EFEK EKSTRAK KAYU MANIS (Cinnamomum
advertisement
EFEK EKSTRAK KAYU MANIS (Cinnamomum cassia) TERHADAP INDEKS APOPTOSIS SEL JANTUNG PADA TIKUS JANTAN DIABETES MELITUS: STUDI AWAL Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN OLEH : HAIDAROTUL MILLA NIM: 1113103000069 PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2016 M /1437 H KATA PENGANTAR Assalamualaikum wr.wb. Puji serta syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas segala rahmat dan karunia-Nya saya dapat menyelesaikan penelitian ini. Shalawat serta salam semoga tetap tercurah limpahkan pada Nabi besar Muhammad SAW, beserta keluarganya, sahabatnya, serta umatnya. Alhamdulillahi rabbil alamin, penelitian ini telah selesai, da akan sulit terselesaikan jika tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, saya mengucapkan banyak terima kasih kepada: 1. DR. Arif Sumantri S.K.M., M. Kes selaku Dekan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang selalu membimbing dan memberikan kesempatan kepada saya untuk menempuh pendidikan di Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. dr.Achmad Zaki, M. Epid, Sp. OT selaku Ketua Program Studi Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, serta seluruh dosen di prodi ini yang selalu membimbing serta memberikan ilmu kepada saya selama menjalani masa pendidikan di Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. dr. Flori Ratna Sari, Ph.D dan dr. Hari Hendarto, Sp.PD, Ph.D, FINASIM. selaku dosen pembimbing penelitian saya, yang selalu membimbing dan mengarahkan dalam berjalannya penelitian ini. 4. Kedua orang tua tercinta H. Machfudz Shidiq dan Hj. Musdalifah Noor yang selalu memberikan doa dan semangat kepada saya. Dan untuk seluruh keluarga besar yang senantiasa membuat saya bersemangat dalam menjalani proses pembelajaran di Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 5. dr.Flori Ratna Sari, Ph.D selaku penanggungjawab (PJ) modul riset PSPD 2013, drg. Laifa Annisa Hendarmin, PhD selaku PJ laboratorium Riset, Ibu Nurlaely Mida R. S.Si. M.Biomed. DMS selaku PJ laboratotium Animal house, Rr. Ayu Fitri Hapsari, M. Biomed, selaku PJ laboraturium histologi, Dr. Endah Wulandari, M.Biomed selaku PJ v laboratorium Biokimia, dr.Nurul Hiedayati, Ph.D. selaku PJ Laboratorim Farmakologi yang telah memberikan izin atas penggunaan lab pada penelitian ini. 6. Untuk teman seperjuangan penelitian saya, Ahmad Fahmi Zamzami, Salsabila Firdausi, Hazrina Julia, dan Fahmi Fahrur Rozi. 7. Seluruh mahasiswa PSPD 2013 yang terus semangat dalam menimba ilmu di UIN Syarif Hidayatullah. 8. Laboran yang terlibat Mba Ai, Mba Suryani, Mas Rachmadi, Mba Din. Juga pada Mas Haris, Mas Panji yang sangat membantu berlangsungnya penelitian ini. 9. Kak Nita Fitriani, senior dari Program Studi Farmasi 2012 yang telah membantu saya dalam mengolah data. 10. Dan semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu. Saya menyadari laporan penelitian ini masih jauh dari kesempurnaan. Kritik dan saran yang membangun dari semua pihak sangat saya harapkan demi kesempurnaan laporan penelitian ini. Demikian laporan penelitian ini saya tulis, semoga dapat memberikan manfaat bagi penulis khususnya dan para pembaca pada umumnya. Ciputat, 29 Juni 2016 Penulis vi ABSTRAK Haidarotul Milla. Program Studi Pendidikan Dokter. Efek Ekstrak Kulit Kayu Manis (Cinnamomum cassia) terhadap Indeks Apoptosis Sel Jantung pada Tikus Jantan Diabetes Melitus: Studi Awal. 2016. Diabetes mellitus merupakan penyakit metabolik yang disebabkan oleh ketidakmampuan sel β pankreas memproduksi insulin dalam jumlah yang cukup atau tubuh tidak mampu memproduksi insulin secara efektif sehingga penyakit ini ditandai dengan peningkatan glukosa darah atau dikenal sebagai hiperglikemia. Keadaan hiperglikemia kronik menyebabkan beberapa komplikasi termasuk diantaranya kardiomipati diabetik. Penelitian sebelumnya kayu manis (Cinnamomum cassia) dilaporkan memiliki efek hipoglikemik dan antioksidan yang dapat memperbaiki kerusakan sel jantung pada kultur sel. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek ekstrak kayu manis dengan dosis 200 mg/kgBB/hari per oral selama 28 hari terhadap indeks apoptosis sel jantung pada tikus jantan diabetes melitus. Penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna pada indeks apoptosis sel jantung dengan pemberian kayu manis dibandingkan dengan kelompok kontrol (p < 0,05). Dapat disimpulkan bahwa kayu manis mempunyai efek antioksidan yang dapat memperbaiki kerusakan sel jantung akibat keadaan hiperglikemia kronik pada diabetes mellitus. Kata kunci : Kayu manis, diabetes mellitus, apoptosis sel jantung, tikus. ABSTRACT Haidarotul Milla. Medical Education Study Program. Effect of Cinnamon Bark Extract (Cinnamomum cassia) on Cardiac Cell Apoptotic Index in diabetic rats: Preliminary Study. 2016 Diabetes Melitus is a metabolic disease arising from insulin deficiency or ineffectiveness of the insulin produced by the body. DM characterized by elevated blood glucose may as known hyperglycemia. The chronic hyperglycemia state causes several complications including diabetic cardiomyopathy. The previous study has reported that cinnamon barks (Cinnamomum cassia) improves the cardiac cell destruction in cell culture. This study determine the effects of oral administration of cinnamon extract in a dose of 200 mg/kg body weight for 28 days on cardiac cell apoptotic index in STZ induced diabetic rats. Our result have shown that cinnamon extract has reduced cardiac cell apoptotic index significantly compared to the control group (p < 0,05). It is concluded that cinnamon extract has antioxidant effects which may improves the cardiac cell apoptotic in diabetes mellitus. Keyword: Cinnamon bark, diabetes mellitus, cardiac cell apoptotic, rats. vii DAFTAR ISI LEMBAR JUDUL .......................................................................................... i LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...................................... ii LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................. iii LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................... iv KATA PENGANTAR .................................................................................... v ABSTRAK ...................................................