Isi Biosfera Sept 2011.cdr - Publikasi Online Fakultas Biologi Unsoed

Keanekaragaman Bakteri Tanah dari Teluk Kodek Area,
Pamenan Lombok Barat
Tri Ratna Sulistiyani
Pusat penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Penelitian Indonesia,
Jalan Raya Bogor-Jakarta Km. 46, Cibinong 16911 Indonesia
E-mail: [email protected]
Diterima Januari 2011 disetujui untuk diterbitkan September 2011
Abstract
Indonesia is the center of the world's biodiversity with a unique biodiversity and priceless. To
explore and get more information about biodiversity, strategic research was needed. The objective of this
reseach was to explore the population diversity of soil microbes in Lombok Island. Bacterium isolates was
identified by molecular 16S rDNA. Soil samples from 5 different sites in Lombok Island showed various
bacteria population. The highest population 113 x 106 CFU/g soil was found in soil sample around
Plumeria acuminata and the lowest 34 x 106CFU/g soil was found in soil sample around Tamarindus
indica tree. Fourteen of isolates were identified using molecular identification with homology from 94 –
100%.
Keywords: biodiversity, soil microbes, identification
Abstrak
Indonesia merupakan pusat keanekaragaman hayati dunia yang memiliki biodiversitas yang unik
dan tak ternilai harganya. Untuk menggali dan menambah informasi keanekaragaman tersebut,
diperlukan serangkaian penelitian yang strategis. Penelitian ini bertujuan untuk menggali
keanekaragaman mikroba tanah dari berbagai lokasi di Pulau Lombok melalui pendekatan molekuler
sekuensing 16S rDNA. Sampel tanah dari 5 lokasi yang berbeda di pulau Lombok memiliki populasi
bakteri yang bervariasi. Populasi bakteri tertinggi sebanyak 113 x 106 CFU/g tanah terdapat pada
perakaran tanaman Plumeria acuminata (kamboja gajah) dan terendah pada tanah yang berada pada
perakaran tanaman Tamarindus indica sebanyak 34 x 106 CFU/g tanah. 14 dari isolat terisolasi telah
teridentifikasi secara molecular 16S rDNA dengan tingkat homologi dari 94-100%.
Kata kunci: biodiversitas, mikroba tanah, identifikasi
Pendahuluan
Pulau Lombok merupakan salah satu
pulau kecil yang memiliki topograpi yang
berbukit, dataran tinggi, serta sedikit dataran
yang luas. Pulau ini memiliki tingkat
keanekaragaman hayati yang cukup tinggi.
Keanekaragaman flora dan fauna di pulau ini
lebih menunjukkan kemiripan dengan flora
dan fauna yang dijumpai di Australia
daripada Asia. Usaha penggalian sumber
daya hayati terutama mikroorganisme
bakteri terus dilakukan dalam rangka
menggali dan menambah informasi
keanekaragaman hayati yang ada di Pulau
Lombok.
Bakteri tanah memiliki peran yang
sangat penting dalam siklus kehidupan di
bumi dan merupakan salah satu mikroba
yang paling melimpah di alam. Dalam
kehidupan, mikroba memiliki banyak
manfaat diantaranya berperan dalam siklus
karbon, siklus nitrogen, proses daur ulang
sulfur, fosfor, besi dan banyak mikronutrien
lain, serta penghasil antibiotik seperti
aktinomicestes. Selain itu mikroorganisme
juga bermanfaat dalam bioremediasi yaitu
penggunaan mikroorganisme untuk
mendetoksifikasi dan menguraikan zat
berbahaya dalam lingkungan.
Dalam tanah bakteri juga berfungsi
sebagai penghasil hormon tumbuh seperti
Indol Acetic Acid (IAA), sitokinin, giberelin
agen biokontrol, yang pada akhirnya dapat
meningkatkan kesuburan tanah. Salah satu
bakteri tanah yang menguntungkan adalah
Pseudomonas . Bakteri ini memiliki
kemampuan sebagai agen biokontrol,
pendegradasi limbah-limbah pencemar
lingkungan, dan mampu tumbuh pada
kondisi yang ekstrim (Hasanudin 2003,
184
Biosfera 28 (3) September 2011
Purwaningsih 2004, Durrani 2008).
