protein yang terkait dengan patogenesis dari hevea brasiliensis

PROTEIN YANG TERKAIT DENGAN PATOGENESIS
DARI HEVEA BRASILIENSIS MUELL ARG
(ISOLASI, STRUKTUR DAN FUNGSI)
ABSTRAK DISERTASI
Karya Ilmiah untuk memperoleh gelar Doktor
Dalam bidang Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam di Institut Teknologi Bandung
Dipertahankan pada Sidamg Terbuka Komisi Program Doktor
Program Pascasarjana Institut Teknologi Bandung
Tanggal 24 Juni 2000
Oleh
TOTO SUBROTO
Promotor
Ko-promotor
: Prof.Hj.Soekeni Soedigdo, Ph.D.
: Prof.Dr. J.J. Beintema
Purwo Arbianto, Ph.D.
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2000
ABSTRAK
Indonesia merupakan negara pengekspor karet alam terbesar di dunia setelah Thailand. Peningkatan
kualitas tanaman karet (Hevea brasiliensis) secara konvensional terus dilakukan melalui pencarian
bibit unggul. Namun demikian, peningkatan produksi karet alam seringkali dihambat oleh adanya
serangan hama terutama fungi patogen. Untuk pengendalian fungi patogen pada umumnya
digunakan fungisida sintetik, namun cara ini seringkali menimbulkan dampak negatif terhadap
lingkungan dan harganya relatif mahal. Dengan demikian alternatif lain diperlukan untuk
pengendalian penyakit yang lebih efisien serta aman terhadap lingkungan.
Konsep baru pengendalian penyakit tanaman, adalah melalui transfer gen resisten ke dalam genom
sate spesies tanaman maupun spesies lain. Untuk mengidentifikasi dan mengisolasi gen resisten,
diperlukan informasi struktur primer parsial proteinnya yang kemudian digunakan untuk merancang
oligonukleotida yang kornplemen dengan bagian deret gen yang mengkode protein tersebut.
Dengan demikian, informasi struktur primer protein spesifik yang berperan dalam resistensi
tanaman, sangatlah esensial untuk mengisolasi dan mengidentifikasi gen resisten tersebut, selain itu
protein alami diperlukan untuk pengujian aktivitas biologisnya serta mengetahui proses yang terjadi
selama modifikasi pascatranslasinya.
Informasi mengenai protein yang berperan dalam pertahanan H. brasiliensis, terlebih lagi pada klon
H. brasiliensis yang resisten belum banyak diketahui. Penelitian protein yang berperan dalam
pertahanan tanaman, mengungkapkan bahwa tanaman mensintesis protein-PR (Pathogenesisrelated protein) ketika tanaman diinfeksi oleh patogen Fungsi protein-PR antara lain sebagai
kitinase Ban β-1,3- glukanase, kedua enzim ini mampu mengkatalisis hidrolisis polisakarida yang
merupakan komponen utama Binding sel fungi. Dengan demikian kemungkinan besar kedua enzim
tersebut berperan dalam pertahanan tanaman terhadap serangan fungi patogen. Kenyataan ini
didukung oleh tidak ditemukannya kitin pada tanaman tinggi, juga kedua enzim ini dapat
mendegradasi isolat dinding sel fungi Ban telah ditunjukkan menghambat pertumbuhan fungi in
vitro Ban bahkan uji in vivo pada tanaman transgenik proteinPR dapat meningkatkan resistensi
tanaman terhadap fungi patogen.
Penelitian ini bertujuan untuk: 1) mengisolasi Ban mengidentifikasi protein utama dalam organel
lutoid lateks H. brasiliensis, 2) mengkarakterisasi struktur primer proteinnya, untuk mencari
homologi dengan protein-PR yang telah diketahui fungsinya, 3) rnempelajari sifat-sifat enzimatik
protein tersebut. Di samping itu, untuk mengetahui peranan protein-PR pada klon H. brasifensis
yang resisten, maka sebagai studi perbandingan digunakan klon PR261 Ban RRIM 600 (resisten )
serta klon GTl (rentan) Ban satu klon LCB1320 (primer).