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................... viii DAFTAR TABEL .......................................................................................... x DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... x DAFTAR GRAFIK ........................................................................................ x DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. x DAFTAR SINGKATAN ................................................................................ xi BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah............................................................................. 3 1.3 Tujuan Penelitian. ............................................................................. 4 1.3.1 Tujuan Umum ................................................................... 4 1.3.2 Tujuan Khusus................................................................... 4 1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 4 1.4.1 Bagi Peneliti ...................................................................... 4 1.4.2 Bagi Institusi ..................................................................... 4 1.4.3 Bagi Masyarakat ................................................................ 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 5 2.1 Tinjauan Pustaka Diabetes Melitus (DM) ....................................... 5 2.1.1 Definisi DM ....................................................................... 5 2.1.2 Klasifikasi DM .................................................................. 7 2.1.3 Fisiologi Pankreas dan Insulin .......................................... 8 2.1.4 Patogenesis dan Patofisiologi DM .................................... 9 2.1.5 Diagnosis DM.................................................................... 10 2.1.6 Tatalaksan DM .................................................................. 11 2.1.6.1 Terapi Gizi Medis .................................................. 11 2.1.6.2 Latihan Jasmani ..................................................... 11 2.1.6.3 Terapi Farmakologi ............................................... 11 2.1.7 Komplikasi DM ................................................................. 12 2.1.7.1 Komplikasi Metabolik Akut .................................. 12 2.1.7.2 Komplikasi Kronik Jangka Panjang ...................... 13 2.1.7.3 Kardiomiopati Diabetik (DCM) ............................ 15 2.1.7.3.1 Patofisiologi DCM .................................. 16 2.2 Tinjauan Kayu Manis(Cinnamomum cassia) .................................. 17 2.2.1 Kayu Manis (Cinnammomum cassia) ............................... 17 2.2.2 Kandungan Kimia dalam Kayu manis............................... 19 2.3 Streptozotosin(STZ) ........................................................................ 20 viii 2.3.1 Definisi STZ ..................................................................... 20 2.3.2 Struktur dan mekanisme kerja STZ .................................. 20 2.3.3 Dosis STZ ......................................................................... 22 2.4 Pewarnaan Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) deteksi apoptosis sel ........................... 23 2.5 Kerangka Konsep ............................................................................ 25 2.6 Definisi Operasional ........................................................................ 26 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................. 27 3.1 Desain Penelitian ............................................................................. 27 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian ......................................................... 27 3.2.1 Waktu Penelitian ............................................................. 27 3.2.2 Tempat Penelitian ........................................................... 27 3.3 Populasi dan Sampel Penelitian....................................................... 27 3.3.1 Kriteria Inklusi ................................................................ 28 3.3.2 Kriteria Eksklusi ............................................................. 29 3.4 Cara Kerja Penelitian ....................................................................... 29 3.4.1 Alat Penelitian ................................................................. 29 3.4.2 Bahan Penelitian ............................................................. 29 3.4.3 Adaptasi Hewan Sampel ................................................. 30 3.4.4 Induksi Streptozotocin (STZ).......................................... 30 3.4.5 Pemberian Ekstrak Kayu Manis terhadap Tikus ............. 30 3.4.6 Tahap Sacrifice (Pembedahan) ....................................... 30 3.4.7 Tahap Pewarnaan TUNEL .............................................. 31 3.4.7.1 Deparafinisasi ................................................... 31 3.4.7.2 Proses Enzimatik............................................... 31 3.4.7.3 Proses Inaktivasi Endogen Peroksida ............... 32 3.4.7.4 Proses Labeling ................................................. 32 3.4.7.5 Proses Reaksi Antibodi ..................................... 32 3.4.7.6 Proses Pengembangan Warna ........................... 32 3.4.7.7 Proses Counterstaining ..................................... 33 3.4.7.8 Proses Dehidrasi Preparat ................................. 33 3.4.7.9 Fiksasi Preparat ................................................. 33 3.5 Pengamatan Jaringan ....................................................................... 33 3.6 Pengolahan Analisa dan Analisa Data ............................................. 33 3.7 Alur Penelitian ................................................................................. 35 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 36 4.1 Hasil dan Pembahasan .................................................................... 36 4.2 Keterbatasan Penelitian ................................................................... 41 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 42 5.1 Kesimpulan ...................................................................................... 42 5.2 Saran ................................................................................................ 42 BAB VI KERJASAMA PENELITIAN ........................................................ 43 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 44 LAMPIRAN .................................................................................................... 