PERBANDINGAN BEBERAPA METODE ISOLASI DNA UNTUK

PERBANDINGAN BEBERAPA METODE ISOLASI DNA UNTUK
PENENTUAN KUALITAS LARUTAN DNA TANAMAN SINGKONG
(Manihot esculentum L.)
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai
macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi
DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA (Sambrook et al. 1989). Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan
dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk
semua spesies dan metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi
molekul DNA; dengan metode yang sederhana dan cepat. Penggunaan teknik isolasi
DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional
memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara
kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh
tergantung jenis sampel.
Bahan yang digunakan adalah bibit tanaman singkong varietas Adira 4 dan
Jame-Jame (Tabel 1), buffer lysis CTAB, buffer lysis SDS, DNA Isolation Kit, dH2O,
ethanol absolute atau isopropanol dingin, CIA (Chloroform Isoamyl Alkohol dengan
perbandingan 24:1), agarose, buffer TAE, dan ethidium bromide (EtBr). Lima metode
isolasi DNA yang digunakan untuk mengisolasi DNA tanaman singkong yaitu metode
isolasi DNA menggunakan CTAB, metode isolasi DNA menggunakan SDS, metode
isolasi cepat DNA menggunakan SDS, metode isolasi cepat dengan SDS dan
pemanasan, dan metode isolasi cepat DNA menggunakan Isolation Kit (Sigma,
dimodifikasi). Alur pengujian dapat dilihat pada Gambar 1.
Tabel 1. Berat sampel daun singkong muda untuk isolasi DNA
Ulangan
Berat Sampel (gram) pada Varietas
Adira 4
Jame-jame
1
0,53
0,59
2
0,3
0,2
3
0,02
0,02
4
0,04
0,04
5
0,3
0,3
Ilustrasi rangkaian isolasi DNA tersebut dapat dilihat pada Gambar 1 berikut.
a
b
c
d
e
f
Gambar 1.a) pengguntingan daun sampel untuk mempermudah penggerusan jaringan;
b) penggerusan daun dengan mortar dan pestle; c) sampel yang telah digerus;
d) penambahan chloroform isoamyl alcohol; e) presipitasi DNA;
f) pengeringan DNA dengan vaccum.
1
Kuantitas dan kualitas DNA dapat diduga melalui spektrofotometri sinar ultra
violet, dengan alatnya yang disebut spektrofotometer. Prinsip kerja spektrofotometer
adalah iradiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan.
Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida secara maksimal dicapai pada panjang
gelombang 260 nm. Apabila kepadatan optic (optical density) biasa disebut OD260 sama
dengan 1, maka konsentrasinya setara dengan 50 µg/mL DNA untai ganda atau 40
µg/mL RNA dan DNA untai tunggal, atau setara dengan 20 µg/mL oligonukleotida
untai tunggal (Sulandri et al. 2003).
Penentuan kuantitas DNA sampel dua genotype singkong yang diisolasi
menggunakan empat metode isolasi DNA pada panjang gelombang 260 nm, dan
hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2 berikut.
Tabel 2. Kuantitas/Konsentrasi DNA Hasil Isolasi DNA menggunakan lima metode isolasi
Metode Isolasi
Genotype
A260 nm
Konsentrasi
No
(µg/mL)
1
CTAB
Adira 4
0,125
1250
Jame-jame 0,128
1280
2
SDS
Adira 4
0,465
4650
Jame-jame 0,099
990
3
Isolasi Cepat dengan SDS
Adira 4
0,029
290
Jame-jame 0,020
200
4
Isolasi Cepat dengan SDS dan pemanasan
Adira 4
0,080
800
Jame-jame 0,081
810
5
Kit Isolation
Adira 4
0,049
490
Jame-jame 0,029
290
Secara umum seluruh konsentrasi yang dihasilkan dari kelima metode isolasi
telah memenuhi syarat minimal konsentrasi DNA yang dibutuhkan untuk pemanfaatan
marka molekuler selanjutnya seperti RAPD, SSR, ISSR yang hanya membutuhkan
DNA dengan konsentrasi rendah (±50 µg/mL). Perbandingan efisiensi kelima metode
isolasi DNA tersebut diatas dapat dikelompokkan berdasarkan efisiensi waktu isolasi
DNA dan kebutuhan bahan kimia yang diperlukan selama proses isolasi DNA terutama
kebutuhan untuk buffer lisis (lihat Tabel 3). Konsentrasi DNA pada Tabel 3 merupakan
hasil konsentrasi DNA pada Tabel 2 dibagi dengan jumlah contoh kerja yang digunakan
saat isolasi DNA.
