ISOLASI DAN KARAKTERISASI

ISOLASI DAN KARAKTERISASI
ACTINOMYCETES-ASOSIASI SPONS PENGHASIL
ANTIBIOTIK KOLEKSI PULAU BARRANG LOMPO
MAKASSAR
DISERTASI
Oleh
Herlina Rante
07/264423/SFA/28
Promotor : Prof. Dr. Wahyono, SU., Apt
Co-Promotor : Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt
Co-Promotor : Dr.rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si., Apt
PROGRAM STUDI FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2012
ABSTRAK
Actinomycetes merupakan jenis mikroorganisme yang sangat penting
sebagai penghasil metabolit sekunder untuk pengobatan. Senyawa bioaktif dari
mikroba diperoleh melalui serangkaian penapisan untuk menghasilkan suatu
senyawa antibakteri.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan
mengindentifikasi bakteri actinomycetes dari spons yang berasal dari pulau
Barranglompo Makassar dan mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa
antibakteri secara bioassay guided fractination
Isolasi Actinomycetes dari spons dilakukan dengan metode spread plate
menggunakan
media SNA (Starch Nitrate Agar).
Identifikasi bakteri
Actinomycetes berdasarkan bentuk morfologi dan fisiologi serta karakter
molekuler dengan gen16S rRNA. Deteksi gen Non-Ribosom Peptida Sintetase
(NRPS) dilakukan untuk mengetahui korelasinya terhadap senyawa antibakteri
yang dihasilkan. Isolat actinomycetes yang paling aktif difermentasi dan
diekstraksi dengan etil asetat. Pemisahan senyawa antibakteri dilakukan dengan
metode kromatografi cair vakum dan KLT preparatif. Struktur senyawa aktifnya
ditentukan berdasarkan data spektrum UV-Vis, IR, 1H-NMR, 13C-NMR, 2D
NMR, dan spektrum massa.
Karakterisasi secara molekuler menunjukkan bahwa isolat actinomycetes
memiliki hubungan kekerabatan yang paling dekat dengan Streptomyces parvulus
dan Uncultured Streptomyces sp. dengan nilai similaritas 81,68%. Hasil yang
diperoleh dari karakterisasi senyawa antibakteri berdasarkan data-data yang ada
menunjukkan bahwa senyawa tersebut mengarah kepada actinomycin D atau
Dactinomycin. Hal ini didukung oleh hasil sekuensing gen NRPS menunjukkan
adanya kemiripan dengan S. parvulus yang diketahui menghasilkan metabolit
sekunder dari kelompok senyawa peptida salah satunya Actinomycin D
(Dactinomycin). Kadar hambat minimal 0,0195 µg/ml terhadap Staphylococcus.
aureus resisten antibiotik
Kata kunci : actinomycetes asosiasi spons,
dactinomycin, Streptomyces parvulus
S. aureus
resisten antibiotik,
RINGKASAN
Peningkatan terapi antimikroba dan penemuan anggota-anggota baru
golongan antimikroba melalui cara penapisan kimia sintetik atau fermentasi,
memacu perkembangan produksi senyawa
antimikroba selama dasawarsa
terakhir. Di sisi lain permasalahan resistensi antimikroba juga semakin meningkat
seiring dengan peningkatan penggunaannya. Hal ini memicu dilakukannya
eksplorasi dan kajian potensi terhadap sumber daya alam sebagai upaya mengatasi
masalah resistensi ini.
Data dari National Cancer Institute Washington, yang telah melakukan
proses skrining menunjukkan bahwa beberapa biota laut memiliki aktivitas
biologi. Lebih dari 20 kategori senyawa bioaktif yang berbeda-beda telah
ditemukan, seperti antivirus, antibiotik, antiinflamasi, antileukimia, dan
insektisidal, sitotoksin, antihelmentik dan antikanker (Burrens dan Clement, 1993;
Crews dan Hunter, 1993). Senyawa bioaktif tersebut umumnya ditemukan pada
kelompok spons laut (Zhang et al., 2006).
Adanya dugaan bahwa keberagaman dan keberadaan senyawa bioaktif yang
tinggi dari spons berhubungan dengan asosiasi bakteri yang melimpah dalam
spons laut (Zhang et al., 2009). Beberapa mikrobia yang ditemukan berasosiasi
dengan spons juga menghasilkan komponen bioaktif . Bakteri dapat berkontribusi
hingga 40 % dari biomassa spons ( setara dengan sekitar 108 – 109 bakteri/g
jaringan) dan kemungkinan berasosiasi secara permanen dengan spon inang
(G&himathi et al., 2008). Beberapa studi membuktikan bahwa bakteri yang
berasosiasi
dengan
spons
merupakan
sumber
senyawa
bioaktif
yang
sesungguhnya dari beberapa produk bahan alam yang dihasilkan oleh spons.
Sehingga mikroorganisme laut, terutama yang berasosiasi dengan spons menjadi
salah satu fokus penelitian dalam mikrobiologi dan produk bahan alam laut
(Zhang et al., 2009). Mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons merupakan
sumber senyawa bioaktif yang menjanjikan dalam pencarian produk hayati laut,
yang menghasilkan senyawa bioaktif dengan berbagai aktivitas biologi. Mikrobia
tersebut, misalnya kelompok actinomycetes.
Hasil sekuen 16S rRNA terhadap isolat actinomycetes BLP 20 menunjukkan
hubungan kekerabatan paling dekat dengan spesies Uncultured Streptomyces sp dan
S. parvulus. Berdasarkan pada pohon filogeni dan nilai similaritas sekuen 16S
rRNA menunjukkan bahwa isolat BLP 20 merupakan anggota Streptomyces
dengan nilai similaritas 81,68 % . berdasarkan perbedaan nukleotida antara strain
20/BLP dengan Uncultured Streptomyces sp dan S. parvulus terlihat bahwa dari
1348 jumlah nukleotida ada 247 yang memiliki perbedaan dengan similaritas
81,68%. Hal ini sesuai juga dengan analisis filogenetiknya yang menunjukkan
bahwa strain 20/BLP memiliki kekerabatan yang lebih dekat dengan Uncultured
Streptomyces sp dan S. parvulus.
Hasil sekuen gen NRPS selanjutnyadi BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) melalui http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Hasil BLAST
menunjukkan bahwa urutan nukleotida gen NRPS BLP 20, memiliki kemiripan
paling tinggi dengan Streptomyces parvulus dengan nilai similaritas sebesar 99% .
S. parvulus memproduksi beberapa senyawa bioaktif diantaranya Actinomycin D
atau Dactinomycin (Chin & Tseng, 1992; Rahman et al., 2010).
Berdasarkan data-data spektrum pendukung (UV, NMR, LC-MS) serta referensi
pendukung dan sekuen gen NRPS dapat disimpulkan bahwa senyawa yang
dihasilkan oleh isolat actinomycetes terpilih (20/BLP)
mengarah kepada
senyawa Actinomycin D (Dactinomycin). Isolat actinomycetes 20/BLP mampu
menghasilkan senyawa antibakteri dengan kadar hambat minimal 0,0195 µg/ml
terhadap Staphylococcus. aureus resisten antibiotik