Sebagai upaya untuk mengetahui
keberadaan bakteri dari tanah tersebut
diatas, maka dilakukan penelitian dan isolasi
bakteri dari tanah berbagai lokasi dan
perakaran tanaman. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat menambah informasi dan
koleksi bakteri terutama genus
Pseudomonas dari sampel tanah.
Bahan dan Metode
Isolasi bakteri dari tanah
Isolasi bakteri dilakukan dengan
metode seri pengenceran dengan
menggunakan larutan fisiologis NaCl 0,85%.
Sebanyak 1g tanah ditimbang dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang
telah berisi larutan fisiologis 9 ml sampai
diperoleh seri pengenceran 10-1-10-5.
Masing-masing dari seri pengenceran 10-310-5 diambil 100 µl dan dimasukkkan ke
dalam cawan petri yang berisi media Difco
Pseudomonas Agar F. Susupensi diratakan
di atas permukaan lempengan agar dengan
spatula dan selanjutnya diinkubasi pada
temperatur 27oC. Koloni yang tumbuh
diamati dan dihitung jumlahnya dengan cara
mengalikan faktor pengenceran yang
digunakan. Proses selanjutnya adalah
purifikasi yang dimaksudkan untuk
memperoleh isolat murni.
Identifikasi bakteri melalui pendekatan
molekuler
Ekstraksi DNA
Untuk mendapatkan sel, bakteri
dapat ditumbuhkan di media padat atau
media cair. Pemanenan sel dari media padat
dilakukan dengan mengumpulkan sel yang
ada dipermukaan agar menggunakan ose
dan ditempatkan di tabung eppendorf 1.5 ml,
sedangkan pemanenan sel dari media cair
dilakukan dengan sentrifuse pada
kecepatan 3000xg selama 15-30 menit. Sel
yang telah dipanen dibilas menggunakan 1
ml bufer TE dan disentrifugasi 10000 rpm,
selama 15 menit.
Sel yang telah dipanen selanjutnya
dipecah menggunakan 50 µl lisozim
(50µg/ml). Kocok hingga homogen dan
inkubasi 37oC selama 30 menit. Untuk
melarutkan protein membran dan enzim,
ditambahkan pereaksi GES sebanyak 250
µl. Homogenkan hingga larut sempurna dan
inkubasi selama 10 menit pada temperatur
ruang. Dilanjutkan dengan penambahan 125
µl ammonium acetate
7.5 M dan
ditempatkan dalam es selama 10 menit.
Pemisahan DNA dari protein dan
polisakarida dilakukan dengan
menambahkan 500 µl kloroform ke dalam
larutan, dibolak-balik 50 kali, dan
disentrifuse pada kecepatan 10000 rpm
selama 10 menit. Setelah selesai sentrifus
akan terbentuk 3 lapisan dan DNA berada
pada lapisan paling atas. DNA diambil
menggunakan pipet tumpul dan ditempatkan
ke eppendorf yang baru. Untuk membentuk
benang-benang DNA, ke dalam larutan DNA
ditambahkan isopropanol setengah dari
volume larutan DNA, kemudian dibolak-balik
sampai terlihat benang-benang DNA.
Sentrifuse pada kecepatan 10000 rpm
selama 5 menit hingga benang-benang DNA
mengendap. Selanjutnya endapan DNA
dicuci dengan etanol 70 % dingin. Sentrifuse
kembali dan buang supernatan. DNA
dikeringanginkan selama 10 menit,
dilarutkan dalam 100 µl 0.2X bufer TE, dan
selanjutnya konsentrasi DNA diukur
menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 260 nm.
