teknik isolasi campylobacter jejuni dari usus ayam penderita

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
TEKNIK ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI DARI
USUS AYAM PENDERITA SINDROMA KEKERDILAN
SUPARTONO
Balai Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata 30, Bogor 16114
RINGKASAN
Pada penelitian ini dilakukan isolasi Campylobacter jejuni dari usus
ayam penderita sindroma kekerdilan. Teknik isolasi C. jejuni yang dipakai
berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Bolton dan Robertson dengan
memakai medium selektif Sampel usus bagian jejunum dikoleksi secara aseptis
(2-5 gram) dan dimasukkan dalam kantong plastik. Usus dihancurkan dengan
cara ditumbuk/digerus dan kemudian dibuat suspensi dengan 0,2% pepton.
Sebanyak 1 ml suspensi tersebut ditanam pada Preston selective enrichment
broth yang telah ditambah 5% darah kuda lisis. Spesimen diemulsifikasikan
sebelum diinkubasikan secara anaerobik (ditambah gas generating kits) untuk
campylobacter (OZ 5%, COz 10%, N2 85%) pada suhu 42 ° C selama dua hari .
Setelah diinkubasikan, biakan cair yang tumbuh kemudian disubkultur pada
Preston campylobacter selective agar yang ditambah 5% darah kuda lisis dan
diinkubasikan pada kondisi atmosfere yang sama. Karakteristik koloni
campylobacter adalah halus, cembung, mengkilat, berwarna putih keabu-abuan
dan non hemolitik dan morfologinya dengan pengecatan fuschin dapat
berbentuk huruf S, kurva atau spiral . Kemudian dipilih 1-2 koloni untuk
dimurnikan sebelum dilakukan identifikasi secara biokimia untuk menentukan
spesiesnya.
Kata Kunci: Campylobacter jejuni, Isolasi, Ayam, Preston .
PENDAHULUAN
Sindroma kekerdilan pada ayam disebabkan oleh agen virus dan
bakteri. Menurut laporan pada kasus ayam kerdil banyak ditemukan bakteri
Campylobacter jejuni (ROSENBERGER DAN OLSON, 1991). C. jejuni adalah
bakteri gram negatip, motile, berbentuk spiral rods dan hanya tumbuh pada suhu
42 ° C. Bentuk koloni C. jejuni kecil sekali seperti gulungan spiral, cepat sekali
berubah bila berhubungan dengan udara sehingga membentuk formasi
membulat antara batang dan coccus . Pada isolasi awal bisa dilihat dua tipe
koloni yaitu koloni mendatar warna keabu-abuan, bulat, pada bagian pinggir
tidak beraturan menyebar sesuai arah dari bidang goresan ose. Pada isolasi yang
kedua koloni bulat 1-2 mm, lembut berwarna seperti kotor agak gelap, koloni
pada media agar darah tidak terjadi hemolisa .
192
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
C. jejuni adalah bakteri yang mudah rusak dan sangat sensitif terhadap
oksigen serta suhu RUANG, oleh karena itu untuk isolasi secara optimal
diperlukan media selektif (STERN, 1981) . Isolasi C. jejuni selain membutuhkan
medium selektif untuk tumbuhnya juga perlu penambahan 6-7 % darah kuda
lisis dan supplemen antibiotik.
Ada banyak medium untuk isolasi C. jejuni diantaranya adalah dari
Preston, Skirrows, Butzler, Blaser's dan Campy. BAP (BOLTON DAN
ROBERTSON, 1982, DOYLE DAN ROMAN, 1982, ROGOL et al., 1985, BLASER et
al ., 1979) . Preston Campylobacter selektive medium diformulasikan oleh
BOLTON DAN ROBERTSON (1982) . Media ini sangat cocok untuk mengisolasi C .
jejuni dari semua tipe spesimen baik dari manusia, hewan, burung, dan
lingkungan. Campylobacter jejuni membutuhkan teknik khusus/selektif, sebab
kuman tersebut berada dalam lingkungan mikro aerophilik dan didalam
lingkungan kuman oleh kuman lain, serta kuman ini membutuhkan sedikit
sekali oksigen (3-6 % 02). Oksigen yang akan terlalu banyak meracuni kuman
tersebut, namun dengan penambahan 0,025% ferrous sulfat dan sodium meta
bisulfit dan sodium pyruvate dapat mempertahankan hingga konsentrasi oksigen
15-20% (GEORGE et al, 1978) .
Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa Preston medium
lebih selektif untuk isolasi C. jejuni dibandingkan dengan Skirrows medium
Preston juga cocok untuk isolasi dari segala macam sampel (BOLTON DAN
ROBERTSON et al., 1982). Oleh karena itu pada penelitian ini untuk isolasi C.
jejuni dari usus ayam penderita sindroma kekerdilan dilakukan dengan
menggunakan teknik tersebut.
BAHAN DAN CARA
Sampel
Dapat pulih sampel berupa usus ayam penderita sindroma kekerdilan
dikoleksidari lapang . Pengambilan sampel usus dilakukan di ruang bedah
bangkai bagian Patologi secara aseptis, yaitu dengan cara memotong usus
bagian jejunum. Sampel yang dikoleksi segera disimpan dalam pendingin untuk
mencegah terjadinya membuuhkan. Setelah tiba di laboratorium Bakteriologi,
usus dihancurkan dan dibuat suspensi dengan ditambah 0,2% pepton.
Bahan Pembuatan Media
1 . Campylobacter Agar Base (CM689, Difco)
2 . Campylobacter selective supplement (Preston SRI 17, Oxoid)
3 . Campylobacter growth supplemnet (Preston SR 84, Oxoid)
4. Nutrient Broth No. 2 (Oxoid)
5 . Darah kuda lisis (Biofarma)
6. Tabung bejana anaerobik
7. Gas generating kits untuk campylobacter (BR 56, Oxoid)
193
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Preston campylobacter selective agar
Media yang digunakan untk isolasi C. jejuni adalah media selektif
(Preston) yang diformulasikan oleh BOLTON DAN ROBERTSON (1982) . Media
selektif dibuat dengan cara mensuspensikan 18,5 gram campylobacter agar
base dalam 475 ml air destilasi dan kemudian dididihkan hingga larut. Media
agar tersebut didinginkan dan kemudian berturut-turut ditambah 5% darah kuda
lisis, 1 vial Preston campylobacter selective supplement yang telah dilarutkan
dalam 2 ml aceton (50/50) . Setelah tercampur rata agar kemudian dituangkan
pada petri dish steril .
Preston campylobacter selective broth
Media broth dibuat dengan cara melarutkan 12,5gram Nutrient broth
No .2 ke dalam 475 ml destilasi air dan dididihkan . Media broth kemudian
didinginkan lalu ditambahkan 25 ml darah kuda lisis, 1 vial Preston
campylobacter selective supplement dan 1 vial campylobacter growth
supplement . Campur sampai rata dan kemudian secara aseptik dimasukkan ke
dalam botol kecil yang tertutup berisi 5 ml. Selektive Enrichment Broth dapat
disimpan selama 7 hari pada temperatur 4°C.
Isolasi bakteri
Untuk mendapatkan isolat kuman campylobacter, isolasi harus segera
dilakukan mengingat kuman ini tidak tahan terhadap oksigen . Adapun cara
isolasi kuman sebagai berikut :
Usus diambil kurang lebih sekitar 2-5 gram masukkan dalan kantong
plastik steril untuk pembuatan suspensi dengan cara penggerusan .
Dengan menggunakan pipet ambil 1 ml suspensi usus dan masukkan
pada media cair No . 2 yang sudah ditambahkan ke dalam media tersebut darah,
supplement dan anti biotik.
Penanaman pada temperatur 42°C dalam kondisi anaerobik
menggunakan gaspack atau gas generating kit sehingga diperoleh kondisi
kandungan oksigen 2-5 % , 10% COZ dan 85% N2, lamanya inkubasi bisa
variasi antara 2-3 hari.
Pertumbuhan dapat dilihat setelah biakan cair di sub kultur pada media
agar darah, koloni yang dicurigai dilakukan pengecatan dengan Fuchsin .
Pengamatan segera dilanjutkan jangan sampai kultur terlalu lama di
dalam keadaan terbuka bebas berlebihan oksigen yang dapat bersifat toksik .
Identifikasi bakteri
Identifikasi bakteri C. jejuni dilakukan berdasarkan uji biokimia
1984) . Diambil 1 koloni dari media agar dan dipindahkan ke dalam
media heart infusion agar yang ditambah 5% darah kelinci dan diinkubasikan
pada suhu 42 °C selama 24 jam . Setelah diinkubasikan, diambil kultur segar
dengan ose dan dipindahkan ke dalam heart infusion broth . Kekeruhan
disesuaikan dengan standard Mc Farland No I dan kemudian dilakukan test
secara biokimia yaitu catalase, oksidase, reduksi nitrat, produksi H2S, toleransi
(BERGEY'S,
194
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
tehadap glisin 1%, NaCI 3,5%, produksi indole, temperatur dan hidrolisis
hippurat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil isolasi C. jejuni dari usus ayam kerdil dengan menggunakan
media selektif dari Preston ini menunjukkan dari 40 sampel usus dapat diisolasi
sebanyak 10 isolat . Dengan demikian tingkat keberhasilannya mencapai 40% .
