4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Mitokondria Mitokondria

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Mitokondria
Mitokondria merupakan salah satu organel yang mempunyai peranan
penting dalam sel berkaitan dengan kemampuannya dalam menghasilkan energi
bagi sel tersebut. Disebut sebagai penghasil energi bagi sel karena dalam
mitokondria berlangsung proses oksidasi zat-zat dalam makanan yang
menghasilkan energi kimia dalam bentuk Adenosin Trifosfat (ATP) (Poedjiadi
dan Supriyanti, 2005).
Jumlah mitokondria dalam setiap sel berbeda tergantung pada jenis
organisme dan jenis sel atau jaringan (Siti dkk., 2007). Contohnya, sel telur
memiliki 100.000 mitokondria, sedangkan sel sperma hanya memiliki 50-100
mitokondria di bagian ekornya (Ngili, 2003). Sebagai organel penghasil energi,
mitokondria banyak ditemukan pada sel-sel yang memiliki aktivitas metabolisme
tinggi, seperti pada sel-sel bagian ekor sel sperma, sel otot jantung, dan sel-sel
yang aktif membelah seperti epitelium, akar rambut serta epidermis kulit (Ngili,
2003).
Mitokondria berbentuk bulat panjang dengan berbagai ukuran, mempunyai
membran ganda, yaitu membran luar dan membran dalam. Membran dalam
mitokondria membentuk lipatan-lipatan yang disebut kristae dan pada kristae ini
terdapat enzim-enzim oksidase. Bagian dalam mitokondria terisi oleh zat kental
yang disebut matriks (Poedjiadi dan Supriyanti, 2005), di dalam matriks ini
4
terdapat suatu DNA yang berbeda dengan DNA inti dan selanjutnya dikenal
dengan DNA mitokondria (mtDNA). Secara lengkap struktur mitokondria
ditunjukkan pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1. Struktur mitokondria
(Smelick, 2005)
2.2. DNA Mitokondria
DNA mitokondria (mtDNA) merupakan DNA yang berbentuk lingkaran
dengan panjang 16.569 pasang basa (pb) dan terletak di mitokondria. Urutan
lengkap nukleotida mtDNA manusia pertama kali dipublikasikan oleh
Anderson et al. pada tahun 1981. Genom mtDNA mengandung 37 gen yang
terdiri dari gen penyandi 12S dan 16S, 22tRNA dan 13 protein sub unit kompleks
enzim rantai respirasi (Anderson dalam Siti dkk., 2007). mtDNA memiliki jumlah
copy yang banyak dalam tiap sel, tetapi jumlah copy tersebut sangat bervariasi
tergantung jenis selnya. Peta daerah mtDNA ditunjukkan pada Gambar 2.2.
5
Gambar 2.2. Peta daerah DNA mitokondria manusia
(Czarnecka et al., 2006)
Secara umum, daerah mtDNA dapat dibedakan menjadi daerah pengkode
(coding region) dan daerah bukan pengkode (non coding region) atau dikenal juga
sebagai daerah D-loop. Coding region, merupakan daerah pengkode protein,
tRNA atau rRNA. Adanya mutasi nukleotida pada daerah ini bisa menyebabkan
terjadinya penyakit. Sedangkan non coding region merupakan daerah yang tidak
mengkode dan mutasi nukleotida pada daerah ini tidak mengakibatkan terjadinya
penyakit, atau dengan kata lain hanya menyebabkan terjadinya polimorfisme
(Czarnecka et al., 2006).
Analisis mtDNA menjadi objek kajian yang menarik dan penting untuk
dipelajari. Hal ini disebabkan karena mtDNA memiliki karakteristik yang unik
6
jika dibandingkan dengan DNA inti. Karakteristik yang dimaksud diantaranya
adalah: (a) Bentuknya yang melingkar sepanjang 16.569 pasang basa;
(b) Memiliki jumlah kopi yang banyak; (c) Laju mutasi yang tinggi; dan (d)
Bersifat maternal (Krings et al., 1997).
