Templat tesis dan disertasi

5
TINJAUAN PUSTAKA
Udang Vaname (Litopenaeus vannamei)
Litopenaeus vannamei, biasa disebut sebagai udang putih atau udang
vaname, masuk kedalam famili Penaeidae. Klasifikasi udang vaname menurut
Boone (1931) dalam Effendi (1997) adalah sebagai berikut :
Kingdom
: Animalia
Subkingdom
: Metazoa
Filum
: Arthropoda
Subfilum
: Crustacea
Kelas
: Malacostraca
Subkelas
: Eumalacostraca
Super ordo
: Eucarida
Famili
: Penaeidae
Genus
: Litopenaeus
Spesies
: Litopenaeus vannamei
Gambar 1 Morfologi udang vaname (Litopenaeus vannamei) (Wayban and Sweney,
1991)
Morfologi udang vaname terbagi menjadi dua yaitu kepala yang menyatu
dengan dada (cephalothorax) dan badan. Cephalotorax terdiri dari rostrum,
sepasang mata majemuk (mata facet), karapas, mulut yang terletak dibawah
kepala dengan rahang (mandibula), sepasang alat bantu rahang (maxilliped)
sepasang antena dan antenulla, lima pasang kaki jalan (periopoda) yang sudah
mengalami modifikasi dan berfungsi sebagai organ organ untuk makan dimana
kaki jalan pertama, kedua dan ketiga bercapit yang disebut chela (Wayban dan
Sweney, 1991; Haliman dan Adijaya, 2005). Bagian badan dan abdomen terdiri
dari enam ruas, dan tiap-tiap ruas ruas mempunyai sepasang kaki renang
6
(pleopod). Pada ujung ruas keenam terdapat ekor kipas 4 lembar dan satu telson
berbentuk runcing (Wayban dan Sweeney, 1991) (Gambar 1).
Tubuh udang vaname memiliki carapace transparan (bening) dengan butirbutir pigmen biru pada sitoplasma yang mendominasi tubuh udang sehingga
terkadang udang terlihat berwarna kebiru-biruan (kromatofor) Pada udang betina,
gonad pada awal perkembangannya berwarna keputih-putihan dan berubah
menjadi coklat keemasan atau kehijauan. Udang vaname dewasa bertelur di laut
terbuka, dan pada satdia postlarva akan bermigrasi ke pantai hingga stadia juvenil
(Briggs et al., 2004). Organ dalam udang vaname lainnya yang dapat diamati
adalah usus yang mengarah ke anus terletak di ujung ruas keenam. (Haliman dan
Adijaya, 2005). Udang vaname digolongkan pada hewan pemakan segala
(omnivora) namun cenderung ke dalam kelompok karnivora karena pemakan
crustacea kecil dan polychaeta (Hendrajat, 2003). Secara alami udang vaname
bersifat nocturnal aktif mencari makan pada saat intesitas cahaya berkurang, dan
bersifat kanibalisme pada saat terdapat udang vaname lain yang lemah terutama
saat moulting dan sakit (Fegan 2003).
Sistim pertahanan tubuh pada kelompok krustasea (avertebrata).adalah
sistem imun non spesifik. Imunitas avertebrata tidak berdasarkan imunoglobulin
dan interaksi subpopulasi limfosit, karena tidak memproduksi antibodi spesifik
atau antibodi pada krustasea sangat sedikit (Ratcliffe, 1985). Imunitas avertebrata
dipengaruhi oleh interaksi sel fagositosis dengan patogen, bersamaan dengan
sejumlah faktor humoral seperti lisosim (Ratcliffe, 1985). Pertahanan krustasea
sebagian besar berdasarkan pada aktifitas sel darah atau hemosit. Sel ini bisa
menghilangkan partikel asing pada tubuh krustasea akuatik melalui aktifitas
fagositosis atau enkapsulasi (Söderhäl dan Cerenius, 1992). Hemosit penting
untuk menghilangkan partikel asing yang masuk ke tubuh udang. Terdapat tiga
tipe hemosit pada hemolim udang yaitu sel hialin, semi granular dan granular, dan
ketiganya memiliki morfologi dan fungsi sel masing-masing (Söderhäl dan
Cerenius, 1992).
Udang vaname (L.vannamei) merupakan spesies introduksi yang
dibudidayakan di Indonesia. Udang ini berasal dari perairan Amerika Tengah.