Berdasarkan hasil isolasi DNA menggunakan kelima metode isolasi DNA
terlihat metode SDS Cepat dengan pemanasan baik pada genotype Adira 4 dan Jamejame memiliki konsentrasi DNA tertinggi. Metode dengan Kit menghasilkan
konsentrasi DNA terendah pada kedua genotipe singkong yang digunakan. Berdasarkan
Tabel 3 dapat dilihat efisiensi kelima metode isolasi DNA baik waktu dan bahan kimia
yang dibutuhkan dalam proses isolasi DNA. Metode isolasi DNA SDS Cepat memiliki
waktu penyelesaian yang relatif lebih singkat dan konsentrasi DNA yang dihasilkan
relatif lebih tinggi dibandingkan dengan metode lainnya. Metode SDS Cepat dengan
pemanasan memiliki efisiensi yang tertinggi yaitu waktu isolasi DNA lebih singkat 45
detik lebih singkat dari metode SDS tanpa pemanasan dan konsentrasi DNA lebih dari
4000 (µg/mL). Sedangkan metode Kit memiliki efisiensi terendah dengan waktu isolasi
yang hampir sama dengan metode CTAB dan SDS standar namun membutuhkan bahan
kimia yang berupa kit relatif lebih mahal dibandingkan dengan metode lainnya.
2
Tabel 3. Perbandingan Efisiensi Waktu dan Bahan Kimia Empat Metode Isolasi DNA
Genotipe
Metode
Kebutuhan Waktu
Kebutuhan Bahan Kimia
(menit)
Nama Bahan
Konsentrasi
Stok Kerja
Adira 4
CTAB
96
Tris HCl pH 8.0 100 mM
NaCl
1400 mM
EDTA
20 mM
CTAB
2%
SDS
96
Tris HCl pH 8.0 200 mM
SDS Cepat
63 menit 45 detik
NaCl
250 mM
SDS Cepat Dengan Pemanasan
64 menit 30 detik
EDTA
25 mM
SDS
0.5%
Kit
93 menit 45 detik
JameCTAB
96
Tris HCl pH 8.0 100 mM
Jame
NaCl
1400 mM
EDTA
20 mM
CTAB
2%
SDS
96
Tris HCl pH 8.0 200 mM
SDS Cepat
63 menit 45 detik
NaCl
250 mM
SDS Cepat Dengan Pemanasan
64 menit 30 detik
EDTA
25 mM
SDS
0.5%
Kit
93 menit 45 detik
Konsentrasi
DNA
236
1,550
2,900
4,000
82
217
495
2,000
4,050
48
3
Tingginya nilai kuantitas DNA hasil isolasi menggunakan metode isolasi cepat
dengan SDS perlakuan pemanasan dibandingkan dengan metode lain dikarenakan SDS
merupakan senyawa deterjen anionic yang lebih kuat dibandingkan dengan CTAB (deterjen
ionic) dalam merusak membran sel, dan perlakuan pemanasan dapat meningkatkan
aktivitas senyawa SDS dalam merusak membrane sel sehingga banyak DNA yang
terekstraksi atau terisolasi dari sel.
Berdasarkan efisiensi waktu dan bahan kimia yang dibutuhkan untuk mengisolasi
DNA daun singkong maka disarankan menggunakan metode SDS cepat dengan
pemanasan.
Elektroforesis adalah proses migrasi fragmen DNA di dalam gel yang direndam dalam
larutan penyangga. Fragmen DNA yang lebih kecil berat molekulnya akan berjalan lebih
cepat dari molekul DNA yang lebih besar. Semakin besar tegangan arus listrik, perjalanan
molekul DNA akan semakin cepat, demikian pula sebaliknya (Sulandri et al., 2003).