Seperti telah dikemukakan sebelumnya, salah satu karakteristik mtDNA
adalah laju mutasinya yang tinggi. Hal tersebut antara lain disebabkan karena:
Mitokondria menjadi tempat terjadinya reaksi fosforilasi oksidatif yang
menghasilkan banyak radikal oksigen yang bersifat mutagen; pada mtDNA tidak
ditemukan protein pertahanan seperti histon pada DNA inti (Richter et al., 1988);
tidak dimilikinya proffreading oleh DNA Polymerase
yang dapat mengkoreksi
kesalahan-kesalahan selama proses replikasi.
Karakteristik lain dari mtDNA adalah pola pewarisannya bersifat maternal.
Chen et al. (2002) mengungkapkan bahwa pola urutan nukleotida mtDNA hanya
diwariskan melalui garis keturunan ibu tanpa adanya kontribusi dari pihak ayah.
Hal ini menyebabkan mtDNA anak akan identik dengan mtDNA ibunya. Sifat ini
terjadi sebagai akibat tidak adanya rekombinasi antara mtDNA ayah dan ibu.
Bukti sifat maternal mtDNA tersebut ditunjukkan oleh penelitian
Giles et al. pada tahun 1980. Penelitian mtDNA pada daerah hipervariabel (HV)
yang merupakan daerah paling polimorfik menunjukkan bahwa urutannya lestari
secara maternal pada tujuh garis keturunan, baik untuk daerah HVI maupun
daerah HVII (Ngili, 2003).
Selain laju mutasi yang tinggi dan pola pewarisan yang bersifat maternal,
karakteristik lain mtDNA adalah bentuknya yang melingkar sepanjang 16.569
7
pasang basa. Anderson dan koleganya telah menentukan urutan nukleotida
mtDNA secara lengkap pada tahun 1981 yang selanjutnya disebut sebagai
Cambridge Reference Sequence (CRS). Urutan ini kemudian direvisi oleh
Andrew et al. pada tahun 1999 dan kemudian dijadikan referensi atau acuan bagi
penelitian-penelitian mtDNA berikutnya dan biasa disebut revised Cambridge
Reference Sequence (rCRS).
2.3. Daerah Hipervariabel I (HVI) mtDNA Manusia
Daerah HVI merupakan salah satu daerah yang termasuk dalam daerah
D-loop mtDNA manusia. Daerah D-loop (16024-372) ini adalah daerah yang
tidak mengkode protein dan disebut control region (daerah kontrol). Selain HVI,
pada D-loop terdapat daerah lain yaitu daerah hipervariabel II (HVII) yang berada
pada urutan 57-372 (Ngili, 2003).
Daerah HVI merupakan daerah yang menunjukkan tingkat polimorfis yang
tinggi dan berada pada urutan 16024-16383 (Ngili, 2003). Tingkat polimorfisme
yang tinggi pada daerah HVI menjadi salah satu penyebab penelitian terhadap
daerah ini terus berkembang. Hingga tahun 1996 jumlah data urutan nukleotida
daerah HVI yang telah dipublikasikan adalah sebanyak 4079 data (Handt et al.,
1998).
Gambar 2.3 menunjukkan peningkatan jumlah data urutan nukleotida
daerah HVI dan HVII yang dipublikasikan dari tahun ke tahun hingga tahun 1996.
8
Gambar 2.3. Jumlah data urutan nukleotida daerah HVI dan HVII yang telah
dipublikasi sampai tahun 1996 (Handt et al., 1998).