49 ix DAFTAR TABEL Tabel 2.1 Konsensus Pengendalian dan Pencegahan DM di Indonesia ........... 5 Tabel 2.2 Kriteria diagnosis DM...................................................................... 10 Tabel 4.1 Rata-rata dan standar deviasi glukosa darah tikus setiap kelompok penelitian ........................................................................................ 36 Tabel 4.2 Hasil analisis Uji Oneway Annova ................................................... 38 Tabel 4.3 Hasil analisis Uji Post-hoc LSD ....................................................... 38 DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Sel-sel Pulau Langerhans Pankreas .............................................. 7 Gambar 2.2 Skematik Reseptor Insulin ........................................................... 8 Gambar 2.3 Mekanisme Stress Oksidatif Menginduksi Apoptosis Sel ........... 17 Gambar 2.4 Tanaman Kayu Manis (C. cassia) ................................................ 18 Gambar 2.5 Struktur Kimia Cinnamaldehid .................................................... 19 Gambar 2.6 Struktur Kimia STZ...................................................................... 21 Gambar 2.7 Skematik Uptake Selektif STZ pada Sel β Pankreas ................... 22 Gambar 4.1 Hasil pewarnaan TUNEL perbesaran 20x ............................................. 39 Gambar 7.1 Hasil Determinasi Tanaman ......................................................... 49 Gamber 7.2 Surat Keterangan Tikus Sehat ...................................................... 50 Gambar 7.3 Proses Inkubasi............................................................................. 54 Gambar 7.4 Proses Labeling ........................................................................... 54 Gambar 7.5 Proses Pencampuran Reagen ........................................................ 54 Gambar 7.6 Proses Deparafinisasi ................................................................... 54 Gambar 7.7 Proses Homogen PBS................................................................... 55 Gambar 7.8 Proses Covering............................................................................ 55 Gambar 7.9 Proses Pengeringan Preparat ........................................................ 55 Gambar 7.10 Proses Sterilisasi Alat ................................................................. 55 Gambar 7.11 Proses Penataan Preparat ............................................................ 55 Gambar 7.12 Proses Fiksasi Preparat ............................................................... 55 DAFTAR GRAFIK Grafik 4.1 Rerata persentase jumlah apoptosis sel jantung pada semua kelompok penelitian ........................................................................ 36 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Hasil Determinasi/ Identifikasi Bahan Uji. .................................. 49 Lampiran 2. Surat Keterangan Tikus Sehat ..................................................... 50 Lampiran 3. Gambar Proses Penelitian ............................................................ 51 Lampiran 4. Riwayat Penulis ........................................................................... 53 x DAFTAR SINGKATAN ADA AGEs Ang-2 cAMP Cc CTGF D Depkes DM DNA EDTA GDM GDPT GDS GFAT GLUT GSH HPLC ICAM-1 IDDM IDF IPB IRS KAD Kemenkes kgBB MHCP mg/dL mg/kgBB mL MLD-STZ N NGSP NIDDM n NO O-GlcNAc OHO PAI : American Diabetes Association : Advanced Glycation End Products : Angiopoietin 2 : cyclic Adenosine Mono Phosphate : Cinnamomum cassia : Connective Tissue Growth Factor : Diabetes : Departemen Kesehatan : Diabetes Melitus : Deoxybonucleic Acid : Ethylen Diamine Tetraacetic Acid : Gestational Diabetes Mellitus : Glukosa Darah Puasa Terganggu : Gula Darah Sewaktu : Glutamine Fructose 6-Phosphate Amidotransferase : Glucosa Transporter : Glutathione : High-perfomance Liquid Chromatography : Intracellular Adhesion Molecule-1 : Insulin-dependent Diabetes Melitus : Internasional Diabetes Federation : Institute Pertanian Bogor : Insulin Reseptor Substrate : Ketoasidosis Diabetik : Kementrian Kesehatan : kilogram Berat Badan : Methyl Hidroxy Chalcone Polymer : miligram per desiliter : miligram per kilogram Berat Badan : mili Liter : Multiple Low Dose Streptozotocin : Normal : National Glycohaemoglobin Standarization Program : Noninsulin-dependent Diabetes Melitus : Sampel : Nitrit Oxide : O-linked N-acetylglucosamine : Obat Antihiperglikemik Oral : Plasminogen Activator Inhibitor xi PARP PERKENI PKC RAGE ROS SD SERCA2α STZ TG TGT TUNEL VCAM : Poly-ADP Ribose Polimerase : Perkumpulan Endokrinologi Indonesia : Protein Kinase C : Reseptor AGEs : Reactive Oxygen Species : Standar Deviasi : Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ Atpase 2α : Streptozotosin : Trigliserida : Toleransi Glukosa Terganggu : TdT-mediated dUTP-biotin Nick end Labeling : Vascular Cell Adhesion Molecule xii BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit gangguan metabolisme glukosa dalam tubuh yang mempunyai karakteristik hiperglikemia kronik akibat dari kerusakan pada sekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya. Klasifikasi DM menurut American Diabetes Association (ADA) yaitu diabetes tipe 1, diabetes tipe 2, diabetes tipe lain dan diabetes gestasional. Pasien diabetes sering tidak menunjukkan gejala terutama pada diabetes tipe 2.1 Umumnya penderita DM disertai gejala poliuria, polidipsia, polifagia, dan penurunan berat badan. Diabetes yang tidak terkontrol dapat menyebabkan kematian, karena terjadi komplikasi seperti ketoasidosis ataupun sindrom hiperosmolar nonketotik.2 Jumlah angka kejadian DM semakin meningkat tiap tahunnya dan menjadi masalah kesehatan diseluruh dunia. International Diabetes Federation (IDF) memperhitungkan ditahun 2013 penderita diabetes didunia mencapai 382 juta dengan 46% tidak terdiagnosis, sedangkan pembaharuan perhitungan pada tahun 2014 penderita DM didunia telah meningkat dengan 387 juta penderita DM dengan 46,3% tidak terdiagnosis.3 Mayoritas 387 juta orang dengan diabetes ini berusia antara 40-59 tahun yang merupakan usia produktif, dan 80% dari mereka tinggal di negara-negara yang berpenghasilan rendah dan menengah. Lebih dari 138 juta orang dengan DM, daerah Pasifik Barat memiliki lebih banyak memiliki penderita DM dibanding daerah lain. Dalam hal ini beban diabetes sangat besar, yang memprovokasi 5,1 juta kematian dan mengambil sekitar 548 milliar USD untuk pengeluaran kesehatan