Menurut pengalaman yang terjadi di laboratorium pada waktu isolasi ternyata
lamanya waktu untuk subkultur bakteri ini sangat mempengaruhi hasil akhir
isolasi . Jika waktu untuk melakukan subkultur tertunda hingga 1 jam maka
biasanya bakteri ini akan mati karena C. jejuni ini sangat sensitif terhadap
oksigen . Berdasarkan pengalaman ini maka sebelum siap untuk dilakukan
subkultur, cawan petri yang berisi koloni bakteri tetap dibiarkan dalam
anaerobik jar.
Tingkat keberhasilan untuk mengisolasi bakteri Campylobacter jejuni
sangat dipengaruhi oleh media yang digunakan, temperatur, lama inkubasi dan
juga kondisi atmosfernya . Hal ini terjadi karena bakteri C. jejuni sangat fragile
dan sensitif terhadap oksigen serta tidak dapat tumbuh pada temperatur 37°C.
Tingkat optimal oksigen yang diperlukan pada waktu inkubasi dilaporkan 6%.
Penyimpanan kultur bakteri ini juga harus ditambah gliserol dan disimpan pada
freezer - 80°C.
Banyak media yang telah dikembangkan untuk isolasi bakteri C. jejuni
dengan tingkat keberhasilan yang beragam. Salah satu media yang diketahui
mempunyai tingkat keberhasilan cukup tinggi untuk isolasi bakteri tersebut
adalah Preston selective media yang diformulasikan oleh BOLTON dan
ROBERTSON (1982) . Media ini dipilih karena cocok untuk isolasi C. jejuni dari
semua tipe spesimen baik dari manusia, mamalia, ayam dan juga dari
lingkungan.
Media selektif dari Preston diperkaya oleh penyubur dan antibiotik
sebagai suplemen tambahan. Kandungan antibiotiknya terdiri dari polymixin B,
Rifampicin, Trimethoprim lactate dan cycloheximide.
Adanya antibiotik
tersebut memudahkan untuk isolasi C. jejuni karena mampu untuk menghambat
pertumbuhan bakteri cemaran seperti Bacillus spp. dan Proteus spp . (BOLTON
DAN ROBERTSON, 1982) .
KESIMPULAN
Teknik isolasi Campylobacter jejuni dengan memakai media selektif
Preston mampu untuk mengisolasi bakteri dari jejenum ayam kerdil dengan
tingkat keberhasilan mencapai 40% .
195
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
DAFTAR BACAAN
BLASER, M.C.,I.D. BERKOWITZ, F.M. LAFORCE, J. CRAVENS, L.B. RELLER,
DAN WANG W.L 1979. Campylobacter enteritis : Clinical DAN
epidemilogic features. Ann. Intern . Med . 91 :1979.
BOLTON F.J. DAN L. ROBERTSON . 1982 . A selective medium for isolating
Campylobacter jejuni/coli. J. Clin. Pathol . 35:462 .
BERGEY,S . 1984. Mannual of systematic Bacteriology, Vol . I Williams dan
Wilkins Baltimore, London .
DOYLE, M.P. DAN D.J. ROMAN . 1982. Sensitivit y of Campylobacter jejuni to
drying. J.Food Prot. 45:507.
GEORGE, H.A., P.S . HOFFMAN, R.M. SMIBERT, DAN N.R. KRIEG . 1978.
Improved media for growth dan aerotolerance of Campylobacter fetus.
J. Clin. Microbiol . 8 :36.
ROGOL, M., B . SHPAK, D. RITHMAN, DAN I. SECHTER . 1985. Enrichment
medium for isolation of Campylobacter jejuni- Camoylobacter coli.
Appl. Environ . Microbiol . 50:125.
ROSENBERGER, M.D. DAN N.O. OLSON . 1991 . Reoviru s Infections . In: Disease
of Poultry 9th ed. Edited by Calneck, B.W., H.J. Barnes, C.W. Beard,
W.M. Reid DAN H.W. Yoder, JR. P. 639-647 . Ames, Iowa State
University Press.
STERN, N.J. 1981 . Campylobacter fetus ssp . jejuni: recovery methodology dan
isolation from lamb carcasses . J. Food Sc. 46:660 .