Untuk mengungkap adanya protein-PR, protein utama dalam organel-lutoid lateks segar diisolasi
Ban dimumikan dengan cara: sentrifugasi, pemecahan membran organel lutoid, presipitasi protein
dengan amonium sulfat, diikuti fraksionasi dengan kromatografi kolom: filtrasi gel, penukar kation
Ban anion, serta HPLC fasa terbalik. Sementara itu kemunian sampel protein diamati secara
ektroforesis gel SDS poliakrilamida (SDS-PAGE) menurut metode Laemmli.
Protein murni diidentifikasi dengan cara menentukan Beret ujung-N-nya dengan metode degradasi
Edman melalui penentu deret, atau peptida internalnya setelah proteinnya dipotong dengan CNBr
atau enzim tripsin, kemudian individu peptida dipisahkan dengan HPLC fasa terbalik. Selanjutaya
isolat peptidanya dipelajari secara spektrometri massa ESMS atau MALDI TOF.
Fungsi protein hasil pemurnian dari organel-lutoid lateks dapat diprediksi, dengan cara
membandingkan struktur primer parsialnya dengan protein yang telah diketahui fungsinya dari bank
data. Aktivitas kitinase dari protein murni ditemukan menurut metode Melchers, sedangkan β-1,3glukanasenya menurut metode Kauffmann. Sementara itu uji Aktvitas biologis protein murni diteliti
dengan uji inhibisi terhadap pertumbuhan fungi menurut metode Woloshuk.
Lima komponen protein utama dalam organel-lutoid lateks H. brasiliensis dapat diidentifikasi
secara SDS-PAGE, yaitu protein berbobot molekul: 5 kDa (hevein), 14 kDa, 19 kDa, 29 kDa
(hevamin) dan 35 kDa, sedangkan protein 25 kDa dan 43 kDa merupakan komponen minornya.
Protein 19 kDa dan 14 kDa dapat diisolasi dan dimurnikan secara simultan dengan
kromatografi
kolom karboksimetilselulosa gradien linier konsentrasi bufer borat yang meningkat pada pH 8,9.
Dari kajian lebih lanjut oleh Soedjanaatmadja menunjukkan bahwa protein 14 kDa merupakan
ujung-N dari prohevein, sedangkan protein 19 kDa adalah prohevein. Selain ditemukan kedua
komponen hevamin A dan B, juga ditemukan isoform hevamin ketiga yang disebut sebagai
hevamm X, dan terelusi dari kolom sebelum hevamin A dan B dengan kekuatan ion 600 pMhos,
sementara itu hevamin A dan B berturut- turut pada 1100 pMhos dan 1500 pMhos. Penentuan deret
asam amino ujung-N hevamin X, menunjukkan deret yang identik dengan hevamin A dan B, yaitu
Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-, namun titik isoelektriknya (9,3), yang berbeda dengan
hevamin A (9,9) dan B (10,5).
Untuk menelusuri perbedaan antara hevamin X dan hevamin A pada taraf asam amino, ditentukan
sidik jari (fingerprint) peptida hasil pemotongan hevamin X dan A dalam kondisi identik dengan
enzim tripsin dan diteliti dengan HPLC fasa terbalik, kemudian diikuti penentuan massa isolat
peptidanya secara spektrometri massa. Hasilnya menunjukkan bahwa pola peptida dari hevamin X
dan A adalah identik dan semua peptida yang diperkirakan dapat diidentifikasi dengan spektrometri
massa.
Dengan demikian perbedaan hevamin X dan A pada taraf asam amino tidak ditemukan.
Kemungkinan besar perbedaan kedua komponen disebabkan adanya pergantian Asp atau Glu
dengan Asn atau Gln, sebagai hasil mutasi alami atau deaminasi yang spesifik. Keadaan ini akan
menghasilkan perbedaan titik isoelektrik tetapi masssanya hampir sama, oleh karena itu
perbedaanya tidak akan terdeteksi dengan spektrometri massa.
Deret cDNA hevamin yang ditentukan Bokma menunjukkan bahwa hevamin di sintesis dengan
deret signal ujung-N, yang mengarahkan protein baru terbentuk ini ke retikulum endoplasma untuk
dieksresikan
(-Met-Ser-Ser-Ser-His-Val-Asp-↓Gly~Gly-Gly-IIe-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-,
signal sebelum tanda ↓), dan deret signal ujung-C pengarah ke vakuola telah dipecah pada protein
matang hasil isolasi dari organel-lutoid.
