PCR

Laporan Praktikum
Mikrobiologi
Nama
NIM
Kelas/kelompok
PJP
Asisten
: Diana Agustini Raharja
: J3L112168
: C P1/1
: M. Arif Mulya, S. Pi.
: 1. Yuriska Sekar Rani
2. Lia Suliani
3. Ramdhani
TEKNIK MOLEKULER UNTUK IDENTIFIKASI MIKROBA
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA
PROGAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Hasil
Gambar 1 Isolat C. jejuni dan C. coli yang diambil dari karkas ayam pada tahun
2009-2011
Gambar 2 Hasil PCR menggunakan primer HipO yang diseparasi dalam agarose
1% dari isolat yang berasal dari ATCC C. jejuni pada sumur 7 sebagai kontrol
positif dan sampel pada sumur 1-6
Gambar 3 Hasil PCR menggunakan primer GlyA (sumur 1-9) dan HipO (sumur 10
dan 11) isolat yang berasal dari sampel (sumur 2-9) dan ATCC C. coli (sumur 1)
Gambar 4 Jumlah isolat Campylobacter sp. yang diisolasi secara konvensional
dan PCR dari karkas ayam
Gambar 5 Sensitivitas uji DPCR menggunakan primer HipO dengan target gen
323 bp
Pembahasan
Campylobacter sp. seperti C. jejuni dan C. coli merupakan bakteri yang
bersifat patogen pada manusia terutama menyebabkan enteritis dan kadangkadang invasi sistemik, terutama pada bayi. Bakteri ini merupakan penyebab diare
yang disertai lendir dan darah yang disebut juga dengan bloody diarrhea. Infeksi
pada C. jejuni dan C. coli melalui mulut dari makanan yaitu susu yang tidak
dipasteurisasi, air yang terkontaminasi, kontak dengan hewan yang terinfeksi
seperti unggas, anjing, kucing, domba, dan babi, atau dengan feses hewan melalui
makanan yang terkontaminasi seperti daging ayam yang belum dimasak dengan
baik. Kadang-kadang infeksi dapat menyebar melalui kontak langsung person to
person ataupun hewan yang terinfeksi. Bakteri C. jejuni dan C. coli dapat dilihat
pada gambar 6 dan 7.
Gambar 6 Bakteri C. jejuni
Gambar 7 Bakteri C. coli
Daging ayam merupakan salah satu sumber infeksi C. jejuni dan merupakan
sumber yang terkontaminasi paling banyak oleh C. jejuni. Metode yang dapat
digunakan selain dengan metode konvensional untuk mendeteksi C. jejuni yaitu
dengan metode direct PCR (DPCR). Metode DPCR merupakan deteksi yang
bersifat cepat dan sensitif untuk menentukan keberadaan bakteri patogen dalam
sampel. Metode DPCR dalam produksi bahan pangan untuk menentukan
kelayakan pangan untuk dikonsumsi, selain itu berguna mendeteksi bakteri
Campylobacter sp. karena mikroorganisme ini sulit untuk dikultur secara
konvensional dan dengan teknik molekuler ini maka bakteri kontaminan dalam
bahan pangan seperti Campylobacter sp. mampu dideteksi dan dibedakan sampai
tingkat spesies.
Primer yang spesifik untuk mendeteksi C. jejuni yaitu gene probe ceuE
sebagai komponen binding protein transport system dengan sekuen gen cdt
(cytolethal distending toxin) berguna untuk membedakan spesies C. jejuni dan C.
coli. Penelitian yang dilakukan dalam jurnal menggunakan media selektif untuk
mengisolasi C. jejuni secara konvensional dan juga teknik molekuler dengan
menggunakan DPCR. Pasangan primer yang digunakan pada metode DPCR ialah
HipO untuk menentukan spesies C. jejuni dan pasangan gene GlyA untuk
membedakan spesies C. jejuni dan C. coli. Penggunaan teknik konvensional serta
teknik molekuler ialah untuk menentukan sensitivitas metode DPCR dalam
mendeteksi Campylobacter sp. pada daging ayam dibandingkan dengan teknik
konvensional.