Seperti telah dikemukakan sebelumnya, bahwa daerah HVI ini memiliki
laju mutasi yang tinggi. Salah satu mutasi yang mungkin terjadi adalah mutasi
T16189C yang akan menimbulkan munculnya rangkaian poli-C pada urutan
nukleotida daerah HVI. Mutasi tersebut menjadi salah satu tanda adanya
heteroplasmi dalam sel sampel yang diteliti (Dwiyanti, 2006). Terjadinya
heteroplasmi dapat mengganggu proses penentuan urutan nukleotida melalui
direct sequencing sehingga urutan yang dihasilkan menjadi tidak lengkap.
Heteroplasmi muncul jika di dalam sel terjadi pencampuran lebih dari satu
tipe mtDNA (terdapat subpopulasi mtDNA) dengan proporsi yang relatif sama
(Dwiyanti, 2006). Heteroplasmi dapat terjadi pada daerah yang mengkode dan
pada daerah yang tidak mengkode. Pola panjang heteroplasmi mirip untuk
individu-individu segaris keturunan ibu tetapi bervariasi untuk individu yang tidak
segaris keturunan ibu (Malik et al. dalam Dwiyanti, 2006).
Tingginya laju mutasi pada daerah HVI mtDNA dapat memberikan
berbagai manfaat, diantaranya adalah di bidang forensik dan identifikasi
9
hubungan kekerabatan. Analisis forensik berupa tindakan identifikasi barang
bukti, yang bertujuan untuk memperkirakan identitas seseorang seperti ras, umur,
jenis kelamin, dan lain-lain (Ngili, 2005). Dalam analisis yang dimaksud, profil
DNA sampel dibandingkan dan dicocokan dengan data-data profil DNA yang
telah diketahui dari berbagai hasil penelitian sebelumnya.
Pemanfaatan analisis daerah HVI mtDNA dalam identifikasi hubungan
kekerabatan dapat dilakukan karena pola pewarisan mtDNA bersifat maternal.
Selain itu telah dikemukakan sebelumnya bahwa pola panjang heteroplasmi yang
mungkin terjadi mirip untuk individu-individu segaris keturunan ibu tetapi
bervariasi untuk individu yang tidak segaris keturunan ibu. Karakteristik ini juga
dapat membantu dalam perunutan hubungan kekerabatan suatu individu.
2.4. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi rantai polimerase
merupakan proses mengamplifikasi (memperbanyak) molekul DNA yang
diinginkan secara in vitro (Gumilar, 2006). Produk amplifikasi tidak lain
merupakan fragmen DNA yang diperpanjang oleh enzim DNA polimerase, ketika
menempel pada salah satu untai templat DNA.
Teknik PCR ditemukan oleh Kary B. Mullis pada pertengahan tahun 1980.
Sebelum ditemukannya teknik ini, untuk memperbanyak molekul DNA dilakukan
dengan teknik kloning. Untuk memperoleh hasil kloning diperlukan waktu
beberapa hari. Sedangkan dengan menggunakan teknik PCR, proses amplifikasi
DNA dapat dilakukan hanya dalam waktu beberapa jam saja.
10
Beberapa komponen yang harus ada agar proses PCR dapat berlangsung
adalah: a) templat DNA; b) primer; c) deoksinukleotida (dNTP); d) enzim
polimerase (Taq); dan e) buffer, Mg2+.
Templat DNA adalah molekul DNA yang menjadi target amplifikasi. Pada
proses PCR, hanya diperlukan templat dalam jumlah yang relatif sedikit. Primer
merupakan oligonukleotida spesifik yang berfungsi untuk membatasi fragmen
DNA yang akan diamplifikasi. Dengan bantuan enzim DNA polimerase dan
adanya variasi suhu, primer dapat menempel pada DNA templat dan menyalin
informasi genetik berdasarkan templat tersebut.
Deoksinukleotida (dNTP) berperan sebagai sumber monomer dalam
proses polimerisasi fragmen yang teramplifikasi. dNTP terdiri atas dATP, dGTP,
dCTP, dan dTTP (Gumilar, 2007). Enzim polimerase merupakan katalis yang
membantu proses perpanjangan primer yang menempel pada templat DNA.