penduduknya (11% dari total pengeluaran seluruh dunia) pada tahun 2013.3 Jumlah peningkatan kejadiannya terjadi pada semua jenis diabetes, khususnya diabetes tipe 2, dan menurut prediksi jumlah orang dengan diabetes akan terus meningkat menjadi sekitar 592 juta (55%) pada tahun 2035.3 1 Indonesia adalah salah satu dari 10 negara yang mempunyai angka penderita diabetes terbesar.4 Jumlah prevalensi penderita diabetes pada usia produktif (18-55 tahun) berdasarkan hasil Riskesdas 2013 yaitu sekitar 6,9% (12.2 juta orang) terdiagnosis diabetes, 29,9% (58,3 juta orang) mengalami toleransi glukosa terganggu, dan 36,6% (64,6 juta orang) mengalami gula darah puasa terganggu. Sedangkan prevalensi diabetes yang terdiagnosis oleh dokter, urutan tertinggi terdapat di Yogyakarta (2,6%), DKI Jakarta (2,5%), Sulawesi Utara (2,4%) dan Kalimantan Timur (2,3%).5 Diabetes lebih banyak terjadi pada perempuan dibandingkan laki-laki dengan usia yang meningkat, dan pada keadaan sosio-ekonomi yang sedang sampai tinggi.4 Pada DM yang tidak terkontrol dapat menimbulkan komplikasi pada sistem kardiovaskular salah satunya adalah kardiomiopati. Kardiomiopati diabetik (DCM) ini sering tidak memperlihatkan manifestasi yang jelas. Kardiomiopati diabetik terjadi karena adanya kematian sel jantung yang diinduksi oleh hiperglikemia kronik yang menyebabkan terjadinya stress oksidatif yang melebihi keseimbangan antara pro-oksidan dan oksidan.6,7 Hiperglikemia, hiperlipidemia, hipertensi, dan inflamasi dapat menginduksi peningkatan stress oksidatif yang mengakibatkan ekspresi gen yang abnormal, perubahan transduksi sinyal dan akhirnya mengaktivasi jalur apoptosis sel.8 Apoptosis sel jantung ini akan menyebabkan penurunan kontraktilitas jantung sehingga akan terjadi kompensasi hipertrofi sel miokardial dan perbaikan fibrosis (reparative fibrosis) yang akan menjadi faktor resiko terjadinya kematian.6 Dewasa ini banyak digunakannya terapi medik herbal yang telah berkembang dengan pesat, bermanfaat dan dapat dipertanggungjawabkan keamanannya. Dalam kasus DM ini, banyak literatur menunjukkan beberapa spesies tanaman memiliki efektivitas dalam menurunkan kadar gula darah, dengan sedikit efek samping, dengan harga yang lebih murah dari pada obat konvensional yang biasa digunakan.9 Beberapa penelitian memperlihatkan adanya penggunaan tanaman herbal sebagai agen antidiabetik dan antioksidan, yang dapat membantu 2 mengontrol adanya peningkatan stress oksidatif pada keadaan DM dengan menurunkan kadar gula darah.6 Salah satunya adalah kayu manis yang merupakan salah satu rempah-rempah yang paling banyak digunakan dalam dunia industri makanan dan minuman. Menurut penelitian Chan et al. 2012, ekstrak kayu manis memiliki kandungan flavonoid dan polifenol yang cukup tinggi sebagai efek antioksidan yang dapat digunakan untuk memperbaiki sel tubuh dan mengobati berbagai kondisi penyakit termasuk diabetes.10 Pada penelititian Elobeid et al. 2013, menggunakan ekstrak kayu manis (Cinnamomum cassia) dalam waktu 6 minggu dengan dosis 200 mg/kgBB dan 400 mg/kgBB memperlihatkan kedua dosis tersebut memberikan efek antihiperglikemik pada tikus jantan Wistar yang diinduksi Streptozotozin.11 Penelitian tersebut membuktikan efek antioksidan pada ekstrak kayu manis yang dapat memperbaiki sel beta pankreas yang mengalami kerusakan akibat adanya peningkatan stress oksidatif pada DM sehingga memperbaiki keadaan hiperglikemia dan kemudian akan mencegah terbentuknya radikal bebas yang dapat menginduksi apoptosis pada sel jantung yang terjadi pada kardiomiopati diabetik.11 Dari latar belakang diatas, peneliti merasa perlu melakukan penelitian terhadap Cinnamomun cassia ini dengan dosis 200 mg/kgBB pada tikus selama 28 hari untuk melihat dan membutikan potensi dari C. cassia sebagai agen antioksidan dapat mencegah apoptosis sel jantung karena adanya peningkatan radikal bebas pada keadaan DM, pada tikus Sprague dawley yang diinduksi Streptozotocin. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang, dapat dirumuskan masalah pada penelitian ini adalah Apakah ekstrak kayu manis Cinnamomum cassia dapat menurunkan indeks apoptosis sel jantung tikus jantan diabetes melitus? 3 1.3 Tujuan Penelitian 1.1.1 Tujuan Umum Mengetahui efek pemberian ekstrak kayu manis terhadap indeks apoptosis sel jantung pada tikus diabetes melitus. 1.1.2 Tujuan Khusus Mengetahui efek pemberian ekstrak kayu manis dalam waktu 28 hari dengan dosis 200 mg/kgBB secara oral terhadap indeks apoptosis sel jantung pada tikus diabetes melitus. 1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Bagi Peneliti a. Memperoleh tambahan keilmuan dibidang penelitian dengan desain eksperimental b. Mendapat pengetahuan mengenai potensi tanaman herbal yang memiliki efek anti apoptotik pada sel jantung. c. Sebagai salah satu syarat mendapat gelar sarjana kedokteran fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 1.4.2 Bagi Institusi Dapat menambah referensi penelitian di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 1.4.3 Bagi Masyarakat Sebagai informasi bagi masyarakat akan manfaat efek ekstrak kayu manis Cinnamomum cassia dengan dosis 200 mg/kgBB/hari yang diberikan selama 28 hari terhadap indeks apoptosis sel jantung pada diabetes melitus. 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Diabetes Mellitus (DM) 2.1.1 Definisi DM Diabetes Melitus menurut American Diabetes Association (ADA) tahun 2013 adalah kelompok penyakit metabolik dengan ditandai peningkatan glukosa dalam darah (hiperglikemia) yang terjadi karena kelainan sekresi insulin, kerja insulin yang tidak adekuat, atau keduanya.12 2.1.2 Klasifikasi DM Klasifikasi DM berdasarkan American Diabetes Association (ADA) membagi DM menurut etiologinya menjadi 4 jenis yaitu diabetes melitus tipe 1, diabetes melitus tipe 2, diabetes melitus tipe lain, dan Diabetes Melitus gestational.12 Indonesia sendiri mengklasifikasikan DM juga berpedoman pada American Diabetes Association (ADA) yang ditetapkan pada PERKENI 2015.13 Klasifikasi etiologis DM (4 tipe): No. 1. Tipe DM DM tipe 1 Destruksi sel , umumnya menjurus ke defisiensi insulin absolut 2. DM tipe 2 Autoimun Idiopatik Dominan resistensi insulin disertai defisiensi insulin relatif Dominan defek sekresi insulin disertai resistensi insulin 3. DM tipe lain Defek genetik fungsi sel Defek genetik kerja insulin 5 Penyakit eksokrin pankreas Endokrinopati Karena obat atau zat kimia Infeksi Sebab imunologi yang jarang Sindrom genetik lain yang berhubungan dengan DM 4. DM gestasional Tabel 2.1 : Konsensus Pengendalian dan Pencegahan DM Tipe 2 di Indonesia 2015.