Negara-negara Amerika tengah dan selatan seperti Ekuador, Venezuela, Panama,
Brasil dan Meksiko. Udang ini lebih dikenal sebagai pacific white shrimp, dan di
Indonesia mulai diintroduksi untuk dibudidayakanpada tahun 2001(Mansyur dan
Rangka, 2008). Udang vaname ini memiliki beberapa keunggulan dibandingkan
spesies lainnya. Produktivitas udang ini mencapai lebih dari 13.600 Kg/Ha,
karena keunggulan karakteristik pertumbuhannya seperti pertambahan berat udang
yang dapat bertambah lebih dari 3 gram tiap minggu dalam kultur dengan densitas
2
tinggi (100 udang/ m ). Berat udang dewasa dapat mencapai 20 gram dan diatas
berat tersebut, dan pertumbuhannya akan melambat menjadi sekitar 1 gram/
minggu. Udang betina tumbuh lebih cepat daripada udang jantan (Wyban et al.,
1991). Keunggulan lainnya adalah tingkat kelulusan hidup (survival rate) tinggi,
ketersediaan benur yang berkualitas, kepadatan tebar tinggi, tahan penyakit dan
konversi pakan rendah (Boyd dan Clay, 2002). Udang vaname memiliki toleransi
salinitas yang tinggi dari 2-40 ppt. Temperatur berpengaruh terhadap
pertumbuhan udang vaname, udang akan mati pada suhu dibawah 150C atau
diatas 330C selama 24 jam atau lebih. Stress subletal dapat terjadi pada suhu 15220C dan 30-330C. Tingkat kelulusan hidup udang vaname ini mencapai 91%
7
(Boyd dan Clay, 2002). Tingginya tingkat kelulusan hidup karena benih udang
vaname dapat diperoleh dari induk yang telah didomestikasi sehingga benur yang
dihasilkan tingkat kanibalismenya rendah. Benur udang vaname sudah ada yang
bersifat SPF (Spesific Pathogen Free) yaitu benur yang bebas dari beberapa jenis
penyakit (patogen) contohnya adalah udang vaname yang tahan terhadap infeksi
White spot syndrome virus (WSSV), meskipun ditemukan beberapa kasus udang
yang terinfeksi (Soto et al., 2001). Perilaku abnormal udang sering menjadi
penanda awal terjadinya stress atau timbulnya masalah penyakit. Petani atau
pembudidaya udang akan segera mengambil tindakan jika terjadi perubahan pada
pola makan udang, gerakan berenang atau agregasi yang tidak biasa, bahkan
aktivitas predator disekitar kolam pemeliharaan dapat menjadi penanda terjadinya
infeksi penyakit pada udang tersebut (FAO, 2001).
Infectious Myonecrosis
Sejarah Infeksi Myonecrosis
Infeksi myonecrosis (IMNV) adalah penyakit viral yang berkembang
lambat tetapi bersifat kumulatif. Mortalitas yang ditimbulkan mencapai 70% pada
budidaya udang vaname (Litopenaeus vannamei) di Brazil dan Indonesia
(Puthawibool et al., 2009 ). Infeksi myonecrosis mucul pada budidaya udang
vaname di laut dan perairan payau. Wabah penyakit ini dikaitkan dengan beberapa
kondisi stress fisik dan lingkungan (salinitas dan temperatur yang ekstrim,
penangkapan dengan jaring, rendahnya kualitas pakan), dan disebabkan oleh
adanya penularan dari udang yang telah terinfeksi myonecrosis (OIE, 2012).
Wabah infeksi myonecrosis pada udang vaname terjadi di Brazil sejak
tahun 2002 dengan gejala klinis berupa nekrosis jaringan otot, perubahan warna
putih pada jaringan otot menyerupai warna udang rebus/udang yang dimasak
(Puthawibool et al.,2009; OIE,2010). Udang vaname pada kondisi ini akan
mengalami kematian 40-70% (OIE, 2010). Produktivitas udang vaname di
kawasan Amerika Selatan menurun dari 6.084 kg/ha pada 2003 menjadi 4.573
kg/ha di 2004. Kerugian yang ditimbulkan wabah myonecrosis di Brazil dari awal
wabah hingga tahun 2003 mencapai US $20 juta (Nunes et al., 2004). Disamping
menjadi penyebab kematian udang, infeksi myonecrosis menyebabkan
meningkatnya nilai konversi pakan (FCR) akbibat kematian udang (Andrade et
al., 2008).
Udang dengan gejala infeksi yang mirip dengan infeksi udang di
Brazil terjadi di beberapa negara dimana udang vaname tersebut dibudidayakan
(Lightner dan Patoja, 2004). Di Indonesia wabah IMNV pada budidaya udang
vaname muncul pertama kali tahun 2006 di Situbondo Jawa Timur (Senapin et
al., 2007). Udang vaname merupakan spesies udang introduksi dari Florida
Amerika Serikatyang dibudidayakan secara besar-besaran sejak tahun 2003,
hingga tahun 2006 terjadi kematian udang skala besar (outbreak) dengan gejala
klinis berupa warna putih pada jaringan otot udang yang mirip dengan wabah di
Brazil. (Senapin et al., 2007). Kerugian yang ditimbulkan wabah myonecrosis
pada budidaya udang vaname di Indonesia sejak tahun 2006-2010 mencapai US $
500 juta. Infeksi myonecrosis menurunkan produksi udang vaname hingga 30%
dari target 500 ribu ton pada tahun 2009, hanya terealisasi 350 ribu ton lebih
rendah dari tahun sebelumnya yang mencapai 410 ribu ton (DKP, 2009).
8
Setelah terjadinya wabah di Indonesia,
infeksi IMNV dilaporkan
menyebar ke wilayah Asia di pulau Hainan (Republic of China) dan Thailand
bagian selatan (OIE, 2010). Berdasar pengujian terhadap sampel udang
vanamedari beberapa negara di Asia seperti Indonesia, Thailand, Malaysia,
Taiwan, Vietnam, India dan China hingga pertengahan tahun 2011, hanya sampel
udang yang berasal dari Indonesia yang positif terinfeksi IMNV (Senapin et al.,
2011). Gejala klinis berupa warna putih pada jaringan otot yang dijumpai pada
sampel udang dari ketujuh negara kecuali dari Indonesia kemungkinan besar
bukan karena infeksi IMNV melainkan adanya syndrome kejang otot (muscle
cramp syndrome) akibat lingkungan atau salah penanganan udang sehingga terjadi
stress pada udang (Senapin et al., 2011).