Sampel yang digunakan ialah karkas ayam sebanyak 298 sampel yang
diperoleh dari pasar tradisional dan swalayan di daerah DKI Jakarta, Bogor,
Sukabumi, Kudus, dan Demak dari tahun 2009 sampai dengan 2010. Teknik
konvensional dilakukan dengan cara pada sampel sebanyak 298 sampel masingmasing diambil 25 gram dan dimasukkan ke dalam media Nut Broth no. 2 yang
telah diperkaya dengan growth supplement, kemudian diinkubasi pada suhu 42°C
selama 24 jam dalam kondisi mikroaerofilik. Kondisi mikroaerofilik dibuat
dengan komposisi udara 5% O2, 10% CO2, dan 85% N2. Pemilihan kondisi suhu
dan udara ini dikarenakan bakteri Campylobacter sp. tumbuh secara optimum
pada kondisi tersebut. Kultur yang telah diinkubasi, kemudian diinokulasikan
pada media Campylobacter Blood Free Selective Agar Base yang mengandung
CCDA selective supplement dan diinkubasi kembali pada suhu dan kondisi
mikroaerofilik selama 24-48 jam. Identifikasi dilakukan untuk uji oksidase,
motilitas, fermentasi glukosa, laktosa, sukrosa, dan identifikasi lain secara
biokimia menggunakan API Campy test. Bakteri C. jejuni dan C. coli dapat
dibedakan dengan menggunakan uji hidrolisis enzim hipurat. C. jejuni mampu
menghidrolisis enzim tersebut sedangkan C. coli tidak mampu menghidrolisis
enzim hipurat. Hasil identifikasi dengan menggunakan API menunjukkan bahwa
dari 58 isolat Campylobacter sp. yang diperoleh dari tahun 2009 sampai 2011,
sebanyak 48 (81,4%) merupakan isolat C. jejuni dan 11 (18,6%) merupakan isolat
C. coli. Hasil ini memperlihatkan bahwa karkas ayam yang diambil dari pasar
tradisional maupun pasar swalayan telah terkontaminasi oleh C. jejuni dan C. coli
yang dapat dilihat pada gambar 1.
Teknik molekuler untuk identifikasi bakteri ini terlebih dahulu dilakukannya
proses ekstraksi DNA, kemudian hasil ekstraksi DNA diperbanyak dengan
menggunakan PCR, kemudian dilakukannya proses elektroforesis. Ekstraksi DNA
dilakukan bertujuan untuk memperoleh gen. Proses PCR umumnya terdiri dari
tiga tahap di antaranya denaturasi, annealing, dan extension sehingga diperoleh
produk PCR. Produk PCR kemudian dielektroforesis untuk mengetahui ada atau
tidaknya DNA target yang dibandingkan pula dengan kontrol positif serta kontrol
negatif. Ekstraksi DNA pada teknik molekuler dilakukan dengan cara sampel
karkas ayam dalam suspensi media Nut Broth no. 2 yang telah diinkubasikan,
diambil sebanyak 1 mL, dan disentrifusa dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu
4°C selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh ditambahkan
dengan 1 mL akuades dan disentrifusa kembali dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 5 menit. Purifikasi DNA dilakukan dengan cara menambahkan akuades
100 mL (1:500) pada pelet, kemudian dipanaskan dalam air mendidih dengan
suhu 100°C. Suspensi segera didinginkan setelah 10 menit dipanaskan dan
disentrifusa kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, selanjutnya
suspensi atau supernatan yang ada diambil sebagai DNA, sedangkan pelet yang
diperoleh merupakan kontaminan bukan DNA.