(13) Diabetes melitus tipe 1 terjadi karena adanya destruksi sel beta pankreas yang menyebabkan defisiensi insulin absolut. Penyebabnya ada 2 macam, yaitu Immune-mediated diabetes (autoimun) dan idiopatik.12 Immune-mediated diabetes terjadi karena adanya reaksi autoimun yang menyerang sel β pankreas sehingga menyebabkan kerusakan permanen, dan biasanya terdapat predisposisi genetik yang sering terjadi pada anak dan usia muda. Sedangkan pada idiopatik, tidak diketahui etiologi yang jelas pasien mengalami insulinopenia permanen dan tidak terdapat bukti adanya proses autoimun.12 Penderita akan bergantung dengan pemberian terapi insulin untuk dapat bertahan hidup sehingga sering disebut juga insulin-dependent diabetes melitus (IDDM).12 Diabetes tipe 2 atau noninsulin-dependent diabetes melitus (NIDDM), merupakan tipe diabetes yang paling banyak terjadi. Biasanya diawali karena resistensi insulin yang menyebabkan adanya kompensasi dengan meningkatkan produksi insulin, yang pada akhirnya terjadi ketidakmampuan sel β pankreas memproduksi insulin yang adekuat, akhirnya resistensi insulin diikuti dengan defisiensi insulin relatif.14 Diabetes melitus gestasional (GDM) didefinisikan sebagai gangguan toleransi glukosa tanpa diagnosis diabetes sebelumnya dan baru pertama kali didapatkan saat masa kehamilan.15 Penderita GDM harus segera ditatalaksana 6 karena dapat menimbulkan kematian janin, distosia bahu dan hipoglikemia janin.16 2.1.3 Fisiologi dari pankreas dan insulin Insulin merupakan salah satu hormon pengatur metabolisme karbohidrat yang diproduksi oleh pankreas. Sel-sel endokrin pankreas yang mampu memproduksi hormon ini disebut islet of langerhans (pulau langerhans). Pulau langerhans mempunyai beberapa tipe sel, yaitu sel α, β, D dan F. Sekitar 6075% bagian dari pulau langerhans ini adalah sel β yang berada dibagian tengah pulau dan berfungsi memproduksi insulin. Sedangkan 20% lainnya terdapat sel α yang memproduksi glukagon, sisanya adalah sel D yang memproduksi somatostatin dan sel F yang memproduksi polipeptida pankreas.17 Gambar 2.1 Sel-sel pulau Langerhans pankreas Sumber : Silverthorn 2010 Insulin disintesis di retikulum endoplasma kasar sel β pankreas. Dimulai dari translasi RNA di ribosom untuk membentuk preproinsulin. Kemudian preproinsulin ini dibelah menjadi proinsulin, dan ditranspor ke aparatus Golgi untuk membentuk insulin dan peptida C. Insulin dan peptida C dikemas dalam granula, kemudian granula mengalami eksositosis sehingga dapat melewati lamina basal dan masuk kedalam kapiler sekitarnya untuk menuju ke sirkulasi.18,19 7 Sekresi insulin terjadi apabila adanya rangsangan glukosa. Awalnya glukosa melewati membran sel β pankreas dengan mediasi Glucosa transporter (GLUT). GLUT adalah senyawa asam amino yang berada diberbagai sel tubuh untuk mengangkut glukosa masuk kedalam sel. Glucosa transporter 2 (GLUT 2) yang terdapat disel β pankreas, akan mengalami glikolisis dan fosforilasi setelah berikatan dengan molekul glukosa, kemudian akan melepaskan molekul ATP. ATP yang dibebaskan akan mengaktivasi penutupan K channel sehingga terjadi depolarisasi yang diikuti pembukaan Ca channel. Masuknya ion Ca intrasel ini kemudian akan menginduksi proses sekresi insulin.14 Pada awal kerja insulin ke sel target, terjadi ikatan insulin dengan reseptor insulin dipermukaan sel target. Reseptor insulin ini merupakan kombinasi 4 subunit yang dihubungkan oleh ikatan disulfida, yaitu subunit alfa yang seluruhnya terletak diluar membran sel dan subunit beta yang menembus ke membran sampai sitoplasma sel.19 Ketika insulin berikatan dengan subunit alfa terjadi autofosforiasi pada subunit beta, yang akan mengaktivasi tirosin kinase. Aktifitas tirosin kinase ini akan memulai kaskade fosforilasi sel yang mengaktifkan Insulin-reseptor substrate (IRS) kemudian akan memediasi beberapa efek pada masing-masing metabolisme glukosa, protein dan lemak serta akan menyebabkan pemindahan transporter glukosa kemembran sel untuk membantu masuknya glukosa kedalam sel.19 Gambar 2.2 Skematik reseptor insulin Sumber : Guyton & Hall 2011 8 2.1.4 Patogenesis dan Patofisiologi DM DM tipe 1 timbul akibat destruksi sel β pankreas karena proses autoimun. Namun bukan hanya akibat adanya gen yang rentan terhadap diabetes (diabetes susceptibility gene) akan tetapi juga faktor lingkungan yang tidak dapat diketahui dapat mencetuskan proses antibodi. Faktor lingkungan yang dianggap berperan antara lain, pemberian susu sapi sebelum usia 2 tahun, infeksi virus (virus coxsackie B, cytomegalovirus, mumps dan rubella).20 Berbeda dengan DM tipe 1 yang mengalami defisiensi insulin absolut, pada DM tipe 2 terjadi gangguan toleransi glukosa karena adanya gangguan sekresi insulin ataupun gangguan kerja insulin (resistensi insulin) pada organ target terutama pada sel otot, adiposa dan jantung. Resistensi insulin disebabkan oleh adanya faktor genetik dan obesitas.14 Awalnya resistensi insulin ini belum menimbulkan manifestasi diabetes, karena sel β pankreas masih dapat mengkompensasi keadaan dimana terjadi peningkatan glukosa darah dengan meningkatkan produksi insulin. Sehingga terjadi suatu keadaan hiperinsulinemia dan glukosa darah juga masih cenderung normal. Namun jika terjadi berkepanjangan sel β pankreas akan mengalami β cell exhausted (kelelahan sel β) sehingga terjadi defisiensi sekresi insulin. Hal ini kemudian akan menimbulkan peningkatan kadar glukosa darah sampai memenuhi kriteria diabetes.14 Tahap selanjutnya dimana produksi insulin semakin menurun, akan menginduksi glukosa hati melalui proses glikolisis dan glukoneogenesis sehingga terjadi peningkatan kadar glukosa darah yang berlebihan dan mengakibatkan meningkatnya glukosa darah puasa. Keadaan hiperglikemia ini akan memperberat gangguan sekresi insulin sehingga disebut fenomena glukotoksitas. Resistensi insulin juga terjadi pada jaringan adiposa sehingga akan merangsang lipolisis dan meningkatkan asam lemak bebas. Hal ini juga akan mengakibatkan gangguan sekresi insulin oleh sel β pankreas. Fenomena ini disebut lipotoksisitas.14 9 2.1.5 Diagnosis DM Penegakan diagnosis DM dapat dilihat atas dasar pemeriksaan kadar gula darah. Pemeriksaan yang dianjurkan adalah pemeriksaan glukosa dengan cara enzimatik dengan bahan darah plasma vena. Pada penderita DM dapat ditemukan berbagai keluhan