Inkubasi hevamin dengan kitin sebagai substrat menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin
memiliki Aktvitas spesifik kitinase yang sama. Namun inkubasi dengan substrat dinding sel hasil
preparasi dari Micrococcus lysodeikticus, menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin memiliki
aktivitas spesifik lisozim yang berbeda. Aktivitas lisozim dart hevamin memiliki pH optimum yang
sangat tajam (pH 4,9), sedangkan pH optimum kitinase sangat melebar pada kisaran pH 4 hingga
lebih tinggi pH 6. Aktivitas lisozim hanya dapat diamati pada konsentrasi garam yang rendah,
sedangkan aktivitas kitinase tidak banyak dipengaruhi oleh konsentrasi garam.
Protein 35 kDa telah dimurnikan dengan kromatografi kolom karboksimetil-selulosa gradien linier
konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer NaOAc pada pH 5,2. Analisis deret asam amino
protein ini menunjukkan ujung-N terebat. Setelah protein dipotong dengan CNBr dan dipisahkan
dengan HPLC fasa terbalik diperoleh suatu campuran peptida yang mengandung komponen utama
dan minor. Pencarian homologi dengan deret protein dari bank data menunjukkan bahwa peptida
utama dan minor adalah homolog dengan bagian ujung-C dan ujung-N deret yang dideduksi dari
cDNA β-1,3-glukanase H.brasiliensis, yang juga homolog dengan deret protein PR-2 (β-1,3glukanase) dari tanaman lain.
Hasil analisis deret dan spektrometri massa ESMS, diperoleh suatu informasi bahwa protein 35 kDa
adalah protein dengan bagian ujung-C yang tidak utuh, adanya komponen utama yang mengandung
ujung-C glisina, tetapi ada juga yang mengandung ujung-C alanina serta alanina-glutamat yaitu: Asn-Leu-Asn-Phe-Gly↓Ala↓Glu↓ dengan perbandingan 6:1:1. Selain itu, perbandingan deret asam
amino bagian ujung-C protein 35 kDa dengan deret yang dideduksi dari cDNA (-Asn-Leu-Asn-PheGly↓-Ala↓-Glu↓-Lys-Asn-Trp-Asp-Ile-Ser-Thr-GIu-His-),
menunjukkan
bahwa
protein
ini
merupakan protein organel-lutoid lateks. Kenyataan ini tampak di muka, pada deret asam amino
ujung-C dari cDNA masih ditemukan adanya ekstra peptida (huruf tebal) yang mengarahkan protein
ini menuju ke organel target yaitu organel-lutoid (C-terminal lutoid targeting signal).
Penentuan sifat enzimatik protein 35 kDa melalui inkubasi dengan oligo β-1,3-glukan sebagai
substrat menunjukkan bahwa protein 35 kDa memiliki aktivitas β-1,3glukanase. Pengujian aktivitas
biologisnya in vitro, menunjukkan bahwa tidak hanya hevamin tetapi juga protein 35 kDa memiki
aktivitas antifungal. Sementara itu analisis kandungan protein 35 kDa dan hevamin pada lutoid
lateks H. brasiliensis yang terinfeksi fungi patogen menunjukkan bahwa kedua protein disintesis
sebesar 1,5 dan 3 kali lebih tinggi dibandingkan dengan yang berasal dari lutoid lateks H.
brasiliensis yang sehat. Dengan ini dapat dinyatakan bahwa hevamin dan protein 35 kDa berperan
dalam pertahanan H. brasiliensis terhadap serangan patogen.
Protein 25 kDa telah dimurnikan dari organel lutoid lateks klon PR261 setelah presipitasi dengan
amonium sulfat pada kejenuhan 50-l00%, kemudian kromatografi kolom karboksimetilselulosa
dengan gradien limier konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer Tris--HCI pada pH 8, dikuti
dengan HPLC fasa terbalik elusi gradien linier asetonitril 0-70% dalam 0,1% TFA dengan kolom
aukleosil C18 Sementara itu protein amonik 43 kDa telah dimurnikan dengan kolom penukar anion
dietilaminoetil dengan gradien konsentrasi linier NaCl yang meningkat dalam bufer Tris HCI, pH 8,
dan dilanjutkan rekromatografi dengan kolom fltrasi gel Sephadex G 75.
