pengaruh cara penambahan enzim glukoamilase dan ion logam

PENGARUH CARA PENAMBAHAN ENZIM GLUKOAMILASE
DAN ION LOGAM ALKALI DAN ALKALI TANAH
PADA PROSES SAKARIFIKASI PATI SAGU
A.T. Karossl", Agus Muchliawan**, Linar Z.Udin* dan A. Sidik**
*
Laboratorium
**
Biokimia, Balitbang Kimia Dasar, Puslitbang Kimia Terapan - LlPI Bandung.
Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia, FMIPA-UNPAD, Bandung
INTISARI
Pembuatan
sirup
glukosa
dapat
dilakukan
dengan
menggunakan enzim alfa-amilase dan enzim glukoamilase. Alfaamilase berperan pada tahap likuifaksi, sedangkan glukoamilase
pada tahap sakarifikasi. Glukoamilase yang digunakan pada
penelitian ini diperoleh dari Rhlzopus oryzae melalui fermentasi
selama lima hari dengan menggunakan
[ermentor LKB skala
empat liter. Penambahan enzim glukoamilase secara langsung
dan bertahap, tidak memberikan perbedaan yang bermakna
terhadap proses sakarifikasi. Ion-ion Li+, Na+, K+, Mgr+, Ca++
dan Bar+ pada konsentrasi 0,2 - 0,8 mM, bertindak sebagai
aktivator bagi enzim glukoamilase, sedangkan pada konsentrasi 1
mM ion-ion logam tersebut bersifat sebagai inhibitor. Dari hasil
analisis dengan HPLC terbukti bahwa enzim glukoamilase
menghasllkan glukosa pada proses sakarifikasi hingga derajat
hidrolisis 83,3%.
enzim yang dapat memecah ikatan alfa-1,4 dari ujung
rantai non pereduksi dan juga ikatan alfa-1,6 (2).
Sagu
sebagai
substrat,
merupakan
polisakarida
dengan fraksi amilopektin sekitar 73 % dan amilosa
sebanyak 27% (3), dengan demikian sagu memiliki fraksi
amilosa yang Iebih besar atau amilopektin yang lebih
sedikit, dibandingkan dengan beras, kentang, tapioka, gandum, maupun ubi jalar (4).
Penelitian mengenai proses Iikuifaksi dan sakarifikasi
dengan menggunakan enzim alfa-amilase dan glukoamilase
untuk substrat sagu, serta pengaruh logam terbadap aktivitas enzim glukoamilase belum banyak dilaporkan (3).
Pada tulisan ini dilaporkan pengaruh cara penambahan
enzim glukoamilase terbadap sakarifikasi pada substrat
sagu dan pengarub ion-ion logam Li+, Na+, K+, Mg+r, Ca+
dan Ba+ pada aktivitas enzim glukoamilase.
ABSTRACT
MATERI DAN METODA
Production of glucose syrup enzymatically employs both
alpha-amylase and glucoamylase. Alpha amylase acts during
liquifaction while glucoamylase in the saccharification process.
In the present study the glucoamylase
was obtained from
Rhyzopus oryzae fermentation for five days using 4 liter scale
LKB fermentor. The influence of single stage and multiple stage
additions of glucoamylase on alpha amylase liquified sago starch
indicated no significant difference on the saccharification. The
presence of 0.2 - 0.8 mM Li+, Na+, K+, Mgr+, Ca++ and-Bar+
salts enchanced the glucoamylase
activity whereas at the level
of 1mM they acted as inhibitors. The results of HPLC analysis of
the saccharification
product showed that the glucoamylase
hydrolysed 83.3% of the sago starch yielding free glucose.
Rhizopus oryzae berasal dari koleksi mikroorganisma,
Puslitbang Kimia Terapan-LIPL Pati sagu dari jenis metroxylon dan alfa-amilase dari Wako Pure Chemical Industries.