yang dapat menjadi pertimbangan jika dicurigai DM. Keluhan klasik DM antara lain poliuria, polidipsia, polifagia dan penurunan berat badan yang tidak jelas penyebabnya. Selain itu keluhan yang terjadi seperti badan lemah, kesemutan, gatal, mata kabur, dan disfungsi ereksi pada laki-laki, serta pruritus vulva pada wanita.13 Kriteria diagnosis DM dalam PERKENI 2015 Pemeriksaaan glukosa plasma puasa ≥126mg/dl. Puasa adalah kondisi tidak ada asupan kalori minimal 8 jam. Atau Pemeriksaan glukosa plasma ≥200 mg/dl 2 jam setelah Tes Tleransi Glukosa Orl (TTGO) dengan beban 75 gram. Atau Pemeriksaan glukosa plasma sewaktu ≥200 mgdl dengan keluhan klasik. Atau Pemeriksaan HbA1c ≥6,5% dengan menggunakan metode Highperfomance Liquid Chromatography (HPLC) yang terstadarisasi oleh National Glycohaemoglobin Standarization Program (NGSP) Tabel 2.2 Kriteria diagnosis DM 13 Jika hasil pemeriksaan tidak memenuhi kriteria normal ataupun DM, maka digolongkan dalam kelompok prediabetes yaitu toleransi glukosa terganggu (TGT) dan glukosa darah puasa terganggu (GDPT) Glukosa darah puasa terganggu (TGPT) yaitu hasil pemeriksaan glukosa plasma puasa antara 100-125 mg/dl dan pemeriksaan TTGO glukosa plasma 2 jam <140mg/dl Toleransi glukosa terganggu (TGT) yaitu hasil pemeriksaan glukosa plasma 2 jam setelah TTGO antara 140-199 mg/dl dan glukosa plasma puasa ,100 mg/dl Bersama-sama didapatkan GDPT dan TGT 10 Diagnosis prediabetes dapat juga ditegakkan berdasarkan hasi pemeriksaan HbA1c yang menunjukkan angka 5,7-6,4%. 13 2.1.6 Tatalaksana DM Pengelolaan DM dapat dimulai dengan terapi non farmakologi yang meliputi perubahan gaya hidup dengan pengaturan pola makan yang dikenal dengan terapi gizi medis dan meningkatkan aktivitas jasmani. Apabila penerapan terapi non farmakologis tidak dapat mengendalikan kadar glukosa darah yang diharapkan, diperlukan intervensi farmakoterapi agar dapat mencegah terjadinya komplikasi lebih lanjut.14 2.1.6.1 Terapi gizi medis Pada prinsipnya terapi gizi medis ini merupakan pengaturan pola makan yang didasarkan pada status gizi penderita diabetes dan melakukan modifikasi diet berdasarkan kebutuhan individual. Komposisi bahan makanan terdiri dari makronutrien (karbohidrat, protein, dan lemak) dan mikronutrien (vitamin dan mineral) harus diatur sedemikian mungkin sehingga dapat memenuhi kebutuhan penderita DM.14 2.1.6.2 Latihan jasmani Latihan jasmani bukan hanya dapat menjaga kebugaran tubuh namun dapat juga menurunkan berat badan, mempermudah transpor glukosa kedalam sel dan memperbaiki sensitivitas insulin, sehingga akan memperbaiki kendali glukosa. Rekomendasi latihan jasmani dilakukan secara teratur, 3-5 kali perminggu selama sekitar 30-45 menit. Dianjurkan berupa latihan yang bersifat aerobik dengan intensitas sedang (50-70% denyut jantung maksimal) seperti jalan cepat, bersepeda, atau berenang.13 2.1.6.3 Terapi farmakologi Terapi farmakologi diperlukan untuk menangani pengendalian glukosa yang tidak teratasi hanya dengan pengaturan terapi nutrisi dan latihan jasmani. Terdapat dua bentuk farmakoterapi yang dapat diberikan yaitu obat oral dan dalam bentuk suntikan. Obat suntikan yang maksud 11 yaitu insulin, agonis GLP-1 dan kombinasi insulin dengan GLP-1.8 Pada pasien DM tipe 1 yang mengalami defisiensi insulin absolut, terapi satusatunya adalah dengan terapi insulin.19 Sedangkan obat oral dibagi 5 golongan berdasarkan cara kerjanya: Menstimulasi sekresi insulin (insulin secretagogue): Sulfonil urea dan glinid Meningkatkan sensitivitas insulin: Metformin dan Tiazolidindion Menghambat glukoneogenesis: Metformin Menghambat absorsi glukosa : Inhibitor alfa glukosidase DPP-IV inhibitor.21 2.1.7 Komplikasi DM 2.1.7.1 Komplikasi metabolik akut Komplikasi metabolik pada DM disebabkan oleh adanya perubahan yang relatif akut dari konsentrasi glukosa plasma. Komplikasi metabolik yang paling sering terjadi khususnya pada DM tipe 1 adalah ketoasidosis diabetik (DKA).22 Kombinasi keadaan defisiensi insulin dan peningkatan konsentrasi hormon kontra regulator terutama epinefrin, dapat mengaktivasi hormon lipase sensitif pada jaringan lemak. Akibatnya terjadi peningkatan produksi benda keton dan asam lemak bebas secara berlebihan. Akumulasi benda keton inilah yang menyebabkan KAD.14 Hipoglikemia juga merupakan komplikasi metabolik yang sering terjadi pada DM. Pasien diabetes yang menggunakan insulin atau terapi obat antihiperglikemik oral (OHO) mungkin suatu saat jumlahnya lebih banyak dari pada yang dibutuhkan atau intake glukosa lebih sedikit daripada terapi, sehingga dapat mengakibatkan hipoglikemia karena tidak dapat mempertahankan kadar glukosa normal.22 12 2.1.7.2 Komplikasi kronik jangka panjang Apabila pengelolaan diabetes melitus tidak dilakukan dengan baik, akan menyebabkan terjadinya komplikasi kronik, baik mikroangiopati, makroangiopati maupun kerusakan jaringan lainnya seperti kardiomiopati diabetik.14 Keadaan hiperglikemia kronik dapat menyebabkan kerusakan pada jaringan melalui 5 mekanisme utama, yaitu: (1) Peningkatan masuknya glukosa dan gula lainnya melalui jalur poliol, (2) Peningkatan pembentukan intraseluler advanced glycation end products (AGEs), (3) Peningkatan ekspresi reseptor untuk AGEs, (4) Aktivasi protein kinase C (PKC), dan (5) Aktivitas yang berlebihan dari jalur hexosamine.23 Mekanisme hiperglikemia menginduksi kerusakan sel sebagai berikut: Aktivasi Jalur Poliol Beberapa sel yang menggunakan glukosa transporter Insulinindependent dapat terjadi kelebihan jumlah glukosa pada keadaan hiperglikemia. Kelebihan glukosa ini akan dikonversikan menjadi sorbitol oleh enzim aldose reduktase.23 Pada saat yang sama juga terjadi peningkatan reaksi oksidasi NADPH menjadi NADP+ dan reaksi reduksi NAD+ menjadi NADH. Peran NAD+ adalah sebagai kofaktor yang membantu sorbitol dehidrogenase untuk mengoksidasi sorbitol menjadi fruktosa.8 Sorbitol dan fruktosa ini tidak terfosforilasi, tetapi bersifat sangat hidrofilik. Sehingga terjadi akumulasi poliol intrasel yang akan berakibat masuknya air kedalam sel akibat proses osmotik yang akan menyebabkan kekerusakan sel.14 Aktivasi jalur poliol ini dapat meningkatkan turn over NADPH, sehingga terjadi penurunan rasio NADPH sitosol terhadap NADP+ yang dikenal sebagai keadaan pseudohipoksia.8 Selain itu NADPH juga diperlukan sebagai kofaktor GSH untuk menetralisasi oksidan intaselular, dengan demikian akan mengakibatkan stress oksidatif yang lebih besar.23 13 Peningkatan pembentukan