Ada bermacam-macam zat kimia yang digunakan sebagai gel di dalam proses
elektroforesis. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel
poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat (Pratiwi, 2001). Terdapat beberapa macam
metode elektroforesis termasuk gel yang digunakan antara lain yaitu elektroforesis gel
agarose dengan visualisasi menggunakan ethidium bromide, dan elektroforesis gel
polyacrylamide dengan visualisasi menggunakan silver staining (Sulandri et al.,2003).
Pada praktikum ini yang digunakan adalah elektroforesis horizontal dengan media
gel agarose. Konsentrasi gel agarose yang digunakan adalah 1,5% dalam buffer TAE 1x,
dan dirunning dengan voltase 100 V selama ±20 menit. Selanjutnya diwarnai dengan
ethidium bromide selama 10 menit dan dibilas dengan dH2O selama 20 menit. Setelah itu
gel agarose yang telah terwarnai divisualisasikan dengan sinar UV dengan alat UV
Transilluminator. Visualisasi gel agarose DNA hasil isolasi DNA dapat dilihat pada
Gambar 2.
CTAB
SDS
SDS Cepat
SDS Cepat +
Pemanasan
Kit Isolasi
DNA
Gambar 2. Visualisasi pengujian kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi DNA sampel
daun singkong menggunakan tiga metode isolasi DNA
Berdasarkan gambar diatas terlihat bahwa kualitas larutan DNA dengan metode
isolasi CTAB dan SDS tidak sebaik dengan metode isolasi cepat dengan SDS baik tanpa
perlakuan maupun dengan pemanasan dan metode isolasi menggunakan DNA isolation kit.
Pada metode isolasi CTAB dan SDS terlihat masih terdapat banyak kontaminasi baik
protein maupun RNA. Berdasarkan hasil diatas kelima metode isolasi yang digunakan
metode isolasi cepat dengan SDS tanpa pemanasan dapat dijadikan sebagai metode rujukan
dalam mengisolasi DNA tanaman khususnya untuk komoditas singkong dengan
4
menggunakan organ daun sebagai sampel isolasi. Metode ini hanya menggunakan bobot
sampel yang relatif sedikit, tidak diperlukan penggerusan menggunakan mortar dan pestle
dan tidak membutuhkan nitrogen cair (N2liquid) sebagai sarana membantu proses
penggerusan dan memberikan kuantitas serta kualitas DNA yang cukup baik.
Metode isolasi CTAB dan SDS dapat diaplikasi untuk isolasi DNA dengan catatan
dibutuhkan langkah tambahan atau modifikasi yaitu dengan purifikasi DNA dengan
penambahan RNAse serta proteinase. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan debris sel
(protein dan RNA) yang masih tercampur dengan larutan DNA. Sedangkan isolasi DNA
dengan DNA isolation Kit tidak disarankan mengingat harga kit tersebut yang cukup mahal
dengan kuantitas dan kualitas DNA hasil isolasi yang cukup rendah.
Menurut Jamsari, 2007, beberapa hal penting yang harus diperhatikan dalam
kegiatan isolasi DNA adalah 1) keutuhan ukuran molekul DNA karena hal ini berkaitan
dengan tindakan-tindakan rekayasa lanjutan yang akan dilakukan seperti pemotongan
secara enzimatis dalam pembuatan peta restriksi akan lebih banyak alternative
dibandingkan dengan DNA yang sudah terputus; 2) efektifitas isolasi DNA dimana setiap
tanaman memiliki spesifikasi struktur fisikokimia yang berbeda-beda sehingga diperlukan
metode isolasi yang efektif untuk menghasilkan konsentrasi DNA yang tinggi ; 3)
kemurnian isolasi DNA agar tidak terdapat senyawa penghambat proses enzimatis pada
tahap selanjutnya; dan 4) praktis dan ekonomis agar laboratorium yang baru dikembangkan
dapat mengaplikasikan metode isolasi tersebut.
Sumber
1. Jamsari. 2007. Bioteknologi Pemula (Prinsip Dasar dan Aplikasi Analisis Molekuler).
Unri Press. Pekan Baru
2. Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. IPB Press. Bogor
3. Pratiwi Rianta. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana Volume XXVI
Nomor 1
4. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
5. Sulandri Sri, M.Syamsul Arifin Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. LIPI
-Disusun oleh : Tendy Wijiastuti – PBT Balai Besar PPMB-TPH-
5