LARAS AJENG PITAYU 10703055 PENAPISAN AKTIVITAS

LARAS AJENG PITAYU
10703055
PENAPISAN AKTIVITAS SUPEROKSIDA DISMUTASE
DAN IDENTIFIKASI SPESIES DENGAN METODE 16S rDNA
DARI BAKTERI ASAL INDONESIA
PROGRAM STUDI
SAINS DAN TEKNOLOGI FARMASI
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2007
Pada kutipan atau saduran skripsi ini harus
tercantum nama penulis dan lembaganya yaitu
Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung
PENAPISAN AKTIVITAS SUPEROKSIDA DISMUTASE
DAN IDENTIFIKASI SPESIES DENGAN METODE 16S rDNA
DARI BAKTERI ASAL INDONESIA
SKRIPSI
Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Sains dan
Teknologi Farmasi dari Sekolah Farmasi
Institut Teknologi Bandung
Oktober 2007
Laras Ajeng Pitayu
10703055
Debbie S. Retnoningrum, Ph.D
Pembimbing Utama
Ana Indrayati, M.Si
Pembimbing Serta
ABSTRAK
Superoksida Dismutase (SOD) merupakan enzim yang diproduksi secara alami oleh
organisme yang mengkonsumsi oksigen. SOD berperan sebagai salah satu mekanisme
pertahanan terhadap spesi oksigen reaktif yang diproduksi sebagai efek samping
metabolisme dan respirasi. Pada penelitian ini, telah dilakukan penapisan aktivitas SOD
terhadap 14 bakteri laut dan tanah yang diisolasi dari Indonesia yang belum diidentifikasi.
Setelah diperoleh sejumlah bakteri yang memiliki aktivitas SOD tinggi diperoleh,
dilakukan identifikasi spesies dengan PCR 16S rDNA. Pewarnaan Gram dan pengamatan
bentuk sel dilakukan pada 29 bakteri dan dipilih 14 bakteri secara acak dan diuji
aktivitasnya. Aktivitas ditentukan berdasarkan nilai persen inhibisi reduksi, yakni
perbandingan absorbansi ekstrak protein total bakteri dan absorbansi larutan yang hanya
mengandung NBT. Semakin tinggi aktivitas enzim SOD dalam ekstrak protein semakin
pudar warna biru keunguan yang terbentuk. Setelah didapat esktrak protein dengan
aktivitas tertinggi, dilakukan PCR 16S rDNA dilanjutkan dengan penentuan urutan
nukleotida yang dilakukan untuk identifikasi spesies penghasil SOD. Sebanyak 6 protein
ekstrak dengan aktivitas tertinggi diperoleh yakni dari bakteri SEDAL cle II3, Seskau 2,
TK Cibodas, MKS 11, MKS 13 dan Ciismun 4 dengan nilai persen inhibisi berturut – turut
adalah 25,15 %, 34,66 %, 35,75 %, 36,31 %, 37,5 %, dan 38,67%. Dari penentuan urutan
nukleotida keenam 16S rDNA bakteri tersebut, didapatkan 4 spesies yakni Bacillus
subtilis, Enterobacter cloacae, Shigella boydii, dan Escherichia coli.
i
ABSTRACT
Superoxide Dismutase (SOD) is an enzyme naturally produced by organisms consuming
oxygen. SOD plays one role in defense mechanism against reactive oxygen species which
is produced as a metabolism and respiration by products. In this study, screening of SOD
activity was carried out to 14 unidentified marine and soil bacteria isolated from Indonesia.
