EFEK SUBLETAL LIMBAH BATIK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM SOD (Superoksida Dismutase) PADA IKAN NILA (Oreochromis niloticus) USULAN PENELITIAN ANNISA NAFIAH SALMAA B1A015079 KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2019 ii EFEK SUBLETAL LIMBAH BATIK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM SOD (Superoksida Dismutase) PADA IKAN NILA (Oreochromis niloticus) ANNISA NAFIAH SALMAA B1A015079 Diajukan sebagai pedoman pelaksanaan penelitian studi akhir pada Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto Disetujui dan disahkan Pada tanggal Juli 2019 Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Hernayanti, M.Si NIP. 195811021988112001 Dr. Farida Nur Rachmawati, M.Si NIP. 196304121988032001 Mengetahui, Wakil Dekan Akademik Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Dr. Hendro Pramono, M. S. NIP. 195907221986011001 ii PRAKATA Usulan penelitian ini ditulis sebagai pedoman pelaksanaan penelitian untuk memenuhi persyaratan tugas akhir di Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Penulis mengambil topik mengenai Efek Subletal Limbah Batik terhadap Aktivitas Enzim SOD (Superoksida Dismutase) pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus). Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan nikmat, rahmat, beserta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan usulan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Hendro Pramono, M S. selaku wakil dekan bidang akademik yang senantiasa memberikan bimbingan terkait tugas akhir, Dra. Erie Kolya Nasution, M.Si. selaku pembimbing akademik yang senantiasa memberikan arahan dan bimbingan mengenai akademik, Dr. Hernayanti, M.Si selaku pembimbing I yang memberikan bimbingan dan masukan dalam bidang ekotoksikologi, Dr. Farida Nur Rachmawati, M.Si. selaku pembimbing II yang memberikan arahan dan bimbingan dalam bidang fisiologi hewan, serta semua pihak yang telah berkontribusi dalam penyusunan usulan penelitian ini. penulis berharap semoga usulan penelitian ini dapat menjadi salah satu pedoman dalam pelaksanaan penelitian. Purwokerto, Juli 2019 Penulis iii DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL………………………………………………………………… i HALAMAN PENGESAHAN………………………………………………..……… ii PRAKATA…………………………………….……………………………………. iii DAFTAR ISI…………………………………..,………………………………...… iv DAFTAR TABEL......................................................................................................... v DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................. vi DAFTAR RUMUS...................................................................................................... vii DAFTAR SATUAN DAN SINGKATAN.................................................................. viii RINGKASAN…………………………………………………………….……… ix BAB I. PENDAHULUAN………………………………………..………………….. 1 BAB II. TELAAH PUSTAKA…………………………………….………………... 3 BAB III. METODE PENELITIAN…………………………………...…..…………. 6 A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian…………………….………………..… 6 1. Materi Penelitian......................................................................................... 6 2. Lokasi dan Waktu Penelitian……………………………………….……. 6 B. Metode Penelitian……………………………………………………….…… 6 1. Rancangan Percobaan……………………………………………….….... 6 2. Variabel Penelitian………………………………...……………………... 7 3. Cara Kerja Penelitian……………………………………………….….. 7 4. Analisis Data……………………………………..………………….....10 C. Bagan Alir Penelitian………………………………………………….......... 10 BAB IV. JADWAL PENELITIAN………………………………………….…….… 11 DAFTAR REFERENSI……………………………………..………………...….….. 12 iv DAFTAR TABEL Tabel 4.1. Jadwal Penelitian……………………………………………................11 v DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Spesifikasi alat dan bahan…………………………………………. 14 vi DAFTAR RUMUS Rumus 3.1. Menghitung Nilai Aktivitas SOD (Superoksida Dismutase)……....