlarut pada awal pengamatan (mg/L)
DO akhir = Oksigen terlarut pada akhir pengamatan (mg/L)
W
= Berat Ikan Uji (gr)
t
= periode pengamatan (jam)
V
= Volume air pada respirometer (L)
3.4.2 Kadar Glukosa Darah
Pemeriksaan kadar glukosa darah ikan dilakukan sebagai indikator stress
sekunder akibat toksisitas Timbal. Pengukuran kadar glukosa darah ini sebanyak
4 kali yaitu pada hari ke 0, 10, 20 dan hari ke-30. Sebelum pengambilan darah,
ikan dipuasakan selama 24 jam. Prosedur pengukuran glukosa darah yaitu: plasma
darah diambil dengan cara disentrifuge, selanjutnya 0,05 ml plasma darah,
glukosa standard dsan akuades dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi
yang telah berisi 3,5 ml color reagent (perbandingan asam asetat dan ortotoluidine
= 94:6). Setelah itu dipanaskan dalam water bath tertutup selama 10 menit pada
suhu 100 ⁰C. Selanjutnya setelah didinginkan pada suhu kamar, lalu dibaca
dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 635 nm. Rumus
yang digunakan adalah :
GD = Au x Cs
As
Keterangan :
GD
: Konsentrasi Glukosa darah (mg/100 ml)
Au
: Absorbansi sampel
Cs
: Konsentrasi standar
As
: Absorbansi standar
20 3.4.3 Gambaran Darah
•
Pengukuran kadar hematokrit
Prosedur pengamatan dan penghitungan kadar hematokrit dilakukan menurut
Anderson dan Swicki (1993). Menggunakan Microhematocrit method, darah
dimasukkan kedalam tabung mikrohematokrit sampai 4/5 bagian. Kemudian salah
satu ujung tabung disumbat dengan crestaseal. Darah disentrifuge selama 5 menit.
Setelah itu akan terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri dari lapisan plasma yang
jernih dibagian atas, kemudian lapisan putih abu-abu (buffy coat) yang merupakan
trombosit dan leukosit dan lapisan eritrosit yang berwarna merah. Nilai hematokrit
ditentukan dengan mengukur presentase volume eritrosit dari darah dengan
menggunakan alat ukur panjang (mistar) dan dinyatakan dalam persentase (% Ht).
•
Pengukuran kadar hemoglobin (Hb)
Pengukuran kadar hemoglobin pada prinsipnya adalah mengkonversikan
haemoglobin dalam darah kedalam bentuk asam hematin oleh asam klorida. Mulamula darah dihisap dengan menggunakan pipet sahli hingga skala 20 mm3.
Kemudian dipindahkan kedalam tabung Hb yang berisi HCl 0,1N sampai skala 10
(garis kuning). Didiamkan selama 3-5 menit agar Hb bereaksi dengan HCl
membentuk asam hematin, kemudian diaduk dan ditambahkan aquadestila (sedikit
demi sedikit) hingga warnanya sama dengan standar. Pembacaan skala dilakukan
dengan melihat tinggi permukaan larutan yang dikocok dengan skala % yang
menunjukkan banyaknya Hb dalam gram setiap ml darah dan dinyatakan dalam
persentase (%Hb).
•
Penghitungan jumlah sel darah merah (eritrosit)
Prosedur pengamatan dam penghitungan jumlah sel darah merah pada
penelitian ini berdasarkan Blaxhall dan Daisley (1973). Darah diambil dari ikan
dengan menggunakan ineksi yang berisi cairan antikoagulan untuk mencegah
terjadinya penggumpalan darah. Darah yang tersedot dimasukkan kedalam
ependorf kemudian darah dihisap menggunakan pipet pencampur sampai pada
skala 0,5 dan ditambahkan larutan Hayems yang dihisap dengan pipet yang sama
hingga mencapai skala 101. Setelah itu, pipet digoyang membentuk angka delapan
selama 3-5 menit. Tetesan pertama dibuang dan tetesan berikutnya diteteskan
21 kedalam hemositometer dan ditutup dengan kaca penutup. Penghitungan
dilakukan pada 5 kotak kecil yaitu pada sudut kiri atas, sudut kanan atas, sudut
kiri bawah, sudut kanan bawah dan pada bagian tengah. Jumlah sel darah merah
yang terhitung dikonversikan dengan rumus:
Jumlah sel darah merah = ∑ sel darah merah terhitung x 104 sel/mm3
•
Penghitungan jumlah sel darah putih (leukosit)
Prosedur pengamatan dan penghitungan jumlah sel darah putih dilakukan
berdasarkan Blaxhall dan Daisley (1973). Metode pengambilan darahnya sama
dengan metode pengambilan sel darah merah. Darh dihisap dengan pipet
pencampur sampai dengan skala 11. Jumlah sel darah putih yang terhitung
dikonversikan berdasarkan rumus:
Jumlah sel darah putih = ∑ sel darah putih terhitung x 50 sel/mm3
3.5 Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup ikan kerapu macan ditentukan dengan menggunakan rumus
(Zonneveld et al., 1991)
St = (Nt/No) 100 %
Dimana : Sr = Kelangsungan Hidup (%)
Nt = Jumlah hewan uji pada akhir penelitian (ekor)
No= Jumlah hewan uji pada awal penelitian (ekor)
3.6 Laju Pertumbuhan
Pertumbuhan ikan yang diukur meliputi pertambahan berat (g) dengan
menggunakan neraca digital dan pertambahan panjang (cm) dengan menggunakan
millimeter blok. Pengukuran ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh kadar
timbals terhadap laju pertumbuhan juvenil ikan kerapu macan (Epinephelus
fuscogutattus) menggunakan rumus sebagai berikut (Huisman, 1976) :
α = { t [(Wt/Wo) – 1] } x 100%
Keterangan : Wt = Rerata bobot individu pada akhir penelitian
Wo = Rerata bobot individu pada awal pemeliharaan (g)
22 t
= Waktu pemeliharaan (hari)
α = Laju pertumbuhan harian (g/hari)
3.7 Analisis Data
Pengaruh logam berat timbal pada berbagai konsentrasi terhadap tingkat
konsumsi oksigen, respon hematologi
(kadar hematokrit, kadar hemoglobin,
jumlah eritrosit, dan jumlah leukosit), kelangsungan hidup dan pertumbuhan
pada ikan kerapu macan diperoleh dengan cara mengolah data menggunakan
analisis sidik ragam, Apabila terdapat pengaruh yang nyata maka dilanjutkan
dengan uji BNJ (Steel and Torrie, 1982). Parameter pendukung dianalisis dengan
statistik deskriptif berupa tabel, grafik dan gambar. Pengolahan data
menggunakan bantuan program Microsoft Excel 2007 dan SPSS 17.0.