Etiologi
Struktur Virus
IMNV merupakan virus tidak beramplop, berbentuk icosahedral
berdiameter 40 nm dan termasuk kedalam famili Totiviridae (Nibert et al., 2007;
Poulos et al., 2006; Tang et al., 2008). Virus IMN pada fraksi sukrosa dilihat
bentuknya menggunakan transmisi mikroskop elektron (Gambar 2). Partikel virus
berbentuk icosahedral, tidak beramplop, memiliki panjang genom 7560 bp
(Paulos et al., 2006).
Gambar 2 Virus IMN dilihat dengan Transmisi Mikroskop Elektron (TEM),
pada berbagai fraksi gradien (skala garis 100 nm ) (Poulos et al.,
2006). (A) Virus dalam fraksi gradien sukrosa; (B) Virus
dimurnikan dalam fraksi gradien Cesium klorida, dan diwarnai
asam fosfotungstat 2%
Virion IMNV terdiri dari satu protein mayor capsid (MCP).Virus IMNV
memiliki isometrik capsid yang terdiri dari 901-aa mayor protein kapsid (MCP).
Berdasar pengamatan menggunakan mikroskop elektron, virion IMNV tersusun
dari 120-subunit T=1 kapsid, diameter 450 Å, tetapi dengan serat kompleks (fiber
complex) yang menonjol sepanjang 80Å pada kelima lipatan sumbunya (Gambar
3). Bagian permukaan virus diisi tonjolan-tonjolan mengelilingi kapsid seperti
serat kompleks (Gambar 3A). Serat terdiri dari setidaknya tiga morfologi domain
yaitu tombol luar, tangkai tengah, dan bagian bawah berupa kaki jangkar kapsid
(Gambar 3B). Panjang total setiap tonjolan termasuk kakinya adalah 100 Å (Tang
et al., 2008). Tonjolan ini tidak dimiliki oleh jenis totivirus lainnya dan
kemungkinan berperan dalam transmisi ekstraseluler dan patogenesis IMNV
9
Gambar 3
Virion IMNV dengan tonjolan menyerupai serat kompleks pada
sumbu 5f (Tang et al., 2008)
(Tang et al., 2008; Ghabrial, 2008).Oleh karenanya dapat disimpulkan bahwa
tonjolan pada virus IMNV berkontribusi terhadap virulensi dan pola spesifik
patogenesis (Tang et al., 2008).
Susunan Genom
Genom Virus IMN adalah RNA untai ganda (double stranded) yang terdiri
dari 7560 nukleotida (Senapin et al., 2007; OIE, 2010).Genom virus ini terdiri
dari 2 extended open reading frame (ORF) yang berbeda, ORF1 di frame 1 (1364953) dan ORF 2 di frame 3 (nt 5241-7451) (Nibert, 2007; Tang et al., 2008).
ORF1 (1605 aa) mengkode protein 179 kDa termasuk sekuen N terminal pada
MCP. Pada ORF 2 menyandi protein 85 kDa yang terdiri dari serangkaian
karakteristik dari RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (Nibert, 2007).
Pengkodean protein kapsid totivirus biasanya dimulai dari awal ORF1 (Gambar
4). Sedangkan virus IMNV berbeda dengan totivirus pada umumnya, karena
wilayah pengkode protein kapsid dimulai dari pertengahan ORF1 (Poulos et al.,
2006). Hal ini menunjukkan kemungkinan bahwa setengah ORF1 IMNV dapat
menyandikan RNA binding protein (Poulos et al.,2006). Kemungkinan MCP
IMNV telah berkembang dan berbagi peran dalam proses masuknya kedalam sel
dengan serat kompleks. Jika anggota lain dari family Totiviridae dikaitkan dengan
laten, infeksi avirulen pada inang, namun sebaliknya IMNV dikaitkan dengan
infeksi yang mematikan pada udang penaeid (Lightner et al., 2004; Poulos et al.,
2006).
Gambar 4 Sketsa Genom IMNV (Nibert , 2007; Tang et al., 2008)
Hasil sequencing genome IMNV Indonesia secara penuh 7,5 kb (Gen.Bank
accs.no. EF061744) menunjukkan 99,6% identik dengan IMNV dari Brazil
(GenBank.AY570982.1) (Senapin et al., 2007). Analisis filogeni (Gambar 5)
berdasarkan RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) menunjukkan IMNV
memiliki kemiripan dengan Giardia lamblia virus (GLV) yang merupakan bagian
dari famili Totiviridae (Poulos et al., 2006). Sebagian besar anggota famili
10
Totiviridae memiliki kekurangan dalam mentransmisikan virion melalui media
ekstraseluler dalam siklus hidupnya (Lightner et al., 2004a; Tang et al, 2008).
Pada umumnya penyebarannya secara vertikal didalam sel atau horizontal dengan
hypa 1 mastomiasis kecuali GLV dan IMNV, dan IMNV merupakan satu-satunya
virus dari famili Totiviridae yang diketahui menyebabkan penyakit pada inangnya
(Tang et al., 2008).