Amplifikasi PCR 16S rDNA
Amplifikasi 16S rDNA dilakukan
menggunakan GoTaq (Promega) dengan
primer 20F dan 1500R, dengan komposisi
8.75 µl Ultrapure water, 12.5 µl GoTag Green
Master Mix 2X, 0.625 µl primer 20F (10 µM),
0.625 µl primer 1500F (10 µM), 0.5 µl DMSO,
dan 2 µl sampel DNA dengan total volume 25
µl. Amplifikasi dilakukan dengan kondisi
PCR 95 C selama 3 menit, dilanjutkan (95C,
30 detik denaturasi; 50 o C, 30 detik
annealing; 72oC, 90 detik elongasi) 30 siklus
dan final extension pada 72oC, 10 menit .
Elektroforesis
Sebanyak 3 ìl dari produk PCR
dianalisis menggunakan gel agarose 1%
dengan aliran listrik bertegangan 100 V
selama 30 menit. Setelah selesai, gel
direndam dalam larutan etidium bromida 0.5
µl/mL selama 30 menit dan dibilas
menggunakan bufer TAE 1X. Hasil
elektroforesis dilihat menggunakan alat gel
documentation.
Purifikasi produk PCR
Purifikasi produk PCR dilakukan
dengan PEG precipitation method (Hirashi et
Sulistiyani, Keanekaragaman Bakteri Tanah : 183 - 189
al., 1995). Produk PCR ditambah dengan 15
µl larutan PEG (40% PEG 6000 dalam 10
mM MgCl2) dan 6 µl 3 M sodium asetat.
Kocok selama 10 menit pada temperatur
kamar, kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 16.000 rpm selama 25 menit.
Endapan DNA yang terbentuk dicuci 2 kali
dengan etanol 70% dan dikeringanginkan
selama 10 menit. DNA dilarutkan dalam 20 µl
milli-Q dan dilanjutkan dengan cycle
sequencing.
Cycle sequencing
Produk PCR yang yang telah
dipurifikasi dilanjutkan dengan Cycle
sequencing. Komposisi cycle sequencing
0.5 µl BDT Rrmix, 1.75 µl 5X Seq buffer, 0.5
µl Seq primer (10 µM) dengan primer 520F
(5'GTGCCAGCAGCCGCGG-3') dan
920R (5'GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'), 1.0
µl produk PCR, dan 6.25 µl Ultrapure water.
cycle sequencing dilakukan pada kondisi 95
C selama 1 menit, dilanjutkan 40 siklus (95C,
10 detik denaturasi; 50oC, 5 detik annealing;
60oC, 90 detik elongasi) dan dilanjutkan
pada 4oC.
Hasil cycle sequencing dipurifikasi
kembali dengan Ethanol purification method.
Produk cycle sequencing ditambah 1 µl
EDTA 125 mM, 1 µl natrium asetat 3 M, dan
25 µl etanol 99%. Kocok hingga homogen,
inkubasi pada temperatur kamar selama 15
menit dan disentrifus pada kecepatan 16000
rpm selama 25 menit 4 oC. Endapan DNA
selanjutnya dicuci dengan etanol 70%,
disentrifuse kembali dan endapan DNA
dikeringanginkan 10 menit.
Urutan basa nitrogen dibaca
menggunakan automated DNA sequencer
(ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer)
(Applied Biosystems). Data hasil sekuensing
selanjutnya diolah dengan program Bioedit,
Clustalx, dan Njplot. Data yang diperoleh
dicari homologinya atau dicocokkan dengan
bank data DNA yang ada secara online di
i n t e r n e t ( w w w. d d b j . n i g . a c . j p ;
www.ncbi.nlm.nih.gov).
Hasil dan Pembahasan
Bakteri mendapat banyak perhatian karena
mampu tumbuh dengan cepat dan dapat
mendekomposisi berbagai substrat yang
ada di alam. Kepadatan dan komposisi
bakteri dalam suatu lingkungan sangat
dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, antara
185
lain kelembaban, aerasi, temperatur,
keasaman, kandungan zat organik, dan
anorganik. Keadaan iklim terutama curah
hujan juga berpengaruh terhadap
perkembangan mikoorganisme dalam
tanah. P. Lombok memiliki curah hujan
sebesar 1.500 mm per tahun, sehingga
tanahnya mempunyai tingkat kesuburan
yang cukup baik, yang memungkinkan
bakteri tumbuh dengan baik (WWF
Indonesia, mendatangkan Dewi Sri di Pulau
Lombok, 13 Juli 2010). Tanah yang
mendapat aerasi cukup, bakteri dan fungi
akan tumbuh dominan, sedangkan
lingkungan yang mengandung sedikit atau
tanpa oksigen, bakteri akan berperan
terhadap hampir semua perubahan biologis
dan kimia lingkungan tanah.