PENDAHULUAN
Dalam pembuatan sirup glukosa dibutubkan dua jenis
cnzim, yaitu alfa-amilase dan glukoamilase. Alfa-amilase
(al fa-I, 4-glukan-4-glukobidrolase,
BC 3.2.1.1.) adala h
endo-enzim yang memecah ikatan alfa-(1,4) secara acak
(1), scdangkan glukoam ilase atau amilo-glukosidase (alfa1,4-glukan glukohidrolasc, BC 3.2.1.3.), mcrupakan ekso-
JKTI, VOL. 5 - No.1, Juni, 1995
Produksi Glukoamilase
Produksi enzim dilakukan dengan menggunakan fermentor kapasitas 4 Liter dalam media yang mengandung
pati sagu 2%, bungkil kedele 0,7% (kandungan nitrogen
dalam media 0,05%) dan mineral, yang diinokulasikan
dengan suspensi biakan murni R. oryzae yang berumur 7
bari. Proses fennentasi dilakukan pada subu 30°C ±l°C
dengan aerasi 3 L/menit dan agitasi 500 rpm.
Kaldu fermentasi disentrifuga pada 8000 rpm (2°C)
selama 20 meuit. Supernatan yang diperoleb digunakan
sebagai enzim kasar (5). Aktivitas enzim ditentukan dcngan
menggunakan metoda yang telab dilaporkan oleb Karossi
et al (6). Unit aktivitas ditentukan dengan meuggunakan
glukoamilase standar (SIGMA) sebagai pembanding. Kadar
protein enzim ditentukan dengan metoda Lowry (7) dan
mcngguuakan Bovine Serum Albumin sebagai standar
protein.
33
Konstanta Michaelis (Km)
Penentuan harga Km dilakukan sama seperti pada
penentuan aktivitas enzim. Pada penentuan ini konsentrasi
soluble starch bervariasi. Harga Km diperoleh dari kurva
Lineweaver-Burk (8).
2A
'2
.~
ec.
.€'"
~
E
<,
~
Ul
Hidrolisis total sagu
Hidrolisis total sagu dilakukan dengan merefluks sagu
dalam 25 mL HCI 1 N dan air suling 100 mL, selama 32
jam. Kemudian larutan dinetralkan dengan 125 mL NaOH
0,2 N, dan diencerkan sampai 250 mL dengan air suling.
Gula yang dihasilkan dianalisa dengan metoda NelsonSomogyi (9). Dari hasil hidrolisis total ini diperoleh 989,91
mg glukosa dari 1000 mg sagu.
Likuifaksi
Likuifaksi pati sagu dilakukan pada pH 7 dan temperatur 95°C dengan menggunakan enzim alfa-amilase standar dari Wako, dengan aktivitas sebesar 20 V/mL selama 2
jam (10). Konsentrasi substrat pati sagu yang digunakan
adalah 12,5% (berat/volume), Likuifaksi dilakukan dengan
menggunakan variasi volume enzim (1-6 mL) alfa-amilase,
kemudian gula pereduksi yang dihasilkan ditentukan
dengan metoda Nelson-Somogyi.
«
t:
>
;::
2-
1.6
'"
ii
Vi
w 1.2n,
I
c.
Ul
~
s
;::
0.8
'" «'"
«
0.4
0
0
8
6
Gambar
1. Perubahan pH (e). aktivitas (0) dan aktivitas spesifik enzirn
( 0 ) selarna 10 hari fermentasi.
Harga Km enzim kasar glukoamilase hasil fermentasi,
yang digunakan dalam proses sakarifikasi pada penelitian
ini (aktivitas 2,53 U/mL) ditentukan pada pH 4,5dengan
menggunakan soluble starch sebagai substrat. Hasil yang
diperlihatkan dalam Gambar 2, menunjukkan harga Km
enzim 1,6526 mg/mL.
--'-.
Vrncks.
Sakaritlkasi
Sakarifikasi dilakukan pada temperatur 55°C dan pH
4,5 selama 20 jam dengan menggunakan
enzim yang
diperoleh dari hasil fermentasi 5 hari (Aktivitas 2,53 V/
mL). Sakarifikasi berlangsung menggunakan pengocok
130 guncangan/menit
dengan penangas air. Gula yang
dihasilkan ditentukan dengan metoda Nelson-Somogyi, dan
dengan HPLC (9).
Proses sakarifikasi berlangsung selama 6 jam dengan
memvariasikan volume enzim (0-5 mL) dan gula yang
dihasilkan ditentukan dengan metoda Nelson-Somogyi.