…… 10 vii SATUAN DAN SINGKATAN Simbol Satuan Cm mdpl Rpm ̊ C µl mL L U/mL pH Nm Arti Sentimeter meter di atas permukaan laut rotation per minute derajat celcius Microliter Milliliter Liter unit/milliliter potential of hydrogen Nanometer Simbol µ ̊ % % v/v Singkatan H2O2 O2O2 H2O H SOD RAK ANOVA EDTA MT M LC PK UV-VIS Keterangan Satuan Panjang Satuan Panjang Kecepatan putaran sentrifugasi Satuan temperature Satuan volume Satuan volume Satuan volume Satuan ukuran SOD Tingkat keasaman Satuan panjang gelombang spektrofotometer Arti Mikro = seper juta Derajat (Celcius) Persen (Per seratus) Persen volume per volume Arti Hidrogen peroksida Anion superoksida Oksigen Air Hidrogen Superoksida Dismutase Rancangan Acak Kelompok Analysis Of Variance Ethylenediaminetetraacetic Acid Metallothionein Metal Letal Concentration Permanganas Kalius Ultraviolet Visible viii RINGKASAN Limbah batik merupakan salah satu penyebab pencemaran di lingkungan perairan karena diketahui mengandung beberapa jenis logam berat. Hal ini dapat menyebabkan gangguan kesehatan pada manusia serta makhluk hidup lainnya. Jenis logam berat tersebut antara lain seperti krom (Cr), timbal (Pb), seng (Zn), Arsen (As), merkuri (Hg), kadmium (Cd), nikel (Ni), tembaga (Cu), dan mangan (Mn). Limbah batik yang dihasilkan oleh industri tekstil umumnya merupakan senyawa organik non-biodegradable yang mampu mengakibatkan pencemaran lingkungan perairan. Salah satu hewan yang secara langsung terkena dampak negatif adalah ikan di perairan sekitar tempat pembuangan limbah batik. Proses masuknya ion logam berat ke dalam tubuh ikan yakni melalui insang secara difusi pasif. Logam berat atau metal (M) dalam bentuk ion yang sudah masuk melalui insang kemudian diikat oleh suatu protein darah yang disebut metalotionin (Mt). Ikatan antara logam berat atau Metal (M) dengan protein metalotionin ini disebut sebagai ikatan M+Mt. Ikatan tersebut memiliki sifat yang stabil sehingga tidak mudah lepas. Hal inilah yang akhirnya memicu pembentukan radikal bebas. Ketika radikal bebas dalam tubuh semakin meningkat, maka kadar enzim SOD akan semakin menurun karena enzim ini merupakan lini pertahanan pertama saat terjadi paparan radikal bebas. Pengujian kadar enzim SOD dapat dijadikan sebagai upaya deteksi dini adanya pencemaran perairan yang disebabkan oleh limbah batik. Berdasarkan hal tersebut, maka penelitian ini memiliki tujuan untuk melihat pengaruh toksisitas limbah batik terhadap penurunan enzim SOD pada ikan nila. Ikan nila merupakan salah satu bioindikator yang baik untuk kajian toksikologi perairan serta untuk melakukan pemantauan terhadap lingkungan karena mudah didapatkan, mudah untuk beradaptasi dengan berbagai kondisi lingkungan serta memiliki nilai komersial yang tinggi. Penelitian ini dilakukan di Stasiun Percobaan D3 PSDP, Laboratorium Ekotoksikologi, dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Penelitian ini menggunakan rancangan percobaan eksperimental Rancangan Acak Kelompok (RAK) yang terdiri dari 4 perlakuan, 6 kali ulangan dan dilanjutkan dengan uji ANOVA dengan taraf kepercayaan 95% dan tingkat kesalahan 5%. Kata kunci : Limbah Batik, Superoksida Dismutase (SOD), Oreochromis niloticus ix I. PENDAHULUAN Industri batik merupakan salah satu penyumbang limbah pada perairan yang diperkirakan mengandung unsur logam berat. Banyaknya limbah buangan sisa produksi tergatung pada beberapa hal, yaitu jenis industri, besar tidaknya skala industri, kadar penggunaan air, bagaimana cara pengolahan air limbah dan pengawasan terhadap proses industri tersebut (Wardani et al. 2014). Berdasarkan Sumardjo (2009), logam berat dapat memberikan dampak buruk terutama terhadap perairan karena menimbulkan gangguan terhadap proses biologis. Jenis logam berat seperti seng (Zn), timbal (Pb) dan tembaga (Cu) dapat menyebabkan kematian ikan serta organisme perairan yang lainnya. Menurut Endrinaldi (2009), logam berat lainnya seperti arsen (As), cadmium (Cd), dan merkuri (Hg) memiliki sifat yakni afinitasnya yang besar dengan sulfur atau belerang, sehingga mengakibatkan logam-logam ini menyerang ikatan sulfida pada protein seperti enzim. Hal ini menyebabkan enzim menjadi tidak berfungsi dan juga dapat mengganggu proses transpor yang melalui membran sel. Logam berat yang masuk ke dalam tubuh organisme dapat menyebabkan terjadinya peningkatan radikal bebas. Semakin meningkat radikal bebas maka semakin menurun kadar enzim antioksidannya. Kondisi semacam ini mengakibatkan terjadinya stres oksidatif yang mengganggu kinerja sel, merusak sel dan juga DNA (Dewi, 2018). Mekanisme pertahanan di dalam tubuh memiliki kemampuan untuk mengatasi bahaya yang disebabkan oleh radikal bebas yaitu dengan memproduksi enzim yang tergolong ke dalam kelompok