Hasil isolasi menunjukkan bahwa
populasi bakteri bervariasi pada masingmasing sampel tanah yang diamati (Tabel
1.). Hasil isolasi bakteri dari 5 titik sampling
menunjukkan bahwa populasi bakteri lebih
banyak terdapat pada sampel yang
ditumbuhi tanaman dibandingkan sampel
yang tidak ditumbuhi oleh tanaman. Sampel
tanah di sekitar pohon Plumeria acuminata
(kamboja gajah) memiliki populasi bakteri
tertinggi dibandingkan dengan sampel tanah
yang lain yaitu sebanyak 113 x 106 CFU/g
tanah dan terendah pada sampel tanah yang
berada pada perakaran tanaman
Tamarindus indica sebanyak 34 x 10-5CFU/g
tanah. Perbedaan populasi ini dipengaruhi
oleh kondisi lingkungan sampel yang
diambil. Eksudat dari akar
kamboja
berperan sebagai substrat dan nutrisi yang
bagus bagi pertumbuhan dan aktivitas
bakteri yang ada di perakaran tanaman
tersebut. Sedangkan sampel dari perakaran
tanaman Tamarindus indica menunjukkan
populasi bakteri yang terendah dikarenakan
tanaman tersebut menghasilkan senyawa
metabolit sekunder yang kemungkinan
bersifat antimikroba sehingga
kelangsungan hidup mikroba di sekitar
perakaran tanaman tersebut menjadi
terganggu (Doughari, 2006).
Daun
Tamarindus indica mengandung senyawa
kimia terpenoid, saponin, flavonoid, dan
asam-asam organik, sedangkan buahnya
Buah polong asam jawa mengandung
senyawa kimia antara lain asam appel, asam
sitrat, asam anggur, asam tartrat, asam
suksinat, pectin dan gula invert. Diduga
senyawa-senyawa inilah yang
186
Biosfera 28 (3) September 2011
mempengaruhi kelimpahan jumlah mikroba
di perakaran tanaman Tamarindus indica
menjadi lebih sedikit dibandingkan tanaman
yang lain (Hertiani, 2002). Apabila
dibandingkan dengan sampel-sampel yang
lain, sampel tanah dari pantai senggigi
dengan kondisi lingkungan berupa tanah
dan bebatuan menunjukkan populasi bakteri
yang sedikit. Hal ini kemungkinan
disebabkan tidak tersedianya sumber
substrat dan nutrisi yang penting bagi
pertumbuhan bakteri.
Tanah yang ditumbuhi tanaman
memiliki kandungan bahan organik dan
unsur hara makro lebih tinggi dibandingkan
tanah tanpa tumbuhan. Tanah yang
ditumbuhi pohon mengandung bahan
organik atau unsur C yang umumnya di atas
2.5%, sedangkan C pada tanah tidak ada
tumbuhan pohon tetapi didominasi alangalang adalah di bawah 0.7%. Hal ini
disebabkan antara lain bahan organik yang
dihasilkan pohon lebih mudah mengalami
perombakan dan bahan organik ini
dihasilkan dalam jumlah banyak sehingga
cukup tersedia untuk pertumbuhan dan
perkembangan mikroba tanah
(Purwaningsih 2004).
Wiley, 1961, mengemukakan bahwa jumlah
bakteri di daerah perakaran tanaman
berlimpah hingga 109 sel pergram tanah.
Kenyataan ini menunjukkan bahwa tanah
yang ditumbuhi aneka tumbuhan tentunya
mengandung bahan organik dalam jumlah
yang memadai yang sangat dibutuhkan
untuk kelangsungan hidup bakteri.