Cara penambahan enzim glukoamilase
Proses sakarifikasi dilakukan dengan menambahkan enzim
secara langsung (5 mL, 2,53 U/mL) dan bertahap setiap
tiga jam (masing-masing 1 mL). Selang 2 jam selama 20
jam sakarifikasi, jumlah gula yang dihasilkan diukur
dengan metoda Nelson-Somogyi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
10
WAKTU FERMENTASI (HARI)
'0
.+
+
/+
8
,
ve
(~it)
"
,
2
-Km
-0,7
-0,5
-0,3
1/[5]
Gambar
-0,1
0
0,'
0,2
(mllmg)
2. Penentuan harga Krn.
Sebelum tahap sakarifikasi menggunakan enzim glukoamilase, tahap yang dilakukan terlebih dahulu adalah
likuifaksi dengan enzim alfa-amilase. Dari variasi volume
enzim alfa-amilase yang digunakan (Gambar 3) terlihat
bahwa mulai volume enzim 4 mL (1 mL = 20 Unit), jumlah
gula pereduksi yang dihasilkan hampir sarna.
~
3~0
Vi
Fermentasi glukoamilase
Pada fermentasi yang dilakukan selama 10 hari dengan
pengambilan contoh setiap 24 jam, pH terlihat menu run
sampai hari ketiga (Gambar 1) mencapai pH 3,6 dan
kemudian terjadi peningkatan yang dimulai pada hari
keempat. Produksi enzim dengan aktivitas tertinggi terjadi
pada hari kelima sebesar 0,654 U/mL atau aktivitas spesifik
2,29 U/mg protein, dan pH media mencapai pH 4,25.
34
'"::J
0
w
w
a:
300
0-
j
::>
'"
240
mL ENZIM
Gambar
3. Pengaruh volume enzim alfa-arnilase pada proses likuifaksi.
JKTI, VOL. 5 - No.1, Juni, 1995
Dengan demikian jika ditinjau dari efisiensi penggunaan enzim alfa-amilase untuk likuifaksi selama 2 jam, dapat
kita gunakan enzim sebanyak 4 mL. Waktu likuifaksi yang
digunakan di sini sesuai dengan penelitian Lee et al.(10).
Likuifaksi sangat menentukan hasil sakarifikasi, dengan
kata lain derajat likuifaksi berhubungan langsung dengan
jumlah pati yang dikonversi menjadi glukosa seIama proses
sakarifikasi (11). Hal ini dapat dimengerti karena proses
likuifaksi menyediakan substrat bagi proses sakarifikasi.
Glukoamilase sebagai enzim yang mampu memecah ikatan
alfa-1,6-glikosida
(rantai cabang) tentu lebih menyukai
substrat dengan bentuk yang lebih sederhana, misalnya
jumlah rantai cabang yang lebih sedikit sehingga reaksi
hidrolisis dapat berlangsung lebih cepat. Fujii et al. (12, 13)
mendapatkan bahwa aktivitas enzim alfa-amilase mempengaruhi jumIah gula yang dihasilkan pada proses sakarifikasi. Dengan bertambahnya konsentrasi enzim alfaamilase, maka kecepatan awal sakarifikasi meningkat.
o
1
0,9
mL
mL
2 ilL
3 mL
0,7
j
~
0,5
0,3
0,1
+---,----r---~-___,.__----,r---__l
°
Gambar
100
«oo
80
C, 3300
60
.5
:;
<!
..J
s
~
.~
40
2200
§
J:
1100
20
0
0
8
12
WAKTU
Gambar
16
20
(JAM)
S. Pengaruh cara penambahan
enzim terhadap sakarifikasi
digambarkan sebagai ju'llJa.lL h:· ';1 glukosa bebas
yang
terbentuk atau derajat hidro~.
__
• Penambahan langsung • Penambahan ber:ahap
?
Hasil dari percobaan ini (Gambar 5), menunjukkan
bahwa pada penambahan enzim secara langsung diperoleh
kecepatan awal yang lebih tinggi. Penambahan enzim
secara bertahap mampu menghidrolisis sagu hingga sekitar
70% pada jam ke-8 sedangkan pada penambahan enzim
secara iangsung baru dicapai pada jam ke-16. Namun
setelah dilakukan uji statistik (t test) dimulai jam keenam
sampai jam keduapuluh, ternyata kedua perlakuan ini tidak
memberikan perbedaan yang berarti terhadap derajat
hidrolisis pada tingkat kepercayaan 95%.