Gambar 5 Filogeni IMNV . Kedekatan IMNV dengan GLV virus sekitar
80% (Poulos et al., 2006)
Gejala Klinis Infeksi IMNV pada Udang Vaname
Gejala klinis penyakit IMNV pada udang vaname adalah nekrosis ekstensif
berwarna putih pada jaringan otot, khususnya pada bagian punggung dan ekor
(Gambar 6), timbulnya warna putih pada jaringan otot menyerupai warna udang
rebus/udang yang dimasak (Puthawibool et al.,2009; OIE,2010). IMNV dapat
menginfeksi hampir sebagian besar jenis udang penaeid, khususnya udang
vaname (L.vannamei) yang menyebabkan mortalitas udang yang tinggi sehingga
menimbulkan kerugian yang sangat besar (Lightner et al., 2004b). IMNV dapat
menimbulkan kematian hingga 60% pada stadia yuwana (juvenile) 2-3 gram dan
udang dewasa hingga ukuran 12 gram. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
IMNV dapat menginfeksi udang Penaeus stylirostris dan Penaeus monodon
namun tidak menyebabkan kematian pada udang (Tang et al., 2005).
Udang vaname stadia yuwana dan udang muda (subadult) merupakan stadia
paling banyak terinfeksi myonecrosis virus pada saat salinitas air laut atau air
payau ditambak rendah (Lightner, 2011; Lightner et al, 2004; Nunes et al,2004;
Poulos et al, 2006). Jaringan otot lurik (otot rangka dan terkadang otot jantung),
jaringan ikat, hemosit dan sel-sel parenkim limfoid organ adalah organ dan
jaringan udang yang menjadi target infeksi myonecrosis (Lightner, 2011; Lightner
et al, 20.04; Poulos et al., 2006; Tang et al., 2005). Pola infeksi IMNV dimulai
dari stadia awal yuwana atau udang dewasa di area dimana IMNV menjadi
enzootik. Wabah kematian udang dalam jumlah besar akibat infeksi IMN
berhubungan dengan keadaan yang beresiko menyebabkan stress seperti
11
penangkapan dengan castnetting, pemberian pakan, perubahan salinitas secara
mendadak dan faktor pemicu stress lainnya (OIE, 2012).
Berbagai tingkat nekrosis jaringan otot perut udang oleh infeksi IMNV
(Gambar 6), terlihat sebagai perubahan warna perut, buram keputihan (Gambar
6a). Nekrosis jaringan otot di sepanjang perut abdomen khususnya pada ruas
abdomen keenam (panah) terlihat putih dibandingkan dengan udang normal
(Gambar 6b) dimana transparasi jaringan terlihat jelas (Poulos et al., 2006).
Infeksi IMNV yang menonjol lainnya adalah nekrosis ekstensif diwilayah otot
lurik yang ditandai hilangnya transparansi (buram) adalah terjadinya nekrosis
pada ruas perut (distal abdomen) dan ekor kipas udang (Poulos et al., 2006;
Lightner et al., 2004). Sifat infeksi IMNV adalah kronis progresif dan persisten,
secara perlahan-lahan penyakit ini menyebabkan kematian kumulatif 40% hingga
70% (Poulos et al., 2006; OIE, 2012).
Gambar 6 Gejala klinis infeksi IMNV (Poulos et al., 2006). a= Nekrosis otot
perut ditandai warna putih buram; b= Nekrosis pada ruas abdomen
ke-6 (atas) dibandingkan dengan udang normal (bawah)
Infeksi buatan IMNV terhadap udang vaname ukuran rata-rata 1gr/ ekor
selama 52 hari paska infeksi (post infection/ p.i) menunjukkan kematian hingga
100% (Andrade et al., 2007). Kematian awal dijumpai pada hari ke 8 p.i, dan
jumlah kematian udang yang diinfeksi meningkat hingga hari ke 40 p.i. Rata-rata
waktu kematian 50% (lethal time50/ LT50) pada uji coba infeksi buatan tersebut
adalah 43 p.i (Andrade et al., 2007). Senapin et al (2005) menginfeksi 3 jenis
udang L.vannamei, L.stylirostris, dan P.monodon dengan inokulum yang berisi
virion murni IMNV melalui injeksi. Gejala klinis berupa lesi putih pada jaringan
otot di bagian ekor terlihat pada udang L.vannamei dan L.stylirostris.
Perkembangan gejala klinis sangat lambat, muncul gejala setelah 7 hari p.i dan
lesi dijumpai setelah 13 hari p.i. Selama 4 minggu paska infeksi IMNV
berlangsung, udang P.monodon tidak menunjukkan gejala klinis dikarenakan
tingginya pigmen pada exoskeleton yang menutupi lesi (Senapin et al., 2005).
Bodi inklusi basophilic tunggal maupun berganda tampak pada sitoplasma
dan nukleus jaringan otot (Tang et al., 2008). Pada organ limfoid ditemukan
akulumasi lymphoid organ speroid (LOS) yang merupakan hipertropi dari sel
limfoid (Andrade et al., 2008). Udang yang telah pulih dari dari infeksi akut
myonecrosis menjadi infeksi kronis, mengakibatkan terjadinya perubahan
nekrosis jaringannya dari nekrosis koagulatif menjadi nekrosis liquefaktif.
Perkembangan myonecrosis disertai dengan infiltrasi hemositik dan pembentukan
jaringan ikan (fibrosis). Tampilan khas infeksi myonecrosis adalah pembentukan
12
sel organ limfoid berbentuk speroid dan organ limfoid berbentuk speroid ektopik
yang ditemukan di hemoceal dan jaringan lunak terutama di lumen jantung dan
sekitar tubula kelenjar antenna (Lightner et al., 2004).