Setiap mikroorganisme akan tumbuh
dengan baik dalam lingkungannya selama
kondisi tersebut menguntungkan bagi
pertumbuhan dan pertahanan dirinya, sama
halnya dengan mikroba-mikroba yang ada di
dalam tanah. Begitu terjadi perubahan fisik
atau kimiawi, seperti habisnya nutrien atau
terjadinya perubahan radikal dalam hal
temperatur atau pH, yang membuat kondisi
bagi pertumbuhan spesies lain lebih
menguntungkan, maka organisme yang
telah teradaptasi dengan baik dalam
keadaan tanah terdahulu terpaksa
menyerahkan tempatnya kepada organisme
yang dapat beradaptasi dengan baik dalam
kondisi yang baru itu.
Tabel 1. Jumlah bakteri total dari beberapa sampel tanah di Pulau Lombok
Table 1. Total number of bacteria from some soil samples in Lombok Island
Kode sampel
Asal sampel
Kode
isolate
Jumlah bakteri total
(106)
LS 01
Pantai senggigi, teluk kodek
C
42
LS 02
Sekitar pohon Mangifera indica (mangga)
D
76
LS 03
Sekitar tanaman Anacardium occidentale (jambu
monyet)
E
81
LS 04
Sekitar pohon Tamarindus indica (asam jawa)
F
34
LS 05
Sekitar pohon Plumeria acuminata (kamboja
gajah)
G
113
Gambar 1. Hasil isolasi sampel tanah dari Pulau Lombok
Figure 1. Results of soil sample isolation from Lombok Island
Sulistiyani, Keanekaragaman Bakteri Tanah : 183 - 189
Isolasi dilakukan menggunakan
media Pseudomonas Agar F dengan
harapan bakteri yang terisolasi termasuk
dalam genus Pseudomonas atau
kelompok bakteri gram negatif.
Berdasarkan hasil identifikasi melalui
pendekatan molekuler dengan
sekuensing 16S rDNA menunjukkan
bahwa populasi bakteri yang terisolasi
terdiri dari beberapa genus bakteri (Table
2). Tidak semua bakteri yang terisolasi
merupakan bakteri genus Pseudomonas
, hampir 83% bakteri terisolasi
merupakan bakteri non genus
Pseudomonas . Pada gambar 2 dapat
diamati hubungan kekerabatan antar
isolat yang diperoleh. Hampir 35%
bakteri yang teridentifikasi merupakan
genus Bacillus dimana kelompok bakteri
ini berperan dalam proses dekomposisi
kitin (Lyla dan Ajmal, 2006). Spesies
Bacillus merupakan sapropit tanah yang
187
tersebar luas di seluruh dunia. Spora dari
Bacillus dapat bertahan 60 tahun atau
lebih di bawah kondisi lingkungan yang
keras. Selain Bacillus genus yang juga
banyak teridentifikasi adalah
Arthrobacter. Arthrobacter merupakan
genus yang tersebar luas di tanah, hal ini
disebabkan Arthrobacter mampu
memproduksi berbagai enzim yang
dapat memetabolisme berbagai
substansi yang ada di tanah, termasuk
organopospat. Genus Pseudomonas
merupakan salah satu genus bakteri
yang tersebar luas di tanah selain
arthrobacter. Beberapa bakteri tanah
termasuk genus Pseudomonas memiliki
kemampuan untuk melarutkan P organic
menjadi bentuk fosfat terlarut yang
tersedia bagi tanaman dan berperan
dalam proses dekomposisi protein
dalam tanah,
Table 2. Hasil identifikasi isolat bakteri melalui pendekatan molekuler 16S rDNA
Table 2. Identification results of bacterium isolates with molecular approach of 16S rDNA
No.