Analisis deret parsial ujung N protein 25 kDa dan peptida CNBr protein menunjukkan homologi
dengan protein antifungal mirip-taumatin yang berasal dan Nicotinia tabacum, juga homolog
dengan deret protein PR-5 dari tanaman lain. Analisis deret ujung-N protein 43 kDa menunjukkan
ujung-N terebat. Setelah dipotong dengan CNBr dan dipisahkan HPLC fasa terbalik diperoleh
peptida campuran. Deret ujung-N suatu peptida CNBr pendek internal menunjukkan homologi
dengan patatin, suatu protein yang memiliki aktivitas palmitat asilase dari Solarium tuberosum, dan
identik dengan alerge lateks hev b 7, suatu protein yang diisolasi dari C-serum (sitoplasma) lateks
karet.
Sebagai tambahan pada protein 25 kDa mirip-taumatin, ditemukan protein lain dengan bobot
molekul yang sama telah diisolasi dari organel-lutoid dengan menggunakan prosedur yang sama
untuk isolasi protein 25 kDa mine-taumatin. Analisis deret dan spektrometri massa peptida CNBr
yang diperoleh dari protein ini menunjukkan keidentikan dengan protein pengikat-sitrat dari lateks
H. brasiliensis yang telah ditemukan deret cDNA-nya oleh Rentsch. Demikian juga deret signal
ujung-N dan ujung-C tidak ditemukan lagi pada protein 25 kDa matang.
Dad kajian perbandingan klon H.brasifensis yang diteliti ditemukan adanya perbedaan: protein 25
kDa mirip-taumatin antifungal hanya ditemukan pada klon yang resisten (PR261 dan RRIM600)
dan tidak ditemukan pada klon yang rentan (GT1). Ditemukan pula perbedaan β-1,3--glukanase
diantara klon PR261 dan GTI. Bobot molekul enzim ini pads klon GTI lebih tinggi, kemungkinan
besar disebabkan oleh glikosilasi. Pada ujung-C peptida CNBr ditemukan dua deret asam amino
yang berbeda diantara β-1,3-glukanase dari klon PR261 dan GTI, yaitu pada posisi 306 (Asn), dan
316 (Ser). Demikian juga aktivitas spesifik β-1,3-glukanase dari kedua klon berbeda, aktivitas
spesifk dari klon GTI tiga kali lebih rendah dibandingkan klon PR261.
PATHOGENESIS-RELATED PROTEINS FROM HEVEA
BRASILIENSIS MUELL ARG
(ISOLATION, STRUCTURE AND FUNCTION)
Indonesia is one of the largest exporters of natural rubber next to Thailand. Efforts to increase crop
production tends to be retarded by pests, especially by fungal infection. A way to overcome this
problem is the application of synthetic fungicides, but to some extent they have a negative
environmental impact, and even are agrochemically costly. Therefore an alternative for fungal
disease control is necessary, which is more efficient and environmentally safe.
A new strategy for control of fungal diseases is to transfer the resistance genes to the genome of the
same or different species (transgenic plants). To isolate and identify a resistance gene, one needs
information of part of the primary structure of the protein. Given the amino acid sequence, the
genetic code can be used to design an oligonucleotide probe of DNA that base-pairs with the gene
or cDNA coding for that sequence. So, information on a specific protein which plays a role in
resistance is essential for the isolation and identification of its encoding gene. Beside that, we also
need an assay of the biological activity of a native protein to know which posttranslational
modifications of the protein have occurred.
Information regarding pathogenesis-related protein from Hevea brasiliensis, especially from clones
of this species, which are more resistance against infection is rather incomplete. Investigations
regarding pathogenesis-related proteins (PRproteins) reveal that the plant synthesizes PR-proteins
when infected by pathogens. Functional PR proteins are chitinase and β-1,3-giucanase. These
enzymes catalyze the hydrolysis of polysaccharides that represent major components of many fungi
cell walls and therefore both enzymes have been suggested to be involved in protecting plant
against fungal pathogens. Such function is supported by the absence of chitin from higher plants
and indeed, chitinase and 1,3-β-glucanase can degrade isolated cell walls and have been shown to
efficiently restrict growth of several fungi in vitro. Also chitinase and 1,3-β-giucanase can restrict
growth of microbial pathogens in vivo (transgenic plant).