Epidemiologi dan Transmisi Virus Myonecrosis
Wabah penyakit IMNV pada budidaya udang vaname dilaporkan pertama
kali tahun 2002 di wilayah bagian Piauí (Timur laut Brazil) (Lightner et al.,
2004a,b; Poulos et al., 2006; Pinheiro et al., 2007). Selama musim penghujan
bulan Januari hingga Maret, penyakit IMNV menyebar ke wilayah-wilayah yang
bersebelahan, hingga tahun 2004 seluruh budidaya udang di wilayah timur laut
Brazil terinfeksi myonecrosis termasuk wilayah Pernambuco (Pinheiro et al.,
2007). Kematian akibat infeksi IMNV ini rata-rata 35-55% pada udang ukuran 12
gr, dan menyebabkan kerugian hingga US$ 20 juta ditahun 2003 (Nunes et al.,
2004 dalam Pinheiro el al., 2007). Infeksi myonecrosis pertama kali di Indonesia
terjadi pada tahun 2006 di Situbondo, Jawa Timur (Senapin et al., 2007; OIE,
2012). Selanjutnya wabah myonecrosis menyebar ke Jawa Barat, Sumatera,
Bangka, Kalimantan Barat, Sulawesi Selatan, Bali, Lombok, dan Sumbawa
(Sutanto, 2011; OIE, 2012). Negara-negara Asia tenggara lainnya belum
melaporkan kejadian infeksi myonecrosis (Senapin et al., 2011; OIE, 2012).
Prevalensi infeksi IMN pada wilayah enzootik IMNV di area budidaya
udang vaname (L.vannamei) mencapai 100% (Andrade et al., 2007; Nunes et al.,
2004). Suhu dan salinitas berperan sebagai faktor predisposisi terjadinya wabah
penyakit IMNV (Nunes et al., 2004). Penyebaran virus myonecrosis kemungkinan
terjadi karena transmisi virus melalui air (horisontal) dan transmisi virus secara
vertikal dari induk ke keturunannya (OIE, 2012). Berdasar struktur partikelnya,
virus myonecrosis tidak beramplop seperti virus TSV, sehingga memungkinkan
virus tersebut akan berada di usus dan tinja burung laut yang memakan udang
mati atau udang sekarat di area tambak yang epizootik IMN. Selanjutnya virus
akan menyebar di area tambak tersebut melalui tinja atau bangkai udang
muntahan (Vanpatten et al.,2004). Penularan virus myonecrosis secara horisontal
lainnya melalui kanibalisme, dimana udang vaname yang terinfeksi dan lemah
akan menepi dan dimangsa oleh udang lain (kanibalisme) yang menyebabkan
terjadinya transmisi virus antar udang (Lightner, 2011; Poulos et al, 2006).
Populasi udang vaname yang bertahan hidup setelah infeksi IMNV atau udang
vaname yang berasal dari daerah epizootik IMNV kemungkinan akan membawa
virus hidup (OIE, 2012), dan berpotensi menularkan virus IMN secara transmisi
vertikal melalui induk (keturunan). Mekanisme penularan infeksi IMNV secara
vertikal masih bersifat dugaan berdasar kondisi di lapangan, sehingga belum dapat
diketahui apakah transmisi virus melalui mekanisme transovarial atau oleh
kontaminasi permukaan telur yang baru dikeluarkan oleh induknya (OIE, 2012).
Diagnosis IMNV dengan Teknik Molekuler
b
Beberapa metoda pengujian untuk diagnosis infeksi IMNV yang
direkomendasikan OIE (2012) diantaranya adalah pemeriksaan secara langsung
13
melalui pengamatan gejala klinis yang menyertai infeksi virus myonecrosis,
pemeriksaan mikroskopis dengan melihat perubahan jaringan (histopatologi),
pengamatan preparat basah (wet mounts) dan metoda pengujian berdasar deteksi
molekuler (Lightner, 2011; Lightner et al., 2004; Poulos et al., 2006). Deteksi
IMNV berdasar reaksi antigen antibodi telah dikembangkan oleh Kunanopparat et
al., (2011) menggunakan 3 antibodi monoklonal (mAbs) yang berasal dari protein
capsid IMNV, namun pengujian dengan kombinasi ketiga mAbs tersebut
sensitifitasnya lebih rendah sepuluh kali lipat dibandingkan pengujian IMNV
dengan nested RT-PCR (OIE, 2012).
Metoda pengujian IMNV berdasar deteksi molekuler yang telah
dipublikasikan adalah dengan in-situ hibridisasi (ISH), nested RT-PCR dan
kuantitatif real time (r)RT-PCR(Andrade et al., 2007; Poulos et al., 2006;Tang et
al., 2005). Teknik molekuker lain untuk pengujian IMNV adalah dengan reverse
transcription loop mediated isothermal amplification (RT-LAMP) yang
dikembangkan oleh Puthawibol et al., (2009). Dari keseluruhan metoda deteksi
IMNV tersebut yang menjadi gold standar adalah nested RT-PCR dan real time
RT-PCR IMNV (OIE, 2012), dikarenakan sensitifitas dibandingkan teknik
molekuler lainnya. Beberapa teknik molekuler yang digunakan untuk pengujian
IMNV adalah sebagai berikut :
In Situ Hibridisasi
Hibridisasi adalah proses perpasangan basa antara polinukleotida utas
tunggal yang komplententer, digunakan untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam
campuran asam nukleat yang kompleks. Deteksi ini memiliki spesifisitas yang
tinggi karena ketepatan deteksi didasarkan atas kesamaan runutan nukleotikda
antara pelacak dan genom virus yang diketahui (Akin, 2001). Satu molekul adalah
probe dari sekuen tertentu. DNA probe adalah protein pelacak target gen dan
digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuen komplementer dalam
campuran DNA. DNA probe yang telah dilabel akan berkomplementasi dengan
target melalui hibridisasi sehingga dapat mendeteksi keberadaan gen tertentu
(Furuya et al., 2006)
Deteksi IMNV dengan in-situ hibridisasi menggunakan konstruksi cDNA
dari RNA hasil ekstraksi IMNV murni. Dari satu klon IMNV-317, cDNA dilabel
dengan digoxigenin-11-dUTP sebagai gen probe untuk deteksi ISH (OIE, 2012).