Kode isolat
1
C1
Bacillus amyloliquefaciens
2
C4
Micrococcus luteus
3
C5
Cupriavidus gilardii
4
D2
Bacillus megaterium
5
D3
Arthrobacter crystallopoietes
6
E4
Pseudomonas plecoglossicida
7
E5
Bacillus substilis
8
F3
Bacillus substilis
9
F7
Arthrobacter oryzae
10
G1
Bacillus niacin
11
G2
Staphylococcus_hominis
12
G5
Arthrobacter globiformis
13
G6
Dyella marensis
14
G7
Microbacterium trichothecanolyticum
Hasil identifikasi
188
Biosfera 28 (3) September 2011
Gambar 2. Hubungan kekerabatan antar isolat bakteria dari tanah Teluk Kodek,
Lombok
Figure 2. Phylogenetic relationship amongst soil bacterium isolates from Teluk
Kodek, Lombok
Kesimpulan
Dari hasil penelitian ini dapat
disimpulkan bahwa sampel tanah dari
perakaran tanaman di Pulau Lombok
memiliki populasi bakteri yang
bervariasi. Populasi bakteri tertinggi
sebanyak 113 x 10 6 CFU/g tanah
terdapat pada perakaran tanaman
Plumeria acuminata (kamboja gajah)
dan terendah pada tanah yang berada
pada perakaran tanaman Tamarindus
indica sebanyak 34 x 105CFU/g tanah.
Empat belas isolat teridentifikasi secara
molekuler dengan 16S rDNA dengan
genus paling banyak adalah Bacillus.
Daftar Pustaka
Doughari JH. 2006. Antimicrobial activity
of Tamarindus indica Linn.
Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 5(2):597-603.
Durrani, R., M Abubakar, Arshed M.J.,
Saleha S., Ullah I., Ali Q. 2008.
Biological characterization and
protein profiles two model
bacteria by SDS-PAGE and FTIR. ARPN Journal of Agricultural
and Biological Scienc. 3 (5&6) 616.
Hasanudin 2003. Peningkatan Peran
Mikroorganisme dalam Sistem
Pengendalian Penyakit
Tumbuhan Secara Terpa
http//www.plasmanutfah.unej.ac.id.
Diakses 17 Desember 2010.
Hertiani,T., dan Pratiwi, S.U.T. 2002. Uji
Toksisitas Kulit Batang Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl. dan
Profil KLT Fraksi Aktif, MFI.
Pharmacon, 3: 7-11.
Hougardy A. 2000. RhodoPseudomonas
rhenobacensis sp. Nov., a new
nitrate reducing purple non sulfur
Sulistiyani, Keanekaragaman Bakteri Tanah : 183 - 189
bacterium. Int J Syst Evol
Microbial 50: 985-992.
Kunitsky C, Osterhout G, Sasser M.
2006. Identification of Microorganisms using Fatty Acid
Methyl Ester (FAME) Analysis and
theMIDI Sherlock Microbial
Identification System. USA
[www.pda.org/bookstore].
Lyla, P. S., dan Ajmal. K. S. 2006. Marine
Microbial Diversity and Ecology:
Importance and Future
Perspectives. Current Science.
90: 1325 - 1335.
Pitcher DG, Saunders A, Owen RJ. 1989.
Rapid extraction of bacterial
genomic DNA with guanidium
thiocyanate. J. Applied
Microbiology 8: 151-156.
189
Purwaningsih S. 2006. Isolasi,
enumerasi, dan karakterisasi
bakteri rhizobium dari tanah
Kebun Biologi Wamena, Papua.
Biodiversitas 6:82-84.
Purwaningsih, S., Hardiningsih R.,
Wardah, Sujadi A. 2004. Populasi
bakteri dari tanah di desa
Tudu_Aog, kecamatan Passi,
kabupaten Bolaang Mongondow,
Sulut. Biodiversitas. 5:13-16.
Reid G, and P. Wong. 2005. Soil bacteria.
State of New South Wales.
Department of Primary Industries.
http://www.dpi.nsw.
gov.au/data/assets. Diakses
January 2011)
http//www.plasmanutfah.unej.ac.id.
Diakses 17 Desember 2010.
Wiley. A.M.J. 1961. Introduction to Soil
Microbiology. Japan: Toppan
Printing.
Biosfera 28 (3) September 2011 Sulistiyani, Keanekaragaman Bakteri Tanah : 183 - 189
Penelaah Volume 29, September 2011
Agus Irianto
Agus Nurganto
Dwi Nugroho Wibowo
Husein Sastranegara
Sugiyono
Priyo Susatyo
Pudji Widodo
Uki Awiputranto
190