This research was conducted to study. 1) isolation and identification of major proteins in the lutoid
body fraction of H. brasiliensis latex, 2) structural characterization of these proteins by
determination of part of the primary structure and looking for the homologies with other PR-protein
of known function, 3) study of the enzymatic properties and biological activity. Besides that, to
know more about the role of PR proteins in H. brasiliensis resistant clones, a comparative study of
PR 261 and RRIM 600 (resistant) GTI (susceptible) and LCB 1320 (primer) clones was made.
To investigate the presence of these PR- proteins, the major lutoid proteins from fresh latex were
isolated and purified by means of centrifugation, freezing thawing, precipitation by using
ammonium sulfate, followed by fractionation using gel filtration, anionic and cation exchange
chromatography and reversed-phase HPLC. The purities of the proteins was monitored by SDS
PAGE according to Laemmli.
The purified proteins were identified by determination of amino acid sequences at their N-termini
by Edman degradation with a sequenator or of internal peptides, which were obtained by CNBr or
tryptic digestion and which were separated by reversed-phase HPLC. Isolated peptides were also
investigated by mass spectrometry ESMS or MALDI TOF and amino acid analysis.
The function of these proteins isolated from lutoid bodies could be predicted by comparison of their
partial primary structures with those of proteins of known function in data banks. The chitinase
activity of purified protein was determined according to Melchers, while the β-1,3-glucanase
activity was determined according to Kauffmann. The biological activity of the purified protein was
investigated by testing in vitro the lytic affect on fungi according to Waloshuk.
Five major protein in the lutoid bodies of H. brasiliensis have been identified by SDSPAGE, these
are: 5 kDa (hevein), 14 kDa, 19 kDa, 29 kDa (hevamine) and 35 kDa, while two proteins of 25 kDa
and 43 kDa are minor components.
The protein of 19 kDa and 14 kDa could be isolated and purified simultaneously by CM-cellulose
column chromatography with a linear gradient of increasing concentration of borate buffer of pH
8,9. Further studies of both proteins showed that the protein of 19 kDa is the precursor of hevein
(prohevein) and the protein of 14 kDa is the C-terminal domain of prohevein. It has also been found
that besides the two hevamine componen A and B a third isoform occurs which is called hevamine
X and which was eluted from the column before hevamine A and B at ionic strength at 600 µMhos,
while hevamine A and B elute at 1100 µMhos and 1500 µMhos, respectively. Determination of the
N-terminal amino acid sequences of hevamine X showed that it is identical to hevamine A dan B,
that is: Gly-Gly-IIe-Ala-Ile-Tyr:Trp-Gly-Gln-Asn however the isolectric point of hevamine X was
found to be is 9.3 which is different from those of hevamine A (9.9) and B (10.5).
To investigate a difference at the amino acid sequence level between hevamine X and A, fingerprint
of tryptic digests of identical quantities of the two protein were made and investigated by reversed
phase HPLC, followed by mass spectrometry of the isolated peptides. The result showed that the
patterns of two digests are identical and all expected tryptic peptides could be identified by mass
spectrometry. So the difference between hevamine A and X at the amino acid level could not be
found. It may be that both hevamine components differn in e.g. Asp or Glu instead of Asn or Gln,
as a result of a natural mutation or of specific deamidation. This will result in different isoelectric
points, but almost identical masses. Therefore such a difference will not be detected by mass
spectrometry.
The cDNA sequence of hevamine has been determined by Bokma. This sequence shows that the
protein is synthesized with an N-terminal signal sequence, which directs the nascent protein to the
endoplasmic reticulum for excretion (-Met-SerSer-Ser-His-Val-Asp-Gly-↓Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-TyrTrp-Gly-Gln-Asn-, signal before the ↓ symbol) and putative C-terminal vacuolar targeting signal
sequence which are cleaved off in the mature protein isolated from lutoid bodies.
Incubation of hevamine with chitin as substrate showed that the three isoforms have equal chitinase
specific activities. However incubation with a Micrococcus lysodeikticus cell wall preparation
showed that the three isoforms hevamine have different lysozyme specific activities. The lysozyme
activity of hevamine has a sharp optimum at pH 4.9, while the chitinase activity extends over a
much broader range and extends from pH 4 to higher than pH 6. Lysozyme activity can be observed
only at low salt concentrations, while the chitinase activity is much less dependent on salt
concentration.
The protein of 35 kDa has been purified by CM-cellulose column chromatography with a linear
gradient of NaCl in acetate buffer of pH 5,2. Sequence analysis indicated a blocked N-terminus.