Primer yang digunakan untuk mengidentifikasi gen hippuricase (HipO) dan
serine hydroxymethyl tranferase (GlyA) dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk PCR
Primer
Sekuen
Gen target
Ukuran (bp)
CJ-F
ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC
C. jejuni Hip 323
CJ-R
GCC ACA ACA AGT AAA GAA GC
CC-F GTA AAA CCA AAG CTT ATC GTG C. coli GlyA
126
CC-R TCC AGC AAT GTG TGC AAT G
Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan PCR dengan siklus sebanyak
35 kali pada suhu initial denaturation sebesar 95°C selama 6 menit, denaturation
pada suhu 95°C selama 30 detik, annealing pada suhu 59°C selama 30 detik,
extension pada suhu 72°C selama 30 detik, dan final extension pada suhu 72°C
selama 7 menit. Produk PCR diperiksa dengan elektroforesis gel agarose. Gel
agarose 1% dengan 1x TBE (Tris Boric EDTA) ditambah dengan 5 mL larutan
etidium bromida. Elektroforesis dilakukan pada 150 volt selama 30 menit dan
visualisasi untuk melihat pita gen target menggunakan transluminator ultraviolet.
Gen HipO (Hippuricase) merupakan primer yang hanya terdapat pada C.
jejuni. Strain ini memberikan reaksi positif pada uji hidrolisis hipurat, sedangkan
C. coli memberikan reaksi negatif dengan besaran target gen yang diharapkan
yaitu C. jejuni pada 323 bp. Target gen C. jejuni menggunakan primer gen HipO
terdapat pada lokasi gen 1662-1965 bp menunjukkan hasil positif C. jejuni pada
pita 323 bp yang dapat dilihat pada gambar 2. Gen GlyA mengkode serine
hydroxymethyl transferase yang terdapat pada C. coli dan lokasi gen target
terdapat pada 337-444 bp dengan ukuran 126 bp yang dapat dilihat pada gambar 3.
Hasil identifikasi dengan PCR diperoleh 124 karkas ayam telah terkontaminasi
sebanyak 70 (56,5%) adalah C. jejuni dan 54 (43,5%) adalah C. coli. Hal tersebut
menunjukkan bahwa karkas ayam telah terkontaminasi oleh bakteri C. jejuni dan
C. coli yang dapat dilihat pada gambar 4.
Sensitivitas uji DPCR dilakukan untuk mengetahui jumlah minimum koloni
(CFU/mL) yang mampu dideteksi dengan menggunakan pasangan basa gen HipO.
Besarnya sensitivitas ditentukan dengan menumbuhkan suspensi koloni yang
sudah melalui pengenceran berseri. Suspensi yang telah diketahui jumlah koloni
pada masing-masing pengenceran selanjutnya dilakukan purifikasi DNA. Hasil
sensitivitas uji DPCR untuk mendeteksi C. jejuni dapat dilihat pada Gambar 5.
Metode DPCR yang digunakan pada penelitian dapat mendeteksi minimum 103
CFU/mL. Isolasi
Campylobacter sp. menggunakan metode konvensional
memerlukan waktu empat hari untuk mengetahui hasil negatif dan 6-7 hari untuk
melakukan konfirmasi hasil yang positif. DPCR dengan menggunakan target gen
HipO dan GlyA mampu membedakan C. jejuni dan C. coli pada waktu yang lebih
cepat, oleh karena itu metode PCR lebih baik dibandingkan dengan metode
konvensional.
Simpulan
Kontaminasi Campylobacter sp. pada daging ayam lebih tinggi pada uji
direct PCR (DPCR) (62,6%) dibandingkan cara konvensional (19,8%) dan
metode DPCR lebih sensitif dibandingkan metode konvensional untuk mendeteksi
kontaminan Campylobacter sp.
Daftar Pustaka
Andriani, Mirnawati S, Surachmi S, Harsi DK. 2013. Metode direct polymerase
chain reaction untuk melacak Campylobacter sp. pada daging ayam. Di dalam
Jurnal Veteriner. Bogor: IPB Press.