antioksidan endogen. Enzim tersebut antara lain katalase, peroksidase, superoksida dismutase (SOD), dan glutation. Berikut reaksi salah satu enzim, yakni superoksida dismutase (SOD) dalam menghadapi radikal bebas berupa anion superoksida (O2-) dan hIdrogen peroksida (H2O2). O2- + O2- + H + SOD H2O2, selanjutnya terjadi proses yaitu H2O2 KATALASE H2O + O2 (Gitawati, 1995). Superoksida Dismutase (SOD) merupakan salah satu enzim yang menjadi lini pertahanan pertama ketika muncul serangan dari radikal bebas. Cara kerja enzim SOD dalam menangani radikal bebas yakni dengan mengkatalisis dismutasi dari anion superoksida (O2-) menjadi hidrogen peroksida (H2O2) dan molekul oksigen (O2) (Mates et al. 1999). Aktivitas enzim antioksidan dengan intensitas yang rendah mengindikasikan tingginya kadar radikal bebas dalam tubuh. 1 Terjadinya hal tersebut disebabkan oleh SOD yang tidak mampu mengimbangi tingginya radikal bebas anion superoksida (O2-) yang seharusnya dapat dinetralkan, sehingga aktivitas SOD pun menjadi turun (Prastuti & Sunarti, 2012). Logam berat atau metal (M) yang berada di lingkungan masuk ke tubuh dalam bentuk ion. Logam berat sebagai benda asing dapat mengganggu stabilitas tubuh sehingga dilakukan pengikatan oleh protein darah yang disebut Metallothionein. Metallothionein adalah salah satu protein yang bersifat sangat peka terhadap adanya pencemaran dan berfungsi dalam mengikat logam-logam berat yang berada di lingkungan ke dalam jaringan tubuh makhluk hidup. ikatan antara logam dengan metallothionein sangat kuat dan stabil sehingga tidak mudah lepas. Hal inilah yang menyebabkan meningkatnya radikal bebas dalam tubuh sehingga aktivitas enzim antioksidan seperti SOD pun menjadi turun (Lasut, 2002). Ikan adalah hewan perairan yang dapat digunakan sebagai salah satu bioindikator pada lingkungan yang tercemar. Ikan yang dapat digunakan dalam penelitian bioindikator salah satunya adalah ikan nila. Ikan nila adalah salah satu ikan yang dibudidaya untuk tujuan konsumsi dan menjadi komoditas yang paling diminati di berbagai negara (Fadri et al. 2016). Menurut Carman & Sucipto (2009), ikan nila merupakan ikan air tawar yang memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan ikan yang lain yaitu harganya yang terjangkau, pertumbuhan cepat, perkembangbiakannya juga mudah, kadar proteinnya tinggi, ukuran tubuh yang cukup besar, lebih tahan terhadap penyakit, memiliki nilai gizi yang tinggi, serta mudah beradaptasi. Rumusan masalah yang akan dibahas dalam penelitian ini yaitu apakah paparan limbah batik berpengaruh terhadap penurunan enzim SOD (Superoksida Dismutase) pada ikan Nila (Oreochromis niloticus). Berdasarkan rumusan masalah tersebut, maka tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui paparan limbah batik berpengaruh terhadap penurunan enzim SOD (Superoksida Dismutase) pada ikan Nila (Oreochromis niloticus). Manfaat adanya penelitian ini adalah dapat memberikan informasi ilmiah mengenai pengaruh toksisitas limbah batik terhadap penurunan kadar enzim SOD (Superoksida dismutase) pada ikan Nila (Oreochromis niloticus). 2 II. TELAAH PUSTAKA Industri batik pada saat ini merupakan salah satu industri yang sudah berkembang secara luas dan memberikan dampak positif berupa pertambahan lapangan pekerjaan bagi masyarakat. Namun, jika dilihat dari sudut pandang yang lain terutama lingkungan maka adanya industri batik ini dapat menjadi salah satu penyebab terjadinya pencemaran di lingkungan perairan. Air limbah sisa pengolahan batik mengandung bahan yang berpotensi mencemari lingkungan yaitu bahan organik, lemak dengan kadar tinggi, suspensi padatan serta logam berat berbahaya seperti Zn, Cd, Cu, Cr, dan Pb (Desianna et al. 2017). Kandungan lain limbah batik berupa zat warna juga beracun bagi biota perairan. Contoh zat pewarna sintetis yang digunakan antara lain zat warna reaktif, indigosol, naphtol, dan rapid. Karakteristik salah satu zat warna yaitu naphtol antara lain merupakan bahan beracun berbahaya, bersifat karsinogenik, tahan terhadap kelunturan, tidak mudah larut dalam air serta mencemari lingkungan (Adiningtyas, 2018). Hasil pembuangan pewarna tekstil berpotensi untuk mencemari lingkungan, baik di wilayah perairan maupun pertanahan. Zatnya juga dapat terakumulasi dalam jangka waktu yang panjang, sifatnya