~ ~t
~
5500
2
6
WAKTU
4. Pengaruh variasi volume
sakarifikasi ..
(JAM)
enzim glukoamilase
pada proses
Pengaruh dari variasi volume enzim glukoamiiase pada
proses sakarifikasi dipeIajari dengan menggunakan volume
enzim 0 sid 5 mL; 2,53 U/mL (Gambar 4). Dari Gambar 4
dapat kita lihat bahwa dengan bertambahnya
volume
enzim, kecepatan awal sakarifikasi meningkat pula. Hasil
ini sesuai dengan yang dilakukan Lee et al.(lO) dalam
peneIitian sakarifikasi pad a pati kentang. Dari gambar di
atas terlihat bahwa tanpa penambahan enzim dapat dikatakan bahwa jumIah gula yang dihasilkan tidak bertambah.
Hal ini selain menunjukkan tidak ada aktivitas enzim alfaamiiase pada kondisi reaksi glukoamilase, juga meyakinkan
kita bahwa gula yang dihasilkan bukan disebabkan kondisi
asam pada reaksi enzimatis (pH 4,5), tetapi memang akibat
adanya aktivitas enzim giukoamiiase. Dari hasil ini maka
untuk sakarifikasi seIanjutnya enzim yang digunakan
adalah 0,5 mL untuk 5 mL substrat.
Pengaruh cara penambahan enzim
Pada sakarifikasi digunakan enzim glukoamiiase sebanyak 5 mL (11,65 Unit), dan diamati bagaimana pengaruh penambahan enzim secara langsung, dan bertahap
dengan penambahan 1 mL setiap tiga jam, sebanyak 5
tahap.
JKTI, VOL. 5 - No.1, Junl, 1995
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas glukoamilase
Ion-ion logam yang dipelajari pengaruhnya adalah Li+ ,
Na+, K+, Mg+, Ca+ dan Ba+t, Pada penelitian ini diamati
pengaruh variasi konsentrasi ion-ion logam tersebut terhadap aktivitas enzim giukoamilase.
Pada Gambar 6 dapat kita lihat bahwa pada konsentrasi
1 mM ion-ion tersebut bersifat inhibitor. Ion iogam Na+
menurunkan aktivitas hingga sekitar 60 %, sedangkan Ca+r
merupakan inhibitor yang paling lemah, menurunkan
aktivitas 40% dibandingkan ion logam lainnya.
•...
~
~
•...
~
•...
~
2
z
-•...
=>
VI
<!
I
=>
:>
~
<!
a:
=>
z
~
TL
Li
Na
K
ION
Gambar
Mg
Ca
Sa
LOGAM
6. Pengaruh logam Li+, Na+, K+, Mg+t, Ca+t dan Ba+r pada
aktivitas glukoamilase.
o Aktivitas
(Unit) ~
Penurunan aktivitas (%)
1L= Tanpa ion logam
35
Pada konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,2 mM
sampai 0,8 mM, ion Li+, Na+, K+, Mg+r, Ca= dan Ba+r
temyata bersifat aktivator bagi enzim glukoamilase, dan
untuk semua ion logam pada konsentrasi 0,2 mM memberikan sifat aktivator yang paling tinggi. Ion Ca+ temyata
paling besar pengaruhnya pada peningkatan aktivitas enzim
glukoamilase (Tabel 2).
500
400
<{
-..J
::J
Tabel2.
Aktivasi glukoamilase
Konsentrasi
(mM)
oleh ion logam alkali dan alkali tanah
<!)
Aktivitas Enzim
(Unit/mL)
11.