AGEs AGEs terbentuk dari reaksi nonenzimatik glukosa dan juga dari peningkatan oksidasi asam lemak di sel endotel dan jantung (contohnya dicarbonyls seperti 3-deoxyglucosone, methylglyoxal, and glyoxal) dengan protein. Protein plasma yang telah dimodifikasi oleh AGEs akan berikatan oleh reseptor AGEs, kemudian ikatan ini akan menginduksi produksi ROS yang mengaktivasi NF-кB. Aktivasi NF-кB menyebabkan beberapa perubahan patologi pada ekspresi gen.23 Pada saat yang sama terjadi peningkatan methylglyoxal yang menyebabkan peningkatan O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) transferase. O-GlcNAc transferase akan meningkatkan modifikasi dari Sp3 yang meningkatkan ekspresi Angiopoietin 2 (Ang-2). Ekspresi Ang2 yang diinduksi oleh glukosa yang tinggi di endotel ginjal peningkatan ekspresi intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) dan vascular cell adhesion molecule (VCAM-1). Hal ini akan menyebabkan terjadinya reaksi inflamasi dan berlanjut pada kerusakan sel.23 Peningkatan ekspresi reseptor AGEs (RAGE) Pada keadaan hiperglikemia akan menginduksi peningkatan methylglyoxal, sehingga memediasi terbentuknya ROS dengan meningkatkan transkripsi NF-кB dan AP-1. NF-кB dan AP-1 ini merupakan sinyal untuk mengekspresikan RAGE.23 Produksi AGE yang meningkat juga akan menginduksi sinyal inhibisi ekspresi dari RAGE antisense cDNA atau antiRAGE ribozyme. Sehingga hal ini dapat meningkatkan ekspresi RAGE lebih besar.23 Aktivasi protein kinase C (PKC) Akumulasi glukosa intrasel yang abnormal dapat menyebabkan meningkatnya diasilgliserol (DAG) intrasel, dan kemudian menyebabkan peningkatan protein kinase C (PKC), terutama PKC β. Perubahan tersebut kemudian akan berpengaruh pada sel endotel , menyebabkan terjadinya perubahan vasoreaktivitas melalui keadaan meningkatnya endotelin-1 dan menurunannya eNOS.14 14 Peningkatan jalur PKC akan mengakibatkan proliferasi sel otot polos dan juga pelepasan sitokin seperti TGF β dan VEGF. Selain itu PKC juga melibatkan overekspresi dari faktor inhibitor fibrinolitik, plasminogen activator inhibitor (PAI-1) dan aktivasi NF-кB sehingga menyebabkan perubahan yang selanjutnya mengarah kepada angiopati diabetik.23 Aktivitas yang berlebihan dari jalur hexosamine Pada resistensi insulin dan DM terjadi oksidasi asam lemak yang berlebih, hal ini juga berperan dalam patogenesis terjadinya komlikasi diabetik dengan meningkatkan perubahan fructose 6-phophate ke jalur hexosamine. Pada jalur ini fructose 6-phosphate dialihkan dari glikolisis, dan diubah menjadi glucosamine 6-phosphate oleh glutamine fructose 6phosphate amidotransferase (GFAT). Kemudian glucosamine 6phosphate dirubah juga menjadi UDP-NAcetylglucosamine.23 Meskipun jalur hexosamine belum jelas bagaimana mekanismenya diinduksi oleh hiperglikemia, studi memperlihatkan bahwa pada keadaan hiperglikemia menyebabkan 4 kali lipat peningkatan O-GlcNAcylation dari transkipsi faktor Sp1, yang dimediasi oleh aktivasi PAI-1 dan TGF β1.23 Peningkatan O-GlcNAcylation akan menghambat produksi eNOS yang akan mengakibatkan terjadinya disfungsi endotel. Selain itu, pada hiperglikemia juga meningkatkan GFAT pada sel otot jantung. Meningkatnya O-GlcNAcylation, pada sel otot jantung, akan menurunkan ekspresi sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2α (SERCA2α) mRNA, sehingga akan mengganggu regulasi Ca2+ ke retikulum sarkoplasma. Akibatnya akan terjadi kerusakan pada sel tersebut.37 2.1.7.3 Kardiomipati Diabetik Pada DM yang berkepanjangan dan tidak terkontrol dapat menyebabkan kerusakan organ multipel yang berlanjut pada komplikasi berat. Yang paling sering adalah kerusakan pada sistem kardiovaskular.8 Retinopati, neuropati dan nefropati sering terjadi pada penderita DM akibat dari perubahan aliran darah atau difungsi endotel vaskular.8 15 Gangguan otot jantung pada penderita DM dikenal sebagai diabetik kardiomiopati (DCM), yang dapat menyebabkan ketidakmampuan jantung memompa darah keseluruh tubuh secara efektif sehingga terjadi gagal jantung. 8 2.1.7.3.1 Patofisiologi DCM Hiperglikemia kronik dapat menginduksi kerusakan sel oleh karena pembentukan AGEs dari proses glikasi nonenzimatik dan oksidasi protein dan lipid. Dewasa ini banyak studi mengatakan bahwa terdapat peningkatan level AGEs pada sel jantung pasien DM. Selain itu aktivasi jalur PKC juga berkonstribusi dalam mekanisme fibrosis jantung dengan menstimulasi connective tissue growth factor (CTGF) yang terlihat pada PKC-β2 transgenik pada tikus DM. Overekspresi PKC-β2 pada jantung tikus DM dapat menimbulkan hipertrofi ventrikel kiri, fibrosis serta penurunan fraksi ejeksi ventrikel kanan, yang juga terjadi pada DCM.8 Pada kondisi DM juga berhubungan dengan aktivasi renin-angiotensin II. Overproduksi angiotensin II ini akan menyebabkan perubahan yang besar dengan menstimulasi sintesis komponen matriks ekstraselular, apoptosis/proliferasi, inflamasi vaskular, dan kerusakan oksidatif. Kerusakan oksidatif ini khususnya terjadi pada deoxybonucleic acid (DNA) yang berhubungan dengan aktivasi enzim poly-ADP ribose polimerase (PARP).8 DM tipe 1 dan tipe 2 berhubungan dengan produksi ROS dan RNS pada mitokondria sel (gambar 2.3). Mitokondria merupakan sumber terbesar pembentukan ROS. Peningkatan produksi ROS dan RNS menyebabkan disfungsi pada jantung dengan merusak secara langsug protein dan DNA yang menginduksi apoptosis 16 sel. Kerusakan oksidatif dapat menstimulasi respon remodeling ventrikel, dengan mengaktifkan matriks metalloproteinase yang dapat mengubah arsitektur matriks ekstraselular, sehingga menginisiasi terjadinya kardiomiosit hipertropi.8 Gambar 2.3 Mekanisme stress oksidatif menginduksi apoptosis sel Sumber : Liu, 2014 2.2 Tinjauan Tanaman Cinnamomum cassia 2.2.1 Kayu Manis (Cinnammomum cassia) Di dunia telah tercatat 54 jenis tanaman kayu manis (Cinnamomum spp) dan 12 jenis diantaranya ada di Indonesia. Jenis kayu manis yang banyak ditanam di Indonesia adalah C. burmanii, C. zeylanikum dan C. cassia. Saat ini 17 kayu manis yang sudah dikenal luas di pasar dunia hanyalah yang berasal dari jenis C. zeylanikum dan C. cassia.24 Gambar 2.4 Tanaman kayu manis (C. cassia) Sumber : Daswir 2011 Klasifikasi Ilmiah kayu manis sebagai berikut : Kingdom : Plantae Sub Kingdom : Tracheobionta Super Divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Magnoliidae Ordo : Magnoliales Famili : Lauraceae Genus : Cinnamomum Spesies : Cinnamomum cassia.25 Kedua jenis kayu manis (C. zeylenicum