Proses yang terjadi dalam PCR dibagi menjadi tiga tahap, yaitu sebagai
berikut:
1. Denaturasi
Proses denaturasi berfungsi untuk membuka untai ganda DNA templat
menjadi untai tunggal, sehingga memungkinkan terjadinya penempelan primer.
Proses tersebut dapat dilakukan pada suhu tinggi, biasanya diatas 90°C. Hal yang
dapat menjadi pertimbangan dalam penentuan suhu denaturasi adalah kandungan
Guanine (G) dan Cytosine (C) yang ada dalam templat DNA. Makin tinggi
proporsi G+C akan mengakibatkan suhu yang diperlukan untuk proses denaturasi
juga makin tinggi.
11
2. Annealing
Annealing merupakan proses penempelan primer pada untai DNA yang
telah terdenaturasi. Untuk proses ini diperlukan penentuan suhu dengan teliti.
Karena jika suhu annealing terlalu tinggi, maka hal tersebut dapat mengakibatkan
produk DNA yang dihasilkan ada dalam jumlah yang kecil. Jika suhu annealing
terlalu rendah, dapat menyebabkan terjadinya penempelan yang tidak spesifik.
Sehingga akibatnya bisa diperoleh fragmen DNA yang tidak diinginkan.
3. Extension (polimerisasi)
Extension merupakan proses perpanjangan primer yang telah menempel
pada templat DNA. Proses ini dikatalisis oleh enzim DNA polimerase. Pada tahap
ini, hal yang dapat dijadikan pertimbangan untuk menentukan suhu extension
adalah suhu optimum enzim polimerase yang digunakan.
Ketiga proses tersebut akan terus berulang sesuai dengan siklus yang kita
inginkan. Jumlah siklus yang akan dilakukan dapat ditentukan berdasarkan
banyaknya copy DNA yang diinginkan. Secara kasar, jumlah copy DNA yang
akan diperoleh dalam n siklus adalah 2n.
2.5. Elektroforesis Gel Agarosa
Menurut Dinda (2008), elektroforesis merupakan proses pemisahan
berdasarkan perbedaan migrasi molekul pada suatu medan listrik. Kecepatan
migrasi molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran. Hal itulah yang mendasari penggunaan elektroforesis untuk
pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat.
12
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat
sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Elektroforesis gel
biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
teknik preparatif sebelum suatu molekul digunakan dalam metode-metode lain
seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting
yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut (Dinda, 2008).
Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil, gel yang
digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida. Sedangkan untuk memisahkan
asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Agarosa adalah polimer linier yang diekstrak dari rumput laut dan dijual
dalam bentuk tepung putih. Dalam pemakainnya, tepung putih agarosa dididihkan
dalam bufer dan ketika dingin membentuk jeli (gel). Gel terbentuk karena pada
saat dipanaskan di air, molekul agar-agar dan air bergerak bebas. Ketika
didinginkan, molekul-molekul agar-agar mulai saling merapat, memadat dan
membentuk kisi-kisi yang mengurung molekul-molekul air. Kisi-kisi ini
dimanfaatkan dalam elektroforesis gel agarosa untuk menghambat pergerakan
molekul obyek akibat perbedaan tegangan antara dua kutub.
Elektroforesis gel agarosa dapat memisahkan DNA berdasarkan perbedaan
ukuran, melalui migrasi DNA pada suatu media dalam pengaruh medan listrik
(Widyasari dan Suhandono, 2007). Laju migrasi DNA pada elektroforesis gel ini
dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya konsentrasi gel agarosa yang
digunakan (Humana, 2007), ukuran molekul, serta voltase yang diterapkan
13
(Gumilar dkk., 2008). Beberapa komponen dalam elektroforesis gel agarosa ini
antara lain: a) sampel DNA; b) agarosa (gel); c) Etbr; d) loading buffer; e) running
buffer; f) marker; dan g) lampu UV (Gumilar dkk., 2008).