Li+
Na+
K+
3,667
3,619
3,474
3,494
3,368
3,320
3,300
3,706
3,484
3,426
3,204
3,320
3,165
3,001
3,011
MgH
Ca++
Ba++
23
0
____ -.-Efl:e"r angam
5
4
WAKTU
6
(JAM)
Garnbar 8. Pengaruh ion logam Ca++ pada sakarifikasi
11. Tanpa menggunakan ion logam.
Logam-logam diatas dalam bentuk
OH-
200
0
2,962
2,885
2;73'Q
0,2
z-
100
2,431
0,8
0,4
300
01
E
OPenambahan
kation
dan anionnya
berturut-turut
o Tanpa
cr, cr.cr, o-, OH-
Penggunaan ion logam Ca+t dalam sakarifikasi
Dari pengamatan mengenai pengaruh ion logam Li+,
Na+, K+, Mg+r, Ca+ dan Bat+, diperoleh bahwa ion logam
Ca+r menunjukkan sifat aktivator yang paling besar pada
konsentrasi 0,2 mM. Hasil ini dicoba untuk diterapkan pada
proses sakarifikasi, namun dengan konsentrasi ion Ca+ 0,8
mM. Hal ini untuk melihat aktivasi minimal yang dapat
diperoleh dengan penambahan ion Ca+. Aktivasi ini
meningkat dengan turunnya konsentrasi ion Ca+.
. Dengan menggunakan kondisi yang sama seperti proses
sakarifikasi sebelumnya, yaitu melalui likuifaksi menggunakan alfa-amilase seIama 2 jam, maka selanjutnya
sebelum dilangsungkan proses sakarifikasi, ditambahkan
ion logam Ca+r ke dalam substrat sehingga konsentrasi
Ca+ di dalamnya adalah 0,8 mM.
Dari hasil yang diperoleh (Gambar 8), temyata bahwa
adanya ion Ca+ meningkatkan kecepatan awal reaksi
sakarifikasi.
60
ion Ca++
ion Ca++
Anallsa hasil sakarifikasi dengan HPLC
Untuk memastikan bahwa dalam proses sakarifikasi
dengan menggunakan enzim glukoamilase hasil fermentasi
yang dihasilkannya adalah glukosa, maka dilakukan analisa
dengan menggunakan HPLC. Analisa dilakukan dengan
membandingkan wakturetensi
glukosa pada standar dan
sekaligus membandingkan luas puncak spektrum, untuk
mengetahui jumlah glukosa secara kuantitatif,
600
100
500
80
400
f
~
~
....I
..,
60~
300
!!!
VI
40 ~
i5
200
i
100
~
~
5
~o
~
20
C1
Z
Z
w
D..
~",I\~
~ ~
z
~
~
~
17 l\
~ ~
~ ~
rJ !\
rJ
fI ~
rJ
rl ~
[\
~
~
'I
0
0.0004
0,0008
KONSENTRASI
Gambar 7. Peningkatan
aktivitas
0
l'i
6
~
12
lS
18
Garnbar 9. Proses sakarifikasi yang dip ant au dengan metoda HPLC.
fI
~~
fI ~~
rJ
r/F ~~
I
9
WAKTU (JAM)
• Hidrolisis (%)
o Jumlah
glukosa yang dibebaskan
I\~
0.0002
ION LOGAM (M)
enzim glukoamilase
dengan
adanya
ion-ion logam u-, Na+, K+, Mg++, Ca++ dan Ba++ pada
konsentrasi 0,2 - 0,8 mM
36
a
fI
Pada analisis dengan HPLC ini, sakarifikasi dilakukan
dengan menambahkan enzim secara bertahap seperti pad a
percobaan sebeIumnya. Dari hasil analisa dengan HPLC ini
dapat kita lihat (Gambar 9) bahwa proses sakarifikasi
dengan menggunakan enzim glukoamilase mampu menghidrolisis 83,3% sagu menjadi glukosa.
JKTI, VOL. 5 - No.1, Juni, 1995
REFERENCES
films by a seeding process. J. Mater. Res. 8(2) 339344 (1993).
Stuijts, New Fabrication Methods for Advanced
Electronic Materials Science of Ceramics, 5, pp. 335
(1970).
1. AL.
2. J.V. Biggers and S. Venkataramani, Preparation and
Reactivity of Lead Zirconate Titanate Solid Solutions
Produced by Precipitation from Aqueous Solutions,
Mat. Res Bull.,13, 717-722, (1978).
3. S.H. Cho and J.V. Biggers, Characterization
and
Sintering of Lead Zirconate Titanate Powders. J. Am.
Ceram. Soc. 66 (10), 743 (1983).
