BAB III. METODE PENELITIAN 3.1. Jenis dan

BAB III. METODE PENELITIAN
3.1. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan pendekatan Pretest
Posttest with Control Group Design menggunakan hewan.
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian
3.2.1. Waktu penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 41 hari, dengan rincian 7 hari aklimitasi, 5
hari induksi, 28 hari perlakuan dan satu hari digunakan untuk penghitungan
terakhir kadar LDL dan HDL.
3.2.2. Tempat penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi (PAU)
Universitas Gadjah Mada.
3.3. Populasi dan Subyek Penelitian
Dalam penelitian ini terdapat empat kelompok tikus yaitu:
a.
K1 (kontrol normal) adalah tikus tanpa induksi DM yang diberi plasebo
CMC 0,5% per oral.
b.
K2 (kontrol negatif) adalah tikus Dislipidemia DM yang diberi plasebo
CMC 0,5% per oral.
c.
K3 adalah tikus Dislipidemia DM yang diberi glibenklamid
0,18mg/200g BB/ tikus per oral.
d.
K4 adalah tikus Dislipidemia DM yang diberi kombinasi jus Aloe vera
3,6 ml/200 g BB/tikus dan glibenklamid 0,18 mg/200 g BB/tikus per
oral.
Kriteria Inklusi
1. Tikus Putih galur wistar jantan
2. Berat badan tikus antara 180-250g
3. Usia tikus sekitar 2-3 bulan
30
4. Tikus sehat dan telah melewati aklitimasi selama tujuh hari
5. Dislipidemia kadar LDL > 27,7 mg/dl Herwiyarirasanta (2010) dan
kadar HDL < 35 mg/dl (Schaerfer et al. dalam Hartoyo et al, 2008).
6. Diabetes Kadar GDP > 150 mg/dl
Kriteria Eksklusi
1. Berat badan tikus kurang dari 180g atau lebih dari 250 g setelah
aklitimasi
2. Tikus sakit atau mati saat aklitimasi
Menurut WHO jumlah minimal sampel yang dibutuhkan setiap kelompok
perlakuan adalah lima ekor, sehingga dibutuhkan 20 ekor tikus dalam penelitian
ini. Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan dewasa
galur wistar (Rattus novergicus) dengan umur sekitar 2-3 bulan dan berat badan
180-250 gram. Subyek diperoleh dari laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
3.4. Variabel Penelitian
3.4.1. Variabel Bebas
Variabel bebas dari penelitian ini adalah jus Lidah buaya dan glibenklamid,
dengan dosis yang diberikan adalah sebanyak 3,6 ml/200g BB tikus untuk jus
lidah buaya dan 0,18 mg/200g BB tikus Glibenklamid setiap harinya, dosis
tersebut didapatkan berdasarkan konversi Laurence Bacharach (Hapsari, 2014)
3.4.2. Variabel Tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar LDL dan HDL yang
diukur pada pre-induksi, post-induksi, dan post-perlakuan.
3.4.3. Variabel Pengaruh Terkendali
a. Variabel Subyek
Tikus putih galur wistar dengan jenis kelamin jantan berusia dewasa 2-3
bulan dan berat badannya 180-250 gram.
31
b. Variabel Perawatan
Seluruh subyek diberikan pakan dengan jenis,jumlah, dan cara yang sama
setiap harinya yaitu pakan dan minum secara ad libitum.
c. Variabel Bahan coba
Pemberian Jus lidah buaya dan Glibenklamid, diberikan dengan jumlah
dosis dan cara yang sama pada setiap tikusnya yaitu dengan sonde oral.