2.6. Sekuensing
Sekuensing DNA merupakan suatu metode untuk menentukan urutanurutan basa nukleotida (A, C, G dan T) dalam suatu gen dan asam nukleat
(Na’im, 1996). Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode
yang dikembangkan oleh Allan Maxam dan Walter Gilbert pada tahun 1977. Pada
metode Maxam-Gilbert, degradasi DNA terjadi secara kimiawi. Dalam metode ini
diperlukan DNA untai ganda, tetapi tidak diperlukan primer karena bukan sintesis
untai baru. Pemotongan untai DNA terjadi secara kimia, sehingga reagen kimia
tertentu harus ditambahkan ke dalam sistem reaksi (Gumilar dkk., 2008).
Namun
ternyata
metode
Maxam-Gilbert
ini
memiliki
beberapa
kekurangan, diantaranya: (a) memerlukan banyak DNA murni; (b) melalui banyak
tahapan pemurnian intermediet; dan (c) hanya bisa diterapkan untuk pembacaan
DNA dengan untai yang relatif pendek (Cummings, 2007). Sehingga dewasa ini
metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah jarang digunakan karena ditemukannya
metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan
oleh Fred Sanger dan A. R. Coulson pada tahun 1980. Prinsip dasar pada metode
dideoksi Sanger ini adalah terjadinya terminasi rantai nukleotida sebagai akibat
adanya nukleotida dideoksi (ddNTP) (Gumilar, 2007).
Sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat
tabung yang terpisah. Setiap tabung mengandung DNA polimerase, campuran
14
deoksinukleotida dari empat jenis basa (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), serta
dalam jumlah sedikit masing-masing satu jenis dideoksinukleotida (ddATP,
ddCTP, ddGTP, atau ddTTP)
yang dilabeli dengan fosfor radioaktif (1P32)
(Susanto, 2008). Dideoksinukleotida ini struktur molekulnya mirip dengan
deoksinukleotida, hanya tak punya gugus OH untuk mengikat dNTP berikutnya.
Enzim DNA polymerase akan mengkatalis reaksi polimerasi, tetapi reaksi
akan terhenti jika yang terikat adalah dideoksinukleotida, sehingga dngan
demikian akan terbentuklah fragmen-fragmen yang panjangnya berbeda yang
diakhiri dengan ddATP, ddCTP, ddGTP, dan ddTTP pada masing-masing tabung
reaksi (Helianti, 2005). Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing
tersebut dilakukan elektroforesis sehingga akan terjadi perbedaan migrasi sesuai
dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya diketahui, dilakukan
pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga yang paling panjang.
Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer dengan hasil
sekuensing tersebut (Susanto, 2008).
Metode sekuensing yang ditemukan oleh Sanger ini selanjutnya dikenal
sebagai metode dideoksi Sanger, atau ada pula yang menyebutnya sebagai metode
chain termination. Dalam perkembangan selanjutnya, ilmuwan mulai melakukan
otomatisasi metode Sanger, sehingga sekuensing tidak lagi dilakukan secara
manual, dan dapat lebih cepat. Helianti (2005) mengatakan bahwa saat ini
sekuensing asam nukleat dapat dilakukan secara otomatis dengan suatu alat yang
disebut nucleic acid sequencer.
15
2.7. GenBank
GenBank adalah suatu basis data yang dapat diakses secara umum yang
memiliki urutan-urutan nukleotida dari 260.000 organisme lebih. Urutan-urutan
nukleotida tersebut umumnya diperoleh dari hasil penelitian individual dan
beberapa dari hasil penelitian sekuensing berskala besar. Hingga bulan Februari
2008 terdapat 85.759.586.764 basa dari 82.853.685 data yang tersimpan di
GenBank. Salah satu cara untuk memperoleh data dari GenBank adalah
menggunakan NCBI e-utilities dengan mengakses situs www.ncbi.nlm.nih.gov.
16