Probe tersebut sangat spesifik terhadap IMNV berdasar hasil uji spesifisitas 100%
(Tang et al., 2005; OIE, 2012). ISH mampu mendeteksi IMNV pada sampel
jaringan otot, organ limfoid, hindgut, dan sel fagositik dalam hepatopankreas dan
jantung. Pengujian In situ hibridisasi (IHS) jaringan otot dengan digoksigeninberlabel IMNV probe (Gambar 7), terdapat adanya endapan hitam di wilayah di
mana probe berhibridisasi dengan target IMNV(pewarna Bismarck brown
counterstain, skala 50 µm) (Poulos et al., 2006). Udang dengan fase penyakit akut
menunjukkan nekrosis koagulatif diotot, kadang dengan edema (Poulos et al.,
2006). Nekrosis koagulatif jaringan otot disertai dengan infiltrasi hemosit dan
fibrosis terlihat perbedaan yang nyata dengan jaringan otot normal. Dari ketiga
spesies yang diuji, sel otot rangka menghasilkan reaksi ISH terkuat dan udang
vaname (L.vannamei) merupakan spesies yang paling rentan terhadap infeki
IMNV (Tang et al., 2005)
14
Gambar 7 Infeksi Myonecrosis pada jaringan otot udang vaname (L.vannamei)
(Poulos et al., 2006). (A) Nekrosis koagulatif otot disertai infiltrasi
hemosit; (B) perinuklear basofilik pucat hingga badan inklusi
basofilik gelap pada sel otot (panah); (C) Endapan hitam di wilayah
di mana probe berhibridisasi dengan target IMNV (pewarna
Bismarck brown counterstain pada uji ISH IMNV)
Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)
Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) adalah suatu metode uji
yang memungkinkan memperbanyak DNA dengan spesifisitas tinggi, sensitif dan
cepat hanya dengan satu suhu amplifikasi (isothermal) (Notomi et al., 2009).
Reverse Transcription LAMP merupakan pengembangan metoda dari teknik
LAMP, hanya pada metoda RT-LAMP diberi penambahan enzim reverse
transcriptase (RT) untuk mensintesis cDNA dari salinan RNA (Soliman et
al., 2006). Amplifikasi LAMP bersifat autosiklus dibantu oleh enzim Bst DNA
polimerase yang bekerja dengan prinsip strand displacement activity. LAMP
sangat spesifik karena kemampuanya mengenali target sekuens (Soliman et al.,
2006; Puthawibool et al., 2009). Menggunakan 4 jenis primer khusus yang
didesain untuk mengenali enam wilayah target urutan DNA.Pada tahap awal
reaksi LAMP akan mengenali 6 target sekuen dan 4 target sekuen di tahap akhir
hingga menghasilkan produk akhir DNA berbentuk untai simpul menyerupai
struktur kembang kol (cauliflower-like)(Soliman et al., 2006; Puthawibool et al.,
2009). Keseluruhan reaksi berlangsung dalam kondisi isotermal, sehingga tidak
memerlukan peralatan thermal cycler, cukup dengan penangas air (Puthawibool et
al., 2009).
Diagnosa IMNV dengan RT-LAMP telah dikembangkan oleh Puthawibool
et al., (2009) yang menggabungkannya dengan metoda lateral flow dipstick (LFD)
sebagai alternatif pembacaan hasil. Sensitifitas RT-LAMP dan nested RT-PCR
sebanding pada pengenceran 10-4, dengan spesifisitas RT-LAMP IMNV 100%
(Puthawibool et al., 2009). Hasil pembacaan RT LAMP IMNV dengan gel
agarose, LFD maupun pewarnaan dengan SYBR Green menunjukkan hasil yang
tidak berbeda (Puthawibool et al., 2009)
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan real time PCR
Diagnosa patogen berbasis molekuler dimulai dari dikembangkannya
metoda Polymerase Chain Reaction (PCR) oleh Kary Mullis dipertengahan 1980an. Pada aplikasi yang paling dasar, PCR dapat memperbanyak sejumlah kecil
DNA salinan (atau RNA) dalam waktu beberapa jam. PCR merupakan metoda
pengujian berbasis biomolekuler berupa reaksi enzimatis untuk melipatgandakan
secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara invitro (Sambrook
15
dan Russel, 2001). Metoda PCR tersebut sangat sensitif sehingga dapat digunakan
untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Dengan menggunakan metoda PCR
dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA (110 bp, 5x 10 -19 mol)
sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit
(Yuwono, 2006).