yang toksik mengakibatkan efek yang membahayakan bagi organisme perairan serta bersifat karsinogenik terhadap manusia dan hewan mamalia (Herawati et al. 2018). Ketika logam berat berada di perairan maka dapat masuk ke dalam tubuh organisme melalui 3 cara antara lain melalui makanan, difusi permukaan kulit dan melalui insang. Organisme perairan seperti ikan menjadi salah satu akumulator logam berat di dalam tubuhnya sehingga dapat menjadi berbahaya apabila dikonsumsi oleh manusia secara terus menerus, maka dari itu ikan digunakan sebagai bioindikator untuk memantau tingkat pencemaran perairan (Yulaipi & Aunurohim, 2013). Salah satu ikan yang hidup di perairan tawar seperti di sungai adalah ikan nila. Ikan nila juga biasa digunakan sebagai bioindikator. Ikan nila dapat dikembangbiakkan di daerah rendah sampai agak tinggi (500 mdpl) dengan keadaan air yang bersih dan juga tidak terlalu keruh. Tingkat kecerahan yang baik yaitu pada kisaran 20-35 cm. kadar keasaman air (pH) optimal untuk ikan nila adalah 7-8. Kisaran suhu optimal untuk perkembangbiakan yang baik yakni 25300C. Pertimbangan mengapa ikan nila digunakan sebagai indikator pencemaran 3 lingkungan yaitu karena merupakan ikan yang memiliki daya tahan sedang terhadap terjadinya perubahan lingkungan, bersifat omnivora sehingga mampu mencerna makanan dengan efisien, euryhaline, perkembangbiakannya mudah serta dapat hidup di iklim tropis maupun subtropis (Hendrata, 2004). Bentuk dari logam berat atau metal (M) yang masuk ke dalam tubuh organisme adalah ion. Ion dari metal (M) kemudian akan berikatan dengan protein darah yakni metallothionein (MT). Ikatan kompleks antara kedua unsur tersebut bersifat stabil dan tidak mudah lepas yang dinamakan ikatan M+MT. Kuatnya ikatan M+MT mengakibatkan semakin meningkatnya jumlah radikal bebas. Radikal bebas yang semakin meningkat jumlahnya tidak seimbang dengan antioksidan dalam tubuh sehingga menyebabkan terjadinya stress oksidatif. Terjadinya stress oksidatif dapat diamati dengan adanya peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid merupakan mekanisme seluler yang mengakibatkan sel hewan menjadi rusak. Hal lainnya yang menjadi ciri stress oksidatif ialah terjadinya penurunan kadar enzim antioksidan (Dewi, 2018). Salah satu enzim antioksidan yang memiliki peran sebagai lini pertahanan pertama tubuh untuk menghadapi radikal bebas yaitu enzim superoksida dismutase (SOD). Enzim ini mampu mengubah radikal bebas berupa anion superoksida (O2-) menjadi oksigen (O2) dan hidrogen peroksida (H2O2). Superoksida dismutase merupakan enzim primer yang memiliki fungsi untuk menjaga sel-sel dalam tubuh dari adanya serangan radikal bebas. Letak SOD ini terdapat pada intraseluler dan ekstraseluler. Intraselulernya yaitu berada di dalam mitokondria, memiliki ciri yaitu sisi aktifnya terikat pada unsur mangan (Mn). Pada SOD ekstraseluler, sisi aktifnya juga berikatan dengan unsur seperti tembaga (Cu) dan seng (Zn). Enzim ini kinerjanya dipengaruhi oleh logam yang berikatan pada sisi aktifnya. Apabila kekurangan unsur-unsur logam tersebut, maka enzim ini akan berkurang kemampuannya. Enzim SOD mampu melakukan kinerjanya dengan baik jika disertai dengan unsur-unsur mineral tersebut. Unsur seperti mangan (Mn), tembaga (Cu), dan seng (Zn) terdapat pada kacang-kacangan beserta olahannya (Retnaningsih et al. 2013). Enzim superoksida dismutase mempunyai fungsi dalam melindungi sel tubuh serta mencegah adanya peradangan yang disebabkan oleh serangan radikal bebas. Enzim ini merupakan enzim antioksidan yang sudah terdapat dalam tubuh, namun kinerjanya membutuhkan unsur mineral seperti tembaga, mangan dan seng 4 agara dapat bekerja optimal. Enzim SOD terdapat dapat ditemukan pada organisme aerob dan sebagian besar berada pada level intraseluler (Putra, 2014). Menurut Winarsi (2007), enzim superoksida dismutase (SOD) dapat dikategorikan ke dalam beberapa jenis berdasarkan unsur mineral yang berikatan pada sisi aktifnya, yaitu sebagai berikut. a. Cu/Zn SOD atau SOD 1 Enzim ini adalah termasuk yang homodimer. Dapat ditemukan pada sitoplasma eukariot, peroksisom, kloroplas, serta periplasma prokariot. Peran SOD ini berperan penting dalam membangun system ketahanan terhadap oksidan dari proses oksidasi. Satu unit Cu/Zn-SOD dapat diartikan sebagi