3.5. Definisi operasional
a. Jus Aloe vera adalah bagian gel Aloe vera yang telah dikupas dan
dihilangkan eksudatnya setelah itu diblender sampai halus.
b. Sonde oral adalah cara memasukan obat atau Aloe vera dengan
menengadahkan kepala tikus dan membuka mulutnya kemudian
memasukan jarum sampai esofagus dan cairan obat dimasukan.
c. Glibenklamid adalah obat sintetis dalam bentuk farmagrid serbuk
d. LDL
adalah
kadar
profil
plasma
darah
yang
diukur
secara
spektrofotometri dan akan diperiksa pada pre-induksi, post-induksi, dan
post-perlakuan.
e. HDL adalah kadar
profil
plasma darah
yang
diukur
secara
spektrofotometri dan akan diperiksa pada pre-induksi, post-induksi, dan
post-perlakuan.
f. Diabetes Melitus adalah kenaikan kadar glukosa jika dilakukan
pemeriksaan kadar kadar glukosa darah puasa (>150 mg/dl).
g. Model tikus dislipidemia diabetes adalah tikus dalam keadaan diabetes
melitus tipe 2 dengan karakteristik peningkatan kadar Lipid (kadar LDL
< 7-27,7 mg/dl serta kadar HDL < 35-85 mg/dl) dan peningkatan
glukosa darah (> 150 mg/dl) dan yang diinduksi dengan streptozotosin
dan nikotinamid.
h. Pre-Induksi adalah adalah pengambilan dan pemeriksaan kadar HDL
dan LDL setelah aklimatisasi selama 7 hari.
32
i. Post-Induksi adalah pengambilan dan pemeriksaan kadar HDL dan LDL
setelah
lima hari diinduksi streptozotosin dan nikotinamid sebelum
diberikan perlakuan.
j. Post-Perlakuan adalah pengambilan dan pemeriksaan HDL dan LDL
pada akhir perlakuan.
k. K1 adalah kelompok kontrol normal hanya menerima pakan dan minum
adlibitum tanpa diinduksi streptozotosin dan nikotinamid.
l. K2, K3, K4 dan adalah kelompok diabetes yang diinduksi Streptozotosin
dan Nikotinamid.
3.6. Instrumen Penelitian
3.6.1. Alat
a.
Timbangan elektrik dan mistar dengan merk shimizu buatan China.
b.
Sonde oral
c.
Kandang tikus yang didapat dari lab. PAU
d.
Blender dengan merk “Linux” buatan China.
e.
Spuit injeksi
f.
Alat pengukur glukosa, HDL dan LDL yaitu spektrofotometer.
g.
Lemari pengering
h.
Air akuades
3.6.2. Bahan
a.
Jus Aloe vera sebesar 3,6 ml/200g bb/tikus
b.
Akuades
c.
Glibenklamid dalam bentuk farmagrid serbuk yang di dapatkan dari
PT IFARS
d.
Tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar yang didapatkan di
laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM.
e.
Pakan standar (Br2) merk “Comfeed” AD II yang diproduksi oleh
PT. Japfa Comfeed Indonesia, Tbk. Dengan No 157794.
33
3.7. Tahap Penelitian
Penyiapan Bahan Uji
a.
Determinasi tanaman
Determinasi tanaman Aloe vera dilakukan di Laboratorium Sistematika
Tumbuhan Fakultas Biologi UGM. Berdasarkan hasil determinasi tersebut, jenis
Aloe vera yang digunakan untuk penelitian ini adalah Familia Liliaceae, Genus
Aloe, Spesies Aloe vera (L.) Webb.
b.
Pembuatan jus Aloe vera
Bahan yang digunakan untuk pembuatan jus adalah bagian dari gel Aloe
vera jenis Aloe vera (L.) Webb.. Aloe vera yang dipilih adalah memiliki berat
0,90-1,5 kg, kemiringannya 30-45o terhadap permukaan tanah, panjangnya 50
sampai 65 cm, lebar 7- 10 cm dan tebal 18,5 - 25,0 mm. Daun yang diambil
yaitu daun yang letaknya paling bawah (Tavip, 2010). Untuk pembuatan jus
Aloe vera dimulai dari pencucian Aloe vera dengan air bersih kemudian kulitnya
dikupas, setelah itu dicuci dengan air hangat kuku untuk menghilangkan eksudat
karena terasa pahit dan langkah selanjutnya diblender sampai halus dan disaring.