Persyaratan dalam penggunaan metoda PCR salah satunya adalah harus
mengetahui bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan terlebih
dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut. Sekuen yang diketahui tersebut
penting untuk menyediakan primer, yaitu sekuen oligonukleotida pendek yang
berfungsi mengawali sintesis rantai DNA.Untuk menjalankan suatu reaksi PCR
dibutuhkan empat komponen utama yaitu : DNA cetakan (fragmen DNA yang
akan dilipatgandakan), oligonukleotida primer yaitu suatu sekuen oligonukleotida
pendek (15-25 basa nukleotida)yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai
DNA, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri atas dATP, dCTP,
dGTP, dTTP dan yang terakhir adalah enzim DNA polimerase yaitu enzim yang
melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA (Yuwono, 2006). Deteksi produk
akhir PCR dengan gel elektroforesis sehingga lebih dikenal sebagai PCR end
point atau hasil pengujian baru terlihat setelah selesai keseluruhan tahapan
tersebut(Sambrook dan Russell, 2001).
Nested RT-PCR direkomendasikan oleh OIE (2012) sebagai metoda uji
untuk deteksi dengan menggunakan 2 pasang primer yang menghasilkan produk
produk PCR 328 bp dan 139 bp (da Silva et al., 2011; OIE, 2012). Produk
amplifikasi nested RT-PCR IMNV dianalisa dengan gel agar (Gambar 8).
Meskipun memiliki sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi sebagai metoda
diagnosa IMNV, tetapi hasil analisa metoda PCR ini hanya bersifat kualitatif saja
dan tidak dapat mendeteksi salinan virus secara kuantitatif (da Silva et al., 2011).
Gambar 8 Pita 328 bp pada first step RT-PCR IMNV dengan
primer 4587F-4914R (da Silva et al., 2011)
Pengembangan metoda PCR yang dapat mengkuantifikasi salinan produk
amplifikasi dikenal dengan real-time PCR atau qPCR.(Dorak, 2006). Dengan
metoda qPCR ini peningkatan jumlah DNA dapat dilihat secara langsung (real
time). Real time PCR adalah PCR kuantitatif dengan mendeteksi fluorescence
reporter yang dihasilkan selama reaksi PCR. Peningkatan signal fluoresensi
merupakan indikator amplifikasi produk PCR disetiap siklus PCR (real time)
(Dorak, 2006).
16
Bahan yang digunakan pada qPCR sama dengan bahan yang digunakan
pada pengujian dengan PCR konvensional, hanya ditambahkan pewarna
fluoresensi yang biasa disebut probe atau reporter. Prinsip kerja qPCR adalah
mendeteksi dan mengkuantifikasi reporter fluoresensi. Sinyal fluoresensi akan
meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam reaksi. Dengan
mencatat jumlah emisi fluoresensi pada setiap siklus, reaksi selama fase
eksponensial dapat dipantau (Dorak, 2006) (Gambar 9). Peningkatan produk PCR
yang signifikan pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen
target. Makin tinggi tingkat ekspresi gen target maka deteksi emisi fluoresensi
makin cepat terjadi (Dorak, 2006).
Gambar 9 Prinsip kerja real time PCR (qPCR)
Metoda qRT-PCR merupakan salah satu metoda gold standar yang
ditetapkan OIE (2012) sebagai metoda deteksi IMNV dengan teknik molekuler.
Metoda real-time RT-PCR dikembangkan untuk mendeteksi dan
mengukuantifikasi jumlah salinan virus IMN dalam jaringan udang. Metode ini
dapat mendeteksi sedikitnya 10 salinan RNA IMNV pada setiap mikroliter (µl)
total RNA (Andrade et al., 2007; OIE, 2012). Primer yang digunakan untuk
pengujian dengan qRT-PCR didesain dari wilayah ORF1 dari genom IMNV
GenBank aksesi no AY570982 pada urutan nukleotida 412-545 (Andrade et al,
2007;. Poulos et al, 2006). Desain TaqMan probe menggunakan label pewarna
fluorescent 5-carboxyfluoroscein (FAM) pada 5' hingga akhir, dan N,N,N',N'tetrametil-6-carboxyrhodamine (Tamra) pada 3'-ujung pada urutan nukleotida
467-500 (Andrade et al., 2007). Pengujian dengan real time RT-PCR memerlukan
standar salinan sintesis RNA sebagai kontrol untuk pembuatan kurva standar
dalam mengkuantifikasi salinan RNA sampel yang diuji dengan qRT-PCR (OIE,
2012). Pembuatan kontrol positif berupa plasmid DNA rekombinan IMNV harus
disediakan sebelum pembuatan sintesis RNA IMNV. Desain primer yang
digunakan dalam pembuatan plasmid DNA rekombinan didesain dari wilayah
yang sama dengan desain primer qRT-PCR IMNV yaitu wilayah ORF1 pada
urutan nukleotida 218-682 genom IMNV GenBank accession no. AY570982
(Andrade et al., 2007; OIE, 2012).