After cleavage with CNBr and reversed-phase HPLC, a peptide mixture consisting of a major and a
minor component was obtained. A homology search with protein sequences in data banks showed
the major and minor peptides are identical with the C-terminal part and a more N-terminally located
part of the cDNA derived sequence of β-1,3-glucanase of H. brasiliensis, which also show
homology with sequenced PR-2 proteins (β-1,3-glucanase) from other plants.
However, the result from the Electro Spray Mass Spectrometry analysis showed that 35 kDa protein
has a ragged C-terminal sequence. There are several components with different variation at the Cterminal position. These are components which have Cterminal Gly, Ala, and Glu as follow: -AsnLeu-Asn-Phe-Gly↓-Ala↓-Glu↓-Lys-Asn-Trp-Asp-Ile-Ser-Thr-Glu-His-, in the ratio of about 6:1:1.
Comparison of amino acid sequences of the C-terminal part with that derived from CDNA howed
that the 35 kDa protein a vacuolar-lutoid protein, which is targeted to this cell organelle by a Cterminal fragment which is cleaved off postranslationally. The evidence for this process is obtained
by comparing the C-terminal sequence of the protein with that derived from cDNA (boldface).
The enzymatic activity of the 35 kDa protein was determined by incubation with oligo-β-1,3-glucan
as a substrate, showing that it has β-1,3-glucanase activity. Further studies of biological activity in
vitro, had shown that not only hevamine but also β-1,3-glucanase has an antifungal activity.
Analysis of the contents of β-1,3-glucanase and hevamine in the lutoid body fraction of latex of
fungal inflected H. brasiliensis showed that both proteins were synthesized 1,5 and 3 fold higher
than in healthy trees. Therefore the function of hevamine and β-1,3-glucanase may be a defense of
H. brasiliensis against invading pathogen.
A protein of 25 kDa has been purified from the lutoid-bodies of latex of clone PR 261 after
ammonium sulfate fractionation at 50-100% saturation, followed by CMC cation exchange column
chromatography with a linear gradient of NaCI in Tris-HCI buffer at pH 8,0, and by reverse phase
HPLC on a nucleosil 10 C18 column with a linear gradient of 0-70% acetonitril in 0,1% CF3COOH.
An anionic protein of 43 kDa has been purified by diethylaminoethyl anionic exchanger column
chromatography with a linear gadient of NaCI in Tris-HCI buffer at pH 8,0, followed by Sephadex
G 75 gel filtration column chromatography.
Sequence analysis of the N-terminal part of the 25 kDa protein and a CNBr peptide of this protein
indicated that it is homologous with the thaumatin-like antifimgal protein from Niconnia tabacum,
and with other members of the family PR-5 proteins. Sequence analysis of the N-terminus of the 43
kDa protein indicated a blocked N-terminus. Alter cleavage with CNBr and reversed-phase HPLC,
a peptide mixture was obtained. N-terminal sequence analysis of a short internal CNBr peptide
showed that it is homologous with patatin, a protein with palmitate acylase activity from Solanum
tuberosum and identical with latex allergen hev b 7, a protein isolated from the C-serum
(cytoplasma) of rubber latex.
In addition to the thaumatin-like protein of 25 kDa, another protein of this size was isolated from
the lutoid-body fraction using a similar procedure as used to isolate the thaumatin-like protein of 25
kDa. Sequence analysis and mass spectrometry of CNBr petides obtained from this protein showed
that it is identical to the citrate binding protein from latex H. brasiliensis, already sequenced as
cDNA by Rentsch. But also in this protein the N-terminal signal and C-terminal vacuolar peptides
targeting are not present anymore in the mature protein.
There are differences between the investigated rubber clones: The antifungal thaumatin-like 25 kDa
was only found in the fungal-resistant clone (PR261 and RRIM600) and not in the susceptible one
GTI. There are also differences between p1,3-glucanase of clone PR261 dan GTI. The apparent
molecular mass of this enzyme in clone GT I larger, Probably caused by glycosylation. In the Cterminal CNBr peptide two amino acid sequence differences were found between P-glucanases
from clones PR261 and GTI at positions 306 (Asn), and 316 (Ser). Also the specific activities of the
enzymes from both clones were different, with a three times lower activity of the enzyme from
clone GTI than from clone PR261.