banyaknya enzim yang dibutuhkan untuk menghambat 50% autooksidasi pirogalol. Berdasarkan spesialisasinya, peran Cu penting bagi berjalannya fungsi katalitik enzim, sedangkan Zn berperan dalam fungsi structural (Winarsi, 2007). b. Mn-SOD atau SOD 2 Enzim ini bekerja dengan cara menarik muatan negative dari radikal bebas yakni anion superoksida O2- sehingga muatannya menjadi posiitif pada bagian sisi aktif. Proses yang terjadi berikutnya yaitu sisi aktif logam memberi 1 elektronnya kepada O2- sehingga berkurang 1 molekul pada O2- serta 1 protonnya untuk diubah menjadi H2O2. Dinamakan SOD 2 karena merupakan homotetrameter yang terdapat dalam matriks mitokondria yang berada dekat dengan rantai transpor elektron dan kloroplas (Winarsi, 2007). Superoksida dismutase atau SOD merupakan salah satu antioksidan intrasel yang bekerja dengan cara membersihkan radikal bebas secara enzimatis dan mengolahnya menjadi produk yang stabil. Kadar enzim ini akan meningkat apabila jumlah radikal bebas anion superoksida jumlahnya masih dapat terkontrol atau masih diambang normal. Ketika kadar radikal bebas sudah melewati batas aktivitas SOD dalam mendismutasi, maka persentase kadar SOD akan semakin turun (Mardliyah, 2017). 5 III. METODE PENELITIAN A. Materi, Waktu dan Lokasi Penelitian 1. Materi Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain ember dengan diameter 46,5 cm dan tinggi 23 cm, aerator, selang aerasi, batu aerasi, spektrofotometer UV-VIS dengan panjang gelombang 520 nm, mikropipet ukuran 100 µl & 1000 µl, yellow tip, blue tip, tabung reaksi, kuvet, vacutainer tube EDTA ukuran 3 mL, alat sentrifugator, vortex, tabung eppendorf, spuit injeksi 1 mL, alat tulis, gelas ukur 500 mL, jaring ikan, timbangan analitik, penggaris, milimeter blok, dan kamera (Lampiran 1). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu ikan Nila yang didapatkan dari Balai Benih Ikan, Dinas Peternakan dan Perikanan, Jalan Raya Baturraden, Dusun II Pandak dengan kisaran panjang 4,5 - 6 cm dan kisaran bobot 2,3 - 4,3 gram (untuk uji pendahuluan dan uji toksisitas letal) serta ikan dengan kisaran panjang 12,5 - 14,8 cm dan kisaran bobot 12,5 – 14,8 gram (untuk uji subetal), pakan ikan dengan kadar protein sebanyak 33%, EDTA, Permanganas Kalicus (PK), larutan buffer SOD, larutan standar SOD, reagen xantin oksidase, serta limbah batik yang didapatkan di daerah Jalan Pesarean, Kebutuh, Dusun I, Sokaraja (Lampiran 1). 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret sampai Mei 2019 di stasiun percobaan program studi D3 PSDP, Laboratorium Ekotoksikologi, dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. B. Metode Penelitian 1. Rancangan Percobaan Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental dengan jenis rancangan pencobaan Rancangan Acak Kelompok (RAK) Faktorial. Persiapan awal sebelum perlakuan adalah aklimasi ikan selama 7 hari dan ikan tetap diberikan pakan sesuai kebutuhannya. Uji yang dilakukan pada awal yakni uji pendahuluan. Perlakuan diujikan selama 48 jam menggunakan ikan yang berukuran kecil (4,5 – 6 cm). Seri konsentrasi yang diujikan mulai dari 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, dan 100%. Masing- masing seri 6 konsentrasi dipaparkan pada 10 ekor ikan sehingga dibutuhkan ikan sejumlah 50 ekor. Selama pengamatan dicatat jumlah ikan yang mati saat 24 jam dan 48 jam. Uji pendahuluan yang telah selesai kemudian dilanjutkan uji letal. Seri konsentrasi yang diperlakukan yakni 0%, 10%, 18%, 32%, 56%, dan 100%. Terdapat 6 seri konsentrasi sebagai perlakuan dan 4 kali ulangan sehingga jumlah unit percobaan sejumlah 24. Masing-masing unit diisi dengan ikan sebanyak 10 ekor, sehingga dibutuhkan ikan sebanyak 240 ekor. Ikan yang digunakan sama yaitu yang berukuran kecil 4,5 - 6 cm. uji letal dilakukan selama 96 jam. Pada waktu 24 jam, 48 jam, 72 jam dan 96 jam kemudian dicatat jumlah ikan yang mati. Uji letal yang telah selesai kemudian dilanjutkan uji subletal. Uji ini dilakukan selama 48 jam. Ikan yang digunakan berukuran 12,5 - 14,8 cm. Perlakuan yang diujikan sebanyak 4 perlakuan, 6 ulangan, sehingga terdapat 24 unit percobaan dengan masing- masing unit berisi 4 ekor ikan. Pada waktu 48 jam setelah perlakuan darah ikan diambil untuk mendapatkan serumnya. Serum didapatkan dari hasil sentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit, setelah serum didapat kemudian direaksikan dengan reagen SOD. Serum yang dibutuhkan sebanyak 20 µl. Reagen xantin oksidase sebanyak 100 µl dan larutan buffer SOD 1000 µl. Semua bahan tersebut dihomogenkan kemudian dilakukan spektrofotometri pada panjang gelombang 520 nm. 2. Variabel dan Parameter Penelitian Variabel yang diamati terdiri dari variabel bebas, variabel terikat, dan variabel kontrol. Variabel bebas pada penelitian ini adalah konsentrasi limbah batik. Variabel terikat pada penelitian ini yaitu aktivitas enzim SOD. Variabel kontrol pada penelitian ini adalah ikan nila. Parameter yang diukur adalah kadar enzim SOD (Superoksida Dismutase) pada ikan nila menggunakan metode RAN-SOD (Randox laboratories, 2009). 3. Cara Kerja Penelitian 3.1 Tahapan Persiapan (Aklimasi Ikan Nila) Tahapan persiapan penelitian yang perlu dilakukan salah satunya meliputi aklimasi ikan uji selama 7 hari. Persiapan ini membutuhkan peralatan seperti ember, aerator, selang aerasi, batu aerasi. Ikan diaklimasi selama 7 hari pada ember berdiameter 46,5 cm dan tinggi 23 cm. Wadah ember yang akan digunakan sebelumnya diberikan larutan 7 PK (permanganas kalicus) terlebih dahulu selama 24 jam. Persiapan lainnya yaitu membuat berbagai seri konsentrasi limbah cair batik untuk uji yang akan dilakukan sesaat sebelum ikan uji dimasukkan ke dalam tempat perlakuan (ember). Ikan Nila juga terlebih dahulu ditimbang bobotnya serta diukur panjang tubuhnya. Selama aklimasi ikan tetap diberikan pakan. 3.2 Uji Pendahuluan Uji pendahuluan ini memiliki tujuan untuk menentukan batas kisaran kadar zat toksik yang akan digunakan pada uji selanjutnya yaitu uji toksisitas letal. Pada uji pendahuluan terdapat ambang atas yakni LC100-24 jam dan ambang bawah LC0-48 jam. Nilai LC100-24 jam merupakan kadar zat toksik yang mampu mengakibatkan kematian 100% pada hewan uji. Nilai LC0-48 jam merupakan kadar zat toksik yang mampu mengakibatkan kematian 0% pada hewan uji. Uji pendahuluan ini menggunakan ikan berukuran 4,5 – 6 cm dengan bobot berkisar 2,3 – 4,3 gram. Jumlah ikan yang digunakan pada uji pendahuluan yaitu 50 ekor karena terdapat 5 seri konsentrasi yang masing-masingnya diisi dengan ikan sejumlah 10 ekor. Seri konsentrasi yang diperlakukan untuk uji pendahuluan antara lain 0,01%, 0,1 %, 1%, 10%, dan 100%. Perlakuan ini menggunakan 10 liter air pada masingmasing ember. 3.3 Uji toksisitas letal Uji toksisitas letal merupakan uji yang dapat mematikan hewan uji sebesar 50% selama waktu 96 jam atau menentukan nilai LC50-96 jam. Nilai LC50-96 jam merupakan kadar zat toksik yang mampu menyebabkan kematian hewan uji sebanyak 50% dalam kurun waktu 96 jam. Konsentrasi limbah batik yang diujikan pada uji ini berasal dari hasil uji pendahuluan yang dilakukan analisis probit. Konsentrasinya mulai dari 0%, 10%, 18%, 32%, 56%, dan 100%. Ikan yang digunakan pada uji ini merupakan ikan berukuran kecil (4,5 – 6 cm). Jumlah unit percobaan sebanyak 24 karena terdiri dari 6 perlakuan dan 4 kali ulangan, pada masing-masing unit diisi dengan 10 ekor ikan sehingga jumlah ikan keseluruhan yang digunakan adalah 240 ekor. 8 3.4 Uji toksisitas subletal Uji toksisitas subletal konsentrasinya didapatkan dari hasil uji toksisitas letal. Uji ini menggunakan ikan berukuran besar yaitu 12,5 – 14,8 cm. Jumlah unit percobaannya sebanyak 24 yang terdiri dari 4 perlakuan dan 6 kali ulangan. Hewan uji ditempatkan pada 24 unit percobaan dengan jumlahnya masing-masing adalah 4 ekor ikan. Jumlah ikan keseluruhan yang digunakan adalah 96 ekor ikan. Uji toksisitas subletal dilaksanakan selama 48 jam, setelah itu dapat dilakukan pengambilan darah ikan. 3.5 Pengambilan Darah Ikan Nila Ikan Nila dipersiapkan terlebih dahulu. Darah diambil melalui organ jantung menggunkan spuit injeksi berukuran 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam vacutainer tube berukuran 3 mL yang mengandung EDTA. Darah yang telah ditampung kemudian dipipetkan ke dalam tabung eppendorf untuk dilakukan disentrifuge dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan serumnya. Serum akan terlihat pada bagian atas tabung yang biasa disebut sebagai supernatan dengan warna jernih kekuningan. Serum yang telah diperoleh dipindahkan ke eppendorf baru agar tidak tercampur dengan endapan atau debris di bagian bawah tabung. 