17
Teknik DNA rekombinan dan Kloning
Secara alami, proses rekombinasi dapat terjadi sehingga memungkinkan
suatu gen dapat berpindah dari satu organisme ke organisme lain. Persitiwa
tersebutbiasanya terjadi diantara organisme yang memiliki kekerabatan yang
dekat.Dengan kemajuan teknologi molekuler, perpindahan gen dapat terjadi
meskipunantara organisme yang tidak memiliki hubungan kekerabatan. Teknik
penggabungan molekul DNA dikenal sebagai teknik DNA rekombinan. Teknologi
DNA rekombinan atau rekayasa genetika merupakan suatu upaya perbanyakan
gen tertentu didalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula
dikatakan sebagai kloning gen. Teknologi ini adalah pembentukan kombinasi
materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA kedalam suatu
vektor sehingga memungkinkan untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di
dalam suatu sel organisme yang lain yang berperan dalam sel inang (Yuwono,
2006).
Tahapan pembuatan DNA rekombinan dimulai dari ligasi, transformasi
kedalam sel inang, dan seleksi koloni hasil transformasi. Pembuatan rekombinan
DNA memerlukan dua macam enzim yaitu enzim restriksi yang berfungsi
memotong molekul DNA dan enzim ligase yang berfungsi menggabungkan
molekul DNA (Glick dan Pasternak, 2003). Tahapan dalam pembuatan DNA
rekombinan dimulai dari klon DNA target atau DNA asing yang secara enzimatis
dipotong dan digabungkan (ligasi) kedalam DNA lain (kloning vektor : plasmid)
sehingga menghasilkan molekul DNA rekombinan (DNA Construct).
Teknik pembuatan DNA rekombinan lainnya adalah dengan kloning TA.
Kloning TA merupakan subkloning yang tidak menggunakan enzim restriksi,
lebih mudah dan lebih cepat daripada sub kloning tradisional sebelumnya. Teknik
ini bergantung pada kemampuan adenin (A) dan timin (T) yang merupakan
pasangan
basa komplementer pada fragmen DNA yang berbeda untuk
berhibridisasi, dan dengan adanya enzim ligase maka keduanya akan terligasi.
Produk PCR biasanya diamplifikasi menggunakan enzim Taq polimerase. Taq
polimerase memiliki 3’ ke 5’ kegiatan proofreading, dan dengan probabilitas
tinggi akan menambahkan satu overhang 3’ adenin (A) pada setiap akhir produk
PCR. Produk PCR yang disisipkan akan dikloning kedalam vektor linier yang
telah dilengkapi dengan 3’ overhang timin (T). Pada kit yang telah
dikomersialisasikan umumnya telah menyediakan vektor dan reagen PCR yang
mempercepat ligasi. Penggunaan pDrive sebagai vektor kloning dalam bentuk
linier dengan overhang U disetiap ujungnya untuk memudahkan berhibridisasi
dengan produk PCR.
Plasmid merupakan kromosom bakteri berupa DNA sirkulasi berukuran
kecil dan mempunyai kemampuan untuk keluar masuk dari sel ke sel lainnya dan
mampu bereplikasi dan diturunkan secara stabil tanpa dikaitkan pada kromosom/
ekstra kromosom mandiri (Glick dan Pasternak, 2003).Plasmid dapat berukuran
kurang dari 1 kb atau lebih dari 500 kb. Setiap plasmid mempunyai sekuen yang
berfungsi sebagai origin of DNA replication; tanpa site ini plasmid tidak dapat
melakukan replikasi di dalam sel inang (Glick dan Pasternak, 2003). Dalam
perkembangannya plasmid digunakan sebagai kloning vektor pada pembuatan
DNA rekombinan. Plasmid rekombinan biasanya telah disisipi dengan gen
resisten antibiotik untuk memudahkan penyaringan (screening) (Gambar 10).
18
Salah satu plasmid rekombinan adalah plasmid universal cloning (pUC) yang
didesain agar screening rekombinan plasmid lebih efektif dengan menonaktifkan
gen galaktosidase yang menghasilkan enzim β-galaktosidase (Ross, 2005).
Gambar 10 Plasmid rekombinan pDrive Cloning Vector
Disamping telah disisipi gen resisten antibiotik, plasmid pUC juga
membawa fragmen DNA bakteriofag. Fragmen ini bertanggung jawab pada
sintesis langsung α peptida dari β-galaktosida yaitu enzim yang berperan dalam
memecah galaktosa. Gen Lac-Z memproduksi β-galaktosida yang digunakan oleh
bakteri dalam metabolisme laktosa (lac+).Bakteri rekombinan (rekayasa) bersifat
lac-, dimana mereka tidak dapat memproduksi α-peptid dalam β-galaktosidase
sehingga bakteri tersebut tidak mampu mencerna laktosa. Selanjutnya vektor
plasmid yang mengandung Lac+ dimasukkan kedalam sel bakteri atau biasa
disebut transformasi, sehingga secara fenotip sel bakteri mengalami perubahan
menjadi lac+. Transformasi sel merubah koloni bakteri menjadi biru (manifestasi
perubahan genetik sel bakteri) pada saat dibiakkan pada media LB yang
mengandung ampicilin dan X-gal plus IPTG (bahan yang menginduksi aktivitas
β-galactosidase (Liu, 2007). Enzim β-galaktosidase akan menguraikan
Cromogenic substrate X-gal (ahalogenated indoyl-galactosidase), senyawa
halogenated indoyl dilepaskan dan membentuk lapisan biru (Ross, 2005).
Fragmen DNA asing yang masuk ke dalam vektor akan menginterupsi sekuen
pengkode. DNA yang dimasukkan akan mencegah expression α-peptide, sehingga
bakteri tidak bisa lagi memproduksi enzim β-galaktosidase dan menjadikan koloni
bakteri berwarna putih (Liu, 2007).