After obtaining a number of bacteria with high SOD activity, identification of their species
using 16S rDNA was done. Gram staining and observation of cell morphology were done
to 29 bacteria and 14 of them were randomly selected and screened for the activity of SOD
enzyme. The activity was determined based on the value of reduction inhibition
percentage, which is a ratio of absorbance of bacterial total protein and that of solution
containing only NBT. The higher the SOD activity in protein extract, the lower intensity of
blueish violet color produced. After obtaining protein extracts with the highest activity,
PCR 16S rDNA followed by sequencing was done to identify the species of SOD
producers. Six protein extracts with highest activity i.e. from SEDAL cle II3, Seskau 2, TK
Cibodas, MKS 11, MKS 13 and Ciismun 4 bacteria were obtained with their values of
reduction inhibition percentage were 25,15 %, 34,66 %, 35,75 %, 36,31 %, 37,5 %, and
38,67%, respectively. From nucleotide sequences of their 16S rDNAs, four species were
identified i.e. Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, Shigella boydii, and Escherichia coli.
ii
KATA PENGANTAR
Puji syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan berkah dan
rahmatNya sehingga buku tugas akhir ini dapat terselesaikan sebagai syarat perolehan gelar
Sarjana Farmasi dari Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung.
Ucapan terimakasih ditujukan kepada Debbie S. Retnoningrum, Ph.D, Ana Indrayati, M.Si,
dan Valentina Yurina, S.Si atas bimbingan dan masukan yang diberikan selama
penyusunan buku tugas akhir ini. Ucapan terimakasih juga ditujukan kepada orangtua,
sahabat dan teman – teman mahasiswa atas semangat dan dukungannya baik dalam bentuk
moril maupun materil. Tak lupa dihaturkan terimakasih kepada para staf dan karyawan atas
bantuannya dalam merampungkan penelitian ini.
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi banyak pihak, khususnya dalam
pengembangan penelitian selanjutnya dalam bidang biologi molekuler di Indonesia.
iii
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK ............................................................................................................
i
KATA PENGANTAR . .........................................................................................
iii
DAFTAR TABEL .................................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR.............................................................................................
vii
PENDAHULUAN .................................................................................................
1
BAB
1
TINJAUAN PUSTAKA...............................................................................
3
1.1
Radikal Bebas ....................................................................................
3
1.2
Spesi Oksigen Reaktif.........................................................................
4
1.3
Antioksidan .........................................................................................
8
1.4
Superoksida Dismutase .......................................................................
9
1.5
Identifikasi Spesies dengan 16S rDNA ..............................................
14
1.6
Penentuan Urutan Nukleotida .............................................................
15
2
METODE PENELITIAN ............................................................................
17
3
PERCOBAAN .............................................................................................
18
3.1
Bahan Percobaan ................................................................................
18
3.2
Alat Percobaan ...................................................................................
18
3.3
Sampel ...............................................................................................
19
3.4
Tahap Penentuan Aktivitas ................................................................
19
3.5
Tahap Identifikasi Gen 16S rDNA .....................................................
21
4
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN ..........................................
24
5
KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................................
32
6
RINGKASAN PENELITIAN ......................................................................
33
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................
34
iv
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
1. 1 Perlawanan Enzimatis Terhadap Spesi Oksigen Reaktif ...............................
5
1. 2 Hasil Pengamatan Bentuk Sel dan Pewarnaan Gram .....................................
24
1.3 Pertumbuhan Bakteri dan Kerapatan Optik ...................................................
25
1.4 Persen Inhibisi Reduksi ..................................................................................
26
1.5 Penentuan Polaritas Rantai .............................................................................
30
1.6 Analisis Parameter BLAST ............................................................................
30
1.7 Perbandingan Gambar Koloni Hasil Pengujian dan Pustaka .........................
31
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1. 1 Struktur Protein CuZnSOD dalam Keadaan Tereduksi dan Teroksidasi ....
10
1. 2 Struktur Protein MnSOD .............................................................................
11
1. 3 Struktur Protein FeSOD ...............................................................................
12
1. 4 Hipotesis Mekanisme Konjugasi Logam pada MnSOD ..............................
13
1. 5 Skema Gen 16S rDNA .................................................................................
15
1. 6 Hasil Zimografi Sampel Protein Total .........................................................
27
1. 7 Elektroforesis Hasil Isolasi DNA ................................................................
27
1. 8 Elektroforesis Produk PCR 16S rDNA ........................................................
28
1. 9 Hasil Penentuan Daerah Tumpang Tindih dengan Program Sequencher ....
29
vi