3.6 Pengukuran Kadar SOD Disiapkan 2 buah tabung reaksi untuk blanko dan standar seta tabung reaksi sesuai jumlah sampel. Pada tabung reaksi ditambah reagen xantin oksidase sebanyak 100 µl, dan larutan buffer SOD sebanyak 1000 µl, untuk tabung sampel ditambahkan sampel serum sebanyak 20 µl. Pada tabung standar tidak ditambahkan sampel tetapi ditambahkan larutan standar SOD sebanyak 20 µl, sedangkan pada tabung blanko tidak perlu ditambahkan larutan standar maupun sampel serum. Semua bahan tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortex, jika sudah homogen larutannya dapat langsung dibaca absorbansi dengan spektrofotometer panjang gelombang 520 nm. Hasil yang didapatkan kemudian dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: 9 Rumus 3.1 Nilai aktivitas SOD adalah sebagai berikut : Aktivitas SOD = Absorbansi Sampel x 30,65 Unit/mL Absorbansi Standar 4. Analisis Data Data yang telah diperoleh dari hasil perhitungan sebelumnya merupakan data yang akan dianalisis dengan uji ANOVA. Data tersebut digunakan untuk mengetahui bagaimana pengaruh paparan limbah batik terhadap kadar SOD (Superoksida Dismutase) pada ikan Nila. Analisis dengan ANOVA ini menggunakan taraf kepercayaan 95% dan tingkat kesalahan 5%. C. Diagram Alir Penelitian Persiapan ember & alat aerasi serta bahan limbah batik cair Aklimasi ikan selama 7 hari Uji pendahuluan dengan konsentrasi 0,01% v/v, 0,1% v/v, 1% v/v, 10% v/v, dan 100% v/v Uji toksisitas letal dengan konsentrasi 0% v/v, 10% v/v, 18% v/v, 32% v/v, 56% v/v, 100% v/v Uji toksisitas subletal dengan konsentrasi 0% v/v, 17% v/v, 34% v/v, 51% v/v Pengambilan darah ikan Nila dari jantung dengan menggunakan spuit injeksi 1 mL Sampel darah disentrifuge dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit agar diperoleh serum Sampel serum 20 µl dihomogenkan dengan 1000 µl larutan buffer SOD dan 100 µl reagen xantin oksidase Spektrofometri pada panjang gelombang 520 nm Analisis data dengan uji ANOVA Penurunan aktivitas SOD akibat paparan limbah batik 10 IV. JADWAL PENELITIAN Tabel 4.1. Jadwal Penelitian Bulan ke- (2018-2019) Kegiatan Pengunggahan Outline Penyusunan Proposal Penelitian 1. Pembuatan Proposal Penelitian 2. Seminar Proposal Penelitian Pelaksanaan Penelitian 1. Persiapan Alat dan Bahan 2. Penelitian di Lapangan 3. Penyusunan Hasil Penelitian Analisis Data 4. Penyusunan Laporan Penelitian Seminar Hasil 10 dan 11 11 12 1 2 3 4 5 6 7 DAFTAR REFERENSI Adiningtyas, F. S., 2018. Pengaruh Konsentrasi Garam Red B terhadap Kualitas Hasil Pewarnaan pada Batik Kulit Kayu Jomok menggunakan Zat Warna Naphtol. Skripsi. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta. Carman, O., & Sucipto, A., 2009. Panen nila 2,5 bulan. Jakarta: PT. Penebar Swadaya. Desianna, I., Putri, C. A., Yulianti, I., & Sujarwata., 2017. Selulosa Kulit Jagung Sebagai Adsorben Logam Chromium (Cr) pada Limbah Cair Batik. Unnes physics journal, 6(1), pp. 19-24. Dewi, N. K., 2018. Efek Paparan Logam Berat terhadap Kadar Malondialdehid dan Aktivitas Katalase Ikan Mas dan Ikan Nila di Sungai Kaligarang. Jurnal Mipa, 41(2), pp. 69-75. Endrinaldi., 2009. Logam-Logam Berat Pencemar Lingkungan dan Efek Terhadap Manusia. Jurnal kesehatan masyarakat, 4(1), pp. 42-46. Fadri, S., Muchlisin, Z. A., & Sugito., 2016. Pertumbuhan, Kelangsungan Hidup dan Daya Cerna Ikan Nila (Oreochromis niloticus) yang Mengandung Tepung Daun Jaloh (Salixtetrasperma roxb) dengan Penambahan Probiotik EM-4. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Kelautan Dan Perikanan Unsyiah, 1(2), pp. 210-221. Gitawati, R., 1995. Radikal Bebas: Sifat Dan Peranan Dalam Menimbulkan Kerusakan Atau Kematian Sel. Jurnal Cermin Dunia Kedokteran, 102, pp. 33-36. Hendrata, S., 2004. Pemanfaatan Ikan Nila sebagai Bioindikator untuk Menilai Efektivitas Kinerja Ipal Rumah Sakit Pupuk Kaltim, Bontang, Tesis, Semarang: Universitas Diponegoro. Herawati, D., Santoso, S. D., & Amalina, I., 2018. Kondisi Optimum AdsorpsiFluidisasi Zat Warna Limbah Tekstil menggunakan Adsorben Jantung Pisang. Jurnal Sainhealth, 2(1), pp. 1-7. Lasut, M. T., 2002. Metallothionein: Suatu Parameter Kunci yang Penting dalam Penetapan Baku Mutu Air Laut (BMAL) Indonesia. Ekoton, 2(1), pp. 6168. Mardliyah, N., 2017. Uji aktivitas Antiokidan Ekstrak Air Sarang Burung Wallet (Collocalia fuciphaga Thunberg.) terhadap Aktivitas Enzim Superokida Dismutase (SOD) pada Tikus Putih Jantan Galur Sprague Dawley, Skripsi. Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah. Mates, J. M., Gomez C. P., & Castro., 1999. Antioxidant enzyme and human disease. Clin biochem, 32(8), pp. 595-603. 12 Prastuti, B., & Sunarti. Pengendalian Superoksida Dismutase (SOD) dan Nitrit Oksida (NO) pada Penderita Dmt2 dengan Emping Garut (Maranta arundinacea Linn) sebagai Makanan Selingan. Jurnal Gizi Klinik Indonesia, 8(3), pp. 118-125. Putra, I. P. R., 2014. Penurunan Kadar Superoksida Dismutase Lensa Berhubungan Dengan Peningkatan Derajat Kekeruhan Lensa pada Katarak Senilis. Tesis. Bali: Universitas Udayana. Randox Laboratories., 2009. Manual Procedure RanSOD. Crumlin, Co Antrim, United Kingdom: Randox Laboratories Ltd. Retnaningsih, C., Darmono, Widianarko, B., & Muis, S. F., 2013. Peningkatan Aktivitas Antioksidan Superoksida Dismutase pada Tikus Hiperglikemia Dengan Asupan Tempe Koro Bengkuk (Mucuna pruriens L.). Agritech, 33(2), pp. 154-161. Sumardjo, D., 2009. Pengntar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran Dan Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta. Jakarta: EGC. Wardani, R. W. K., Ellyke, Nimgrum, P. T., 2014. Kandungan Krom pada Limbah Cair Batik dan Air Sumur di Sekitar Indutri Batik UD Bintang Timur (Studi Kasus di Desa Sumberpakem Kecamatan Sumberjambe Kabupaten Jember). Artikel Ilmiah. Jember: Universitas Jember. Winarsi, H., 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas: Poteni dan Aplikasinya Dalam Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius. Yulaipi, S., & Aunurohim., 2013. Bioakumulasi Logam Berat Timbal (Pb) dan Hubungannya dengan Laju Pertumbuhan Ikan Mujair (Oreochromis Mossambicus). Jurnal Sains Dan Seni Pomitts, 2(2), pp. 166-170. 13 Lampiran 1. Spesifikasi alat dan bahan No. 1. Nama alat Ember Merek/tipe - Kegunaan Tempat pemeliharaan hewan uji 2. Aerator LP 40 3. Selang aerasi - Memproduksi udara untuk disalurkan ke dalam air Menyalurkan udara dari aerator ke ember 4. Batu aerasi - Pemberat selang aerasi 5. Spektrofotometer UV-VIS Shimadzu Membaca nilai absorbansi larutan 6. Mikropipet Boeco Memindahkan cairan dengan volume tertentu 7. Tip - Bagian pada mikropipet yang menampung cairan 8. Tabung reaksi Pyrex Menampung larutan 9. Vacutainer tube EDTA Becton Dickinson Menampung darah agar tidak beku 10. Sentrifugator Digisystem Memisahkan natan dengan supernatan 11. Vortex IKA Menghomogenkan larutan 12. Kuvet Wadah penampung larutan saat spektrofotometri 14 Tempat Stasiun Percobaan D3 PSDP Fakultas Biologi Unsoed Stasiun Percobaan D3 PSDP Fakultas Biologi Unsoed Stasiun Percobaan D3 PSDP Fakultas Biologi Unsoed Stasiun Percobaan D3 PSDP Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Ekotoksikologi Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Ekotoksikologi Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Ekotoksikologi Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Ekotoksikologi Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakuktas Biologi Unsoed Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakultas Biologi Unsoed Lampiran 1. (Lanjutan) No Nama alat 13. Tabung Eppendorf - Menampung larutan saat sentrifugasi darah 14. 15. Spuit injeksi Gelas ukur Terumo - 16. Jaring ikan - Mengambil darah ikan Menampung larutan sesuai volume tertentu Menangkap ikan 17. Penggaris - 18. Timbangan analitik CHQ CO., LTD 19. Millimeter blok - No. 1. Merk/Tipe Kegunaan Tempat Mengukur panjang wadah Mengukur bobot ikan Mengukur panjang ikan 2. Nama Bahan Ikan nila (Oreochromis niloticus) Limbah batik 3. 4. Pakan Permanganas kalicus (PK) Naphtol, Asg, Caustik soda Protein 33% Cito 5. Larutan buffer SOD - 6. Larutan standar SOD - 7. Xantin oksidase - Laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas Biologi Unsoed Stasiun Percobaan D3 PSDP Fakultas Biologi Unsoed Laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas Biologi Unsoed Stasiun Percobaan D3 PSDP Fakultas Biologi Unsoed Spesifikasi - Kegunaan Sebagai hewan uji Sebagai media perlakuan 15 Sebagai sumber makanan Sebagai bahan sterilisasi wadah Menjaga kestabilan pH enzim SOD Menentukan nilai standar absorbansi Reagen yang bereaksi dengan SOD