4. K.S. Mazdiyasni, RT. Dolloff and J.S. Smith, Preparation of High Purity Submicron Barium Titanate
Powders. J. Am. Ceram. Soc. 52(10), 523(1969).
5. E. Wu, KC. Chen. and J.D Mackenzei, Ferroelectric
Ceramics The Sol Gel Method Versus Conventional
Processing, Mat. Res. Soc. Symp. Proc. Vo1.32, pp 169
(1984).
W.R Cook and H. Jaffe, Piezoelectric
Ceramics, (Academic Press, London, 1971)
6. B. Jaffe,
7. K Kakegawa, J. Mohri, K Takahashi, H. Yamamura
and S. Shirashaki, A compositional Fluctuation
and
Properties of Pb(Zr,Ti)03, Solid State Commun. 24,
769- 772 (1977).
8. B.V. Hiremath, AI. Kingon and lV. Biggers, Reaction
Sequence in the Formation of Lead Zirconate-Lead
Titanate Solid Solution : Role of Raw Materials. J. Am.
Ceram. Soc., 66,790-793 (1983).
9. Chi Kong Kwok and Seshu B. Desu, Low temperature
perovskite formation of lead zirconate titanate thin
10. O. Yamaguchi, F. Fukuoka and Y. Kawakami,
Formation of alkoxy-derived PbZrO. J. Mater. Sci. Lett., 9,
958-959 (1990).
11. M. Kosec, D. Kolar, Ceramic Powder, edited by P.
Vincenzini, Elsevier, Scientific Publishing Company,
Amsterdam Printed in The Netherlands, pp 421-427
(1983).
Anthony West. Solid State Chemistry and 1st
Applications. (John Wiley & Sons, Chichester, New
12. R
York, Brisbane, Toronto, Singapore, 1984).
13. Shu. Winlock, "Preparation of PbTiOand
PZT
Powders by Hydrolysis of Metal Alkoxides", (Master's
Thesis, Fac. of Sci. and Techn. Keio University, Japan
1995).
14. B. Jaffe, RS. Roth, and S. Marzullo, Properties of
piezoelectric ceramics in the solid-solution series lead
titanate-lead zirconate-lead oxide : tin oxide and lead
titanate-lead hafnate, J Res. Nat Ber. Stand., 55(5) 239254 (1955).
15. Yukata Ohya, Toshimasa Tanaka and Yasutaka Takahashi, Dielectric properties of lead zirconate titanate
thin films fabricated on In 0 : Sn substrate by sol-gel
method., Jpn. J. Appl. Phys., 32, 4163-4167 (1993).
16. H. Hirashima, E. Onishi and M. Nakagawa, Preparation
of PZT Powders From Metal Alkoxides. J. NonCrystalline Solids, 121, 404-406 (1990).
Lipeles, N.A Ives, and M.S. Leung, Science of
Ceramic Chemical Processing, edited by Larry L.
17. RA
Hench and Donald R Ulrich, (John Wiley & Sons, New
York, pp 320-326),1986.
Proceedings berikut ini dapat dipesan pada
Rosidin d/a HKI, Puslitbang Kimia Terapan-LIPI
DAFfAR HARGA PROCEEDINGS DI UNION SHOP HKI
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
NAMA
HARGAJUAL
Proceedings of the ASEAN- EC workshop Oil the scale up, cost evaluation and technology
transfer of biotechnological processes
Proceedings on the first ASEAN workshop Oil biochemical engineering
Proceedings lokakarya pertama evaluasi biologi kimia dan fisika limbah lignosellulosa
Proceedings of the first ASEAN workshop on the technology of animal feed production
utilising foodwaste materials ---=-'
Rp 12.500,Rp 12.500,Rp 7.500,-
_
_
Proceedings of the second ASEAN workshop on the technology of animal feed production
utilising foodwaste materials
Proceedings of the first ASEAN seminar workshop on biogas technology (+ supplementary
information) _
Proceedings of the First ASEAN workshop on solid substrate fermentation
Proceedings of the second ASEAN workshop on food analytical techniques
JKTI, VOL. 5 - No.1, Junl, 1995
Rp 7.500,Rp 12.500,-
_
_
Rp 12.500,Rp 7.500,Rp 3.500,-
17