Jumlah jus lidah buaya yang diberikan pada manusia adalah 200ml/hari,
kemudian berdasarkan konversi Laurence Bacharach yaitu setiap 200 gr BB
tikus setara dengan 0,018 x dosis manusia maka dosis pada tikus adalah 0,018 x
200 = 3,6 ml/200grBB/hari (Hapsari, 2014).
c.
Pembuatan suspensi glibenklamid
Dosis glibenklamid yang dapat
diberikan untuk tikus agar efektif
menurunkan kadar glukosa darah adalah 10 mg (Rambiritch et al., 2014), selain
itu uji pendahuluan yang telah dilakukan bahwa dosis 10 mg tidak menyebabkan
tikus menjadi hipoglikemik dan kadar kolesterolnya mendekati normal.
Untuk itu di gunakan dosis 10 mg yang dikonversikan dengan konversi
Laurence Bacharach, yaitu setiap 200g Bb tikus setara dengan 0,018 x Dosis
34
obat sehingga di dapatkan jumlah dosis 0,018 x 10 = 0,18 mg/ 200 g Bb tikus
(Triwidyana,2011). Glibenklamid dilarutkan dengan menggunakan agen
pensuspensi Carboxyl Methyl Celulose (CMC) 0,5% (Pasaribu, 2012).
d.
Pembuatan larutan streptozotosin dan nikotinamid
Berdasarkan penelitian dosis nikotinamid dan streptozotosin untuk
menginduksi tikus diabetes tipe 2 adalah nikotinamid 230 mg/kg yang dilarutkan
dengan larutan PBS (Phosphat Buffeerd Saline) dan streptozotosin dengan dosis
65 mg/kg dilarutkan dengan buffer sitrat dengan ph 4,5 secara intraperitoneal
(i.p.) (Szkudelski, 2012).
b.
Penyiapan hewan uji
Pada penelitian ini dibutuhkan tikus putih jantan (Rattus novergicus) strain
wistar sebanyak 20 tikus, dengan berat badan antara 180-250 gram. Sebelum
dilakukan penelitian, tikus di aklimatisasi atau diadaptasi terlebih dahulu selama
7 hari agar menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru. Selama aklimatisasi
tikus diberikan pakan standar (Br2) dan minum secara ad libitum serta diamati
keadaan umum dan berat badannya (Wulandah, 2011).
c.
Pembagian hewan uji
Semua tikus dibagi menjadi dua kelompok secara acak, kelompok satu
merupakan kelompok kontrol normal (K1) yang terdiri dari lima ekor tikus,
sedangkan kelompok lainnya sebagai kelompok dislipidemia diabetes yang
terdiri dari 15 ekor tikus, yang kemudian dibagi menjadi tiga kelompok secara
acak yaitu, kelompok kontrol negatif (K2), kelompok glibenklamid (K3),
kelompok kombinasi glibenklamid dan Aloe vera (K4).
Tabel 9. Kelompok kontrol dan Kelompok Dislipidemia Diabetes
Kelompok Kontrol
Kelompok
Dislipidemia
Diabetes
Kode Kelompok
K1
K2, K3, dan K4
Jumlah Tikus
Lima tikus/kelompok
Lima tikus/ kelompok
35
d.
Induksi diabetes pada tikus
Sebelum diinduksi, tikus diperiksa kadar glukosa pre-induksi pada semua
kelompok. Induksi tikus hanya dilakukan pada kelompok II, III dan IV
menggunakan nikotinamid, 15 menit kemudian dilanjutkan dengan streptozotosin
secara ip pada semua tikus.