dan C. cassia) memiliki efek lebih kuat dalam menurunkan gula darah. Penelitian menunjukkan C. cassia memiliki efek antidiabetik yang lebih baik dari pada C. zeylanikum.26 pada penelitian lain juga menyimpulkan bahwa C. cassia mempunyai efek antioksidan, yang dapat memperbaiki stress oksidatif yang terjadi akibat hiperglikemia pada DM yang berkepanjangan. Sehingga C. cassia ini dapat 18 mencegah masalah komplikasi dari stress oksidatif seperti pada kardiomiopati diabetik.27 Tanaman kayu manis secara umum dapat tumbuh dengan tinggi mencapai 8-27m, panjang daun antara 5-17 cm dan lebar daun 3-10 cm. Warna daun hijau muda dengan pucuk merah muda. Tanaman kayu manis ini yang diharapkan adalah hasil kulit yang memiliki aroma yang kuat dengan kandungan utamanya sinamaldehid.24 2.2.2 Kandungan Kimia dalam Kayu manis Beberapa penelitian yang telah dilakukan pada kayu manis dilaporkan telah terbukti memiliki efek hipoglikemik dan efek antioksidan pada tikus diabetes.27 Dari analisa fitokimia menunjukkan adanya beberapa senyawa penting dalam ekstrak kayu manis diantaranya alkaloid, protein, tannin, glikosida, flavonoid, saponin, asam cinnamat, polifenol, dan cinnamaldehid.7 Kandungan cinnamaldehid merupakan agen antioksidan yang dapat melawan pembentukan reactive oxygen species (ROS) dengan cara mengaktivasi Nrf2. Sinyal Nrf2 ini adalah suatu sinyal yang dapat mencegah terbentuknya ROS pada keadaan hiperglikemia. Selain itu Nrf2 ini juga dapat menjaga level Nitric Oxide (NO) yang merupakan agen vasodilator pada pembuluh darah. Pada hasil penelitian menunjukkan hasil yang signifikan bahwa kandungan cinnamaldehid ini berpotensi sebagai antioksidan yang dapat melindungi efek kerusakan kardiovaskular pada komplikasi DM.28 Gambar 2.5 Struktur kimia Cinnamaldehid 29 Sumber : Wang et al 2013. Kandungan lainnya yaitu polifenol dan flavonoid. Kayu manis mempunyai kadar polifenol dan flavoid yang cukup tinggi sebagai agen antioxidan.10 Polifenol ini dapat menurunkan kadar glukosa darah melalui 19 beberapa mekanisme, yaitu meningkatkan masuknya glukosa kedalam sel dengan menginduksi fosforilasi reseptor insulin dan translokasi GLUT 4. Selain itu juga meningkatkan ekspresi Peroxisome Proliferator-activated Receptor (PPAR) untuk meningkatkan sensitivitas insulin. Suatu studi memaparkan bahwa kandungan polifenol pada kayu manis juga mempunyai mempunyai efek antioksidan yang dapat memperbaiki kerusakan sel akibat stress oksidatif yang terjadi pada keadaan hiperglikemia yang terlihat pada meningkatnya level glutathion serum (GSH) pada pasien DM yang diberikan terapi ekstrak kayu manis selama 12 minggu.7 Kandungan lain pada kayu manis adalah methylhydroxy chalcone polymer (MHCP). Pada suatu studi memaparkan bahwa MHCP ini mempunyai efek insulin mimetik.30 Mekanisme kerja MCHP juga meningkatkan ekspresi PPAR sehingga menurunkan resistensi insulin. Selain itu, MCHP juga memperbaiki metabolisme glukosa, sehingga akan memperbaiki glukosa darah pada DM.31 2.3 Streptozotosin(STZ) 2.3.1 Definisi STZ Streptozotocin (STZ) merupakan suatu antibiotik yang dapat digunakan sebagai terapi berbagai tipe kanker. Secara struktural merupakan N-nitrosourea derivat dari D-glucosamine yang diisolasi dari Streptomyces achromogenes. STZ bersifat antibiotik spektrum luas dan juga agen alkilasi genotoksik yang mempunyai efek antibakterial, karsinogenik dan diabetogenik. Oleh karena itu, STZ bukan merupakan pilihan obat sebagai terapi kanker karena dapat menyebabkan toksisitas yang berat.32 Saat ini pengunaan STZ digunakan untuk menginduksi insulin-dependent diabetes melitus (IDDM) dan non-insulindependent diabetes mellitus (NIDDM) pada hewan coba, karena menunjukkan toksisitas yang spesifik sel beta pankreas. Toksisitas sel beta dan sifat diabetogenik dari STZ dimediasi melalui mekanisme yang beragam termasuk penyerapan STZ kedalam sel beta oleh GLUT2.33,34 20 2.3.2 Struktur dan mekanisme kerja STZ Streptozotocin atau 2-deoxy-2-(3-methyl-3-nitrosourea)1-D- glucopyranose mempunyai 2 bentuk anomerik yaitu α and β, yang dapat dipisahkan Chromatographic technique (HPLC).34 STZ mempunyai berat molekul 265 g/mol, dan formula molekul C8 H15 N3O7.35 Gambar 2.6 Struktur Kimia STZ Sumber: Goud 2015 Aktivitas toksik STZ melibatkan penyerapan selektif ke dalam sel-sel β pankreas melalui transporter glukosa (GLUT2) dengan afinitas rendah yang terdapat di membran plasma. Pada umumnya, komponen nitrosurea bersifat lipofilik, namun pada STZ yang mempunyai sifat hidrofilik karena adanya komponen glukosa. Komponen 2-deoksi glukosa dari STZ memungkinkan penyerapan selektif ke dalam sel-sel β melalui transporter glukosa GLUT2 karena strukturalnya analogi dengan glukosa.36 STZ dikenal sebagai agen penyebab diabetogenik karena menghambat produksi insulin dan selektif menghancurkan sel beta penghasil insulin dengan menginduksi nekrosis (Gambar 2.7). Sedangkan sel endokrin non-β di pulau 21 pankreas seperti sel α dan δ serta jaringan parenkim ekstra pankreas tetap utuh setelah pemberian STZ, sehingga hal menunjukkan sifat STZ yang selektif pada sel beta pankreas.36 Gambar 2.7 Skematik uptake selektif STZ pada sel β pankreas Sumber : Goud 2015 Setelah STZ masuk ke dalam sel β pankreas, akan menghambat metabolisme glukosa dan sekresi insulin dari sel beta sehingga akan merusak pankreas.36 Mekanisme toksisitas dari STZ yang terjadi pada sel β pankreas antara lain : 1. Carbamoylation dan alkilasi dari komponen seluler. 2. Pelepasan Nitrat oksida (NO). 22 3. Pembentukan radikal bebas dan stres oksidatif. 4. Penghambatan O-GlcNAcase.35 2.3.3 Dosis STZ Terdapat beragam dosis penggunaan STZ untuk menginduksi diabetes pada hewan coba, diantaranya dosis tunggal (>40mg/kgBB) yang akan menyebabkan rusaknya sel beta pankreas dan timbulnya hiperglikemi. Dosis lain yang digunakan untuk menyebabkan keadaan DM tipe 1 pada hewan coba adalah dosis antara 40-60 mg/kgBB secara intravena. STZ juga dapat diberikan melalui intraperitoneal dengan dosis yang sama atau lebih besar, namun dosis <40 mg/kgBB mungkin kurang efektif.34 Dosis STZ sebanyak 50 mg/kgBB secara intravena dapat meningkatkan kadar glukosa darah sampai 270mg/dL setelah 2 minggu. Pemberian dosis rendah akan memicu suatu proses autoimun yang mengarah pada kerusakan sel beta pankreas dengan infiltrasi sel leukosit mononuclear dan adanya sitokin. Berbeda pada DM tipe 2 akan lebih mudah diinduksi secara intravena atau intraperitoneal dengan dosis 100mg/kgBB