Repository FMIPA 1 ELEKTROFORESIS DNA TOTAL DAN

ELEKTROFORESIS DNA TOTAL DAN AMPLIFIKASI PCR FRAGMEN
GEN COX3 PADA IKAN Kryptopterus limpok (Bleeker 1852)
DARI TIGA SUNGAI RAWA BANJIRAN
PROVINSI RIAU
Vella Nurazizah Djalil1, Roza Elvyra2, Dewi Indriyani Roslim3
1
Mahasiswa Program S1 Biologi
Dosen Bidang Zoologi Jurusan Biologi
3
Dosen Bidang Genetika Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau
Kampus Bina Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected]
2
ABSTRACT
Riau Province has the typical of floodplain river. One of the fish that live in this river
ecosystem is Kryptopterus limpok. Information of molecular barcodes of mitochondrial
cytochrome c oxydase subunit 3 (COX3) gene from K. limpok is still unknown. The
objective of this research was to obtain the DNA fragment of the mitochondrial COX3
gene K. limpok from Kampar River, Tapung River, and Indragiri Hulu River. Total
DNA isolated were taken from the muscle of fish-tail. The total DNA was
electrophoresed on 1,2% agarose gel and then visualized using UV transiluminator
(WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific). PCR amplification was performed using a
primer pair of COXIIIF1 (forward) 5’GCT TAG GTT TCA CCA CAA GA3’ and
COXIIIR1 (reverse) 5'CGA ACA CAA ATC AGT GGT GTT CT3'. PCR condition
based on Elvyra dan Duryadi (2007) with modification. Total DNA concentrations
produced ranging from ±300 ng/µl and the fragment length of the mitochondrial COX3
gene K. limpok was 660 bp.
Keywords : Amplification, DNA, Electrophoresis, Kryptopterus limpok, PCR
ABSTRAK
Provinsi Riau memiliki karakteristik sungai yang khas yaitu sungai rawa banjiran. Salah
satu ikan yang hidup dalam ekosistem sungai tersebut adalah ikan Kryptopterus limpok.
Informasi molekuler mengenai barkode ikan K. limpok pada gen sitokrom c oksidase
sub unit 3 (COX3) mitokondria masih belum diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan fragmen gen COX3 mitokondria pada ikan K. limpok dari Sungai Kampar,
Sungai Tapung, dan Sungai Indragiri Hulu. Isolasi DNA total diambil dari bagian otot
ekor ikan. DNA total dimigrasikan pada 1,2 % gel agarosa dan divisualisasikan dengan
UV transluminator (WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific). Amplifikasi PCR dilakukan
dengan menggunakan sepasang primer COXIIIF1 (forward) 5’GCT TAG GTT TCA
CCA CAA GA3’dan COXIIIR1 (reverse) 5’CGA ACA ATC CAA AGT GGT GTT
Repository FMIPA
1
CT3’. Kondisi PCR berdasarkan Elvyra dan Duryadi (2007) dengan modifikasi. Hasil
yang diperoleh adalah konsentrasi DNA total berkisar ±300 ng/μl dan panjang fragmen
gen COX3 yang berukuran 660 pb.
Kata Kunci : Amplifikasi, DNA, Elektroforesis, Kryptopterus limpok, PCR
PENDAHULUAN
Provinsi Riau memiliki ekosistem
sungai dengan ciri berbeda dengan
sungai-sungai pada umumnya, yaitu
ekosistem sungai rawa banjiran atau
floodplain river (Elvyra 2009). Salah
satu ikan yang hidup di ekosistem sungai
tersebut adalah ikan Kryptopterus
limpok.
Ikan K. limpok termasuk ke dalam
famili Siluridae (Kottelat et al. 1993)
Masyarakat Riau mengenal ikan ini
dengan nama ikan selais janggut.
Berdasarkan informasi nelayan, ikan ini
hanya ditemukan pada musim penghujan
saja. Meskipun termasuk ikan ekonomis
dan memiliki nilai komersil yang tinggi,
data
molekuler
masih
terbatas
jumlahnya.
Penelitian eksplorasi molekuler
untuk mengetahui informasi genetik
guna menunjang upaya konservasi
sumber daya secara genetik. Tahapan
elektroforesis DNA total dan amplifikasi
PCR gen COX3 pada ikan K. limpok
merupakan tahapan penting dalam
mendapatkan fragmen DNA yang
panjang. Penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan fragmen gen COX3
mitokondria pada ikan K. limpok dari
Sungai Kampar, Sungai Tapung, dan
Sungai Indragiri Hulu.
METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan pada bulan
Maret 2014 - Januari 2015 di
Repository FMIPA
Laboratorium Genetika Jurusan Biologi
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Universitas Riau. Alatyang
digunakan adalah gunting, pipet mikro
berukuran 10 l, 100 l, dan 1000 l,
tabung mikro berukuran 1,5 ml dan 2,0
ml, mesin sentrifus, vorteks, pinset,
waterbath, sisir, cetakan agarosa tip
mikro, mesin PCR, mesin elektroforesis
horizontal, timbangan analitik, hot plate,
gelas ukur, UV transiluminator, stirer,
dan kamera.
Bahan yang digunakan adalah 10
sampel DNA otot ekor ikan K. limpok
dari Sungai Kampar, Sungai Tapung dan
Sungai Indragiri Hulu. Bahan kimia
yang digunakan adalah PCR Kit TopTaq
dari Qiagen, buffer TE (dH2O; 1 MTrisHCl pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0),
akuabidestilata,
primer
COXIIIF1
(forward) 5’GCT TAG GTT TCA CCA
CAA GA3’ dan primer COXIIIR1
(reverse) 5’CGA ACA ATC CAA AGT
GGT GTT CT3’, buffer TBE (TrisBorate; EDTA) 1x,etidium bromida,
loading dye, gel agarosa 1,2%, dan 1 kb
DNA ladder.
a. Elektroforesis DNA Total
Sepuluh sampel otot ekor ikan K.
limpok dari masing-masing sungai di
yang telah diisolasi di Laboratorium
Genetika Jurusan Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Universitas Riau diperiksa kualitas dan
kuantitasnya
melalui
proses
elektroforesis (Fison Mode FEC 360,
2
Large Horizontal Gel System), yaitu
dengan memigrasikannya pada gel
agarosa 1,2% dalam buffer TBE 1x pH
8,0 pada 75 Volt selama 45 menit. Gel
hasil elektroforesis diwarnai dengan
2µg/50ml
etidium bromida, lalu
divisualisasikan diatas lampu UV
(WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific)
dan difoto menggunakan kamera
(Olympus SP-500 UZ).
b. Amplifikasi PCR Fragmen Gen
COX3
Molekul DNA total yang telah
dielektroforesis kemudian diamplifikasi
menggunakan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR). Amplifikasi PCR
menggunakan bahan PCR Kit TopTaq
dari Qiagen dan sepasang primer
COXIIIF1 (forward) 5’GCT TAG GTT
TCA CCA CAA GA3’ dan primer
COXIIIR1 (reverse) 5’CGA ACA ATC
CAA AGT GGT GTT CT3’ yang
sebelumnya dilarutkan dengan buffer TE
dan diencerkan dengan akuabidestilata.
Komposisi komponen PCR yang dipakai
meliputi :
Tabel 1. Komposisi komponen PCR
Komponen
CoralLoad
primer forward
primer reverse
TopTaq Mastermix
dH2O
DNA sampel ikan
Total
[ ] akhir
10×
10 µM
10 µM
2x
300 ng/µl
Volume
(µl)
5
1
1
15
25
3
50
Kondisi PCR menurut Elvyra dan
Duryadi (2007) dengan beberapa
modfikasi meliputi pra PCR dengan
suhu 94°C selama 5 menit, PCR 35
siklus dengan tahap: denaturasi pada
Repository FMIPA
suhu 94°C selama 1 menit, penempelan
primer pada suhu 51,6°C selama 1
menit, pemanjangan pada suhu 72°C
selama 1 menit, dan post PCR dengan
suhu 72°C selama 5 menit. Setelah
dilakukan
PCR,
kemudian
dielektroforesis untuk melihat hasil PCR.
HASIL DAN PEMBAHASAN
a.
Molekul DNA Total
Elektroforesis dilakukan untuk
melihat keutuhan DNA total. Hasil
elektroforesis DNA total dari sampel 10
sampel ikan dari masing-masing sungai
tidak semua menghasilkan pita. Dari 10
sampel
masing-masing
sungai
didapatkan 4 sampel dari Sungai
Kampar, 3 sampel dari Sungai Tapung,
dan 2 sampel dari Sungai Indragiri Hulu
(Gambar 1.). Sampel yang berhasil
dielektroforesis ditunjukkan dengan
adanya satu pita utuh dengan konsentrasi
DNA total berkisar 300 ng/l pada tiap
sampel dari ketiga sungai. Hal ini
menunjukkan bahwa amplifikasi berjalan
dengan baik meskipun pita yang
memiliki ketebalan yang berbeda.
Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA
total
sampel ikan K.
limpok yang telah diisolasi.
Keterangan : (M) DNA
ladder;
(A)
Sungai
Kampar;
(B)
Sungai
3
Tapung;
(C) Sungai
Indragiri Hulu
b.
Fragmen Gen COX3
Molekul
DNA
total
hasil
elektroforesis dijadikan cetakan DNA
untuk amplifikasi gen COX3 dengan
menggunakan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR). Teknik PCR adalah
suatu teknik atau metode enzimatis
untuk memperbanyak suatu sekuen
nukleotida tertentu secara in vitro
(Yuwono 2006). Teknik PCR pertama
kali ditemukan oleh Kary B. Mullis
tahun 1985 yang memungkinkan adanya
perbanyakan (amplifikasi) potongan
DNA antara dua primer hanya di dalam
tabung
reaksi,
tanpa
perlu
memasukkannnya ke dalam sel (in vivo).
Reaksi perbanyakan potongan DNA ini
dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida yang bertindak sebagai
forward dan reverse
(Zein &
Prawiradilaga 2014).
Fragmen DNA dari gen COX3
yang diperoleh berukuran 660 pb
(Gambar 2.). Hal ini menunjukkan
bahwa proses amplifikasi berjalan
dengan baik dan menghasilkan fragmen
yang berukuran panjang. Menurut Zein
& Prawiradilaga (2014), berhasil atau
tidaknya amplifikasi daerah target sangat
ditentukan
oleh
kondisi
primer,
penempelan primer pada DNA genom
sampel yang digunakan. Selain itu, juga
dipengaruhi oleh bahan pereaksi PCR.
Ratnayani et al. (2007) mengemukakan
bahwa dihasilkannya pita tunggal
menandakan pasangan primer yang
digunakan
bersifat
spesifik
dan
menempel pada posisi yang diharapkan
(pada
kondisi
annealing
yang
digunakan).
Repository FMIPA
Gambar 2. Hasil amplifikasi PCR fragmen
gen COX3 ikan K. limpok.
Keterangan: (M) DNA ladder;
(A)
Sungai
Kampar;(B)
Sungai Tapung; (C) Sungai
Indragiri Hulu
KESIMPULAN
Dari 10 sampel otot ekor ikan K.
limpok yang memiliki DNA total utuh
dan tidak smear ada sebanyak 4 sampel
dari Sungai Kampar, 3 sampel dari
Sungai Tapung, dan 2 sampel dari
Sungai Indragiri Hulu Provinsi Riau.
Konsentrasi DNA total berkisar ±300
ng/µl. Fragmen gen COX3 yang didapat
dari amplifikasi PCR berukuran 660 pb.
Fragmen yang panjang selanjutnya dapat
digunakan untuk analisis kekerabatan
dan keanekaragaman genetik.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih
kepada DP2M DIKTI yang telah
mendanai penelitian ini melalui Hibah
Kompetensi tahun anggaran 2015 atas
nama Dr. Roza Elvyra, M.Si dan Dr.
Dewi Indriyani Roslim, M.Si.
DAFTAR PUSTAKA
Elvyra R, Duryadi D. 2007. Kajian
penanda genetik gen sitokrom b
dna mitokondria ikan lais dari
4
Sungai Kampar Riau. J. Natur
Ind 10: 6-12.
Elvyra R. 2009. Kajian keragaman
genetik dan biologi reproduksi
ikan lais di Sungai Kampar Riau
[disertasi]. Bogor: Program Pasca
Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Kottelat M, Whitten AJ, Kartikasari SN,
Wirdjoatmodjo
S.
1993.
Freshwater Fishes of Western
Indonesia and Sulawesi. Jakarta:
Periplus Edition (HK) inCwith
The Environment Rep. of
Indonesia.
Repository FMIPA
Ratnayani K, Wirajana IN, Laksmiwati
AAIAM. 2007. Analisis variasi
nukleotida daerah D-loop DNA
mitokondria pada satu individu
suku bali normal. Jurnal Kimia 1
(1): 7-14.
Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi
PCR. Yogyakarta: Penerbit Andi.
Zein MSA, Prawiradilaga DM. 2014.
DNA Barcode Fauna Indonesia.
Jakarta: Kencana.
5