Setelah diinduksi tetap diberikan pakan dan minum ad libitum pada semua
kelompok tikus. Selanjutnya, tikus diperiksa kadar glukosa darah, HDL dan LDL
post-induksi pada semua kelompok. Parameter keberhasilan induksi adalah kadar
glukosa darah puasa tikus melebihi 150 mg/dl (Dewi, 2014).
e.
Pembagian hewan uji
Setelah 15 tikus kelompok diabetes memenuhi kriteri Dislipidemia DM
maka dibagi secara acak menjadi 3 kelompok Dislipidemia DM. Pembagian
kelompok sebagai berikut:
Tabel 10. Perlakuan Pada Masing-masing Kelompok
Kelompok
K1
K2
K3
K4
Perlakuan
Jumlah
Tikus
5
Tikus tanpa induksi yang diberikan plasebo
yaitu CMC 0,5 % per oral.
Tikus Dislipidemia DM yang diberikan
5
plasebo yaitu CMC 0,5 % per oral.
Tikus Dislipidemia DM yang diberikan
5
glibenklamid sebesar 0,18 mg/200g
BB/tikus/hari per oral.
Tikus Dislipidemia DM yang diberikan
5
kombinasi jus Aloe vera sebesar 3,6
ml/200 g BB/hari dan glibenklamid 0,18
mg/200g BB/tikus/hari per oral.
Perlakuan plasebo, glibenklamid serta kombinasi jus dan glibenklamid
diberikan satu kali sehari pada pagi hari (waktu dan jam yang sama) dengan cara
sonde oral, selanjutnya diberikan pakan standar (Br2) dan minum ad libitum pada
semua kelompok. Sebelum diberi perlakuan tikus ditimbang terlebih dahulu untuk
menentukan dosis obat glibenklamid dan jus Aloe vera. Perlakuan diberikan
selama 28 hari.
36
f.
Pengambilan sampel darah
Darah yang diambil berasal dari sinus orbital. Pengukuran kadar LDL dan
HDL pada pre-induksi, post-induksi, post-perlakuan menggunakan alat
spektrofotometer. Metode pemeriksaan LDL dan HDL dengan menggunakan
GOD-PAP dan CHOD-PAP dengan prinsip spektrofotometer (Rifai dan warnick,
2006 ). Sebelum dilakukan pengambilan darah, tikus di anestesi terlebih dahulu
secara intramuskular dengan ketamin hidroklorida 20 mg/kg bb tikus.
Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada pre-induksi dan post-induksi
yang menggunakan alat spektrofotometer dengan metode GOD-PAP. Metode ini
diawali dengan pengambilan darah pada tikus dengan spuit sebanyak 0,5 ml
kemudian disentrifus 4000 rpm selama 15 menit. Setelah itu ambil plasma
sebanyak 10 mikrolab dan dicampur dengan reagen GOD PAP 1000 mikrolab
dengan menggunakan alat vortex, kemudian di inkubasi selama 20 menit dengan
suhu 20-250 C. Tahap terakhir kadar glukosa dibaca dengan gelombang 500 nm.
Teknik pengukuran LDL dilakukan pada pre-induksi, post-induksi dan postperlakuan menggunakan alat spektrofotometer dengan metode CHOD-PAP.
Metode ini diawali dengan pengambilan darah pada tikus dengan spuit sebanyak
0,5 ml kemudian disentrifus 4000 rpm selama 15 menit. Setelah itu ambil
plasma sebanyak 100 µL sebagai sampel dan ditambah reagent LDL presipitans
sebanyak 1000 µL kemudian dicampur dengan menggunakan alat vortex,
kemudian di inkubasi selama 15 menit dengan suhu 20-250C. Tahap terakhir
kadar LDL dibaca dengan gelombang 546 nm.
Teknik pengukuran HDL dilakukan pada pre-induksi, post-induksi dan postperlakuan menggunakan alat spektrofotometer dengan metode CHOD-PAP.
Metode ini diawali dengan pengambilan darah pada tikus dengan spuit sebanyak
0,5 ml kemudian disentrifus 4000 rpm selama 15 menit. Setelah itu ambil
plasma sebanyak 200 µL sebagai sampel dan ditambah reagent HDL presipitans
sebanyak 500 µL kemudian dicampur dengan menggunakan alat vortex,
37
kemudian di inkubasi selama 15 menit dengan suhu 20-250C. Tahap terakhir
kadar HDL dibaca dengan gelombang 546 nm.
38
Uraian diatas dapat digambarkan sebagai berikut :
20 ekor tikus putih jantan (Rattus novergicus) strain wistar
Aklimatisasi selama 7 hari
Pembagian Kelompok
5 ekor tikus
15 ekor tikus
Kelompok 1
(kontrol normal)
Kelompok II
(kontrol
negatif)
Kelompok III
Kelompok IV
Pemeriksaan kadar GDP, LDL, HDL Pre-induksi
Induksi dengan STZ dan nikotinamid
Setelah 5 hari diperiksa GDP, LDL dan HDL Post-Induksi dan dibagi
secara acak menjadi 4 kelompok
K1
Tikus tanpa
induksi dan
diberikan
placebo
CMC 0,5%
K2
Tikus
Dislipidem
ia DM yang
diberikan
plasebo yaitu
CMC 0,5 %
K3
K4
Tikus Dislipidemia
DM yang
diberikan
glibenklamid
sebesar 0,18
mg/200g
BB/tikus/hari
Tikus Dislipidemia DM
yang diberikan
kombinasi
glibenklamid
sebanyak 0,18 mg/
200g BB/ tikus/
hari. dan jus Aloe
vera sebanyak 3,6
ml/ 200 g BB/ tikus
Post-Perlakuan, diberikan selama 28 hari pada pagi hari (waktu dan jam yang sama).
Pemeriksaan LDL dan HDL.
Analisis Data
Gambar 7. Tahapan Penelitian
39
3.8. Rencana Analisis Data
Analisis hasil LDL dan HDL darah post-induksi menggunakan T-Test
berpasangan. Analisis data selama perlakuan pada semua kelompok tikus dapat
dilakukan dengan uji One Way Anova. Semua data sebelumnya dihitung ratarata dan standar deviasinya, karena subyek kurang dari 50 untuk menganalisis
sebaran data kelompok, dilakukan uji Shapiro-Wilk. Apabila varian data dan
sebarannya tidak terdistribusi normal maka dilakukan uji Kruskal Willis.
Analisis statistik menggunakan aplikasi IBM SPSS statistik 21 (nomor lisensi
QA3AM8U62Z4ZWTSPV44VXI65P590LE547WHIQVZYWLARL9JEYQE
GDUBLH8Z3ZCJAL3FLXM398V95TSDYI7POEXUPRR)
3.9. Etika Penelitian
Penelitian ini dilakukan di PAU UGM selama 41 hari , dengan metode dan
cara yang benar serta jujur dalam pengolahan data, proses pengambilan sampel
darah dilakukan dengan cara yang benar dan hati-hati agar tikus tidak
menderita. Agar tikus tidak merasa sakit maka dilakukan anastesi dengan
ketamin, pemberian pakan dan minum serta pembersihan kandang dilakukan
secara teratur dan diperhatikan setiap hari. Persetujuan etika penelitian telah
diajukan ke Komite Etik Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
3.10. Jadwal Penelitian
Karena penelitian ini merupakan penelitian payung bersama beberapa
rekan mahasiswa dan dosen pembimbing maka, jadwal penelitian sudah
terlebih dahulu dilaksanakan sebelumnya.
Tabel 11. Jadwal pelaksanaan penelitian
No
1
2
3
4
5
Kegiatan
Penyusunan Propostal
Penelitian
Seminar Propostal
Penyusunan Hasil
Seminar Hasil
Bulan
Januari – Mei 2015
Januari – Februari 2015
Mei 2015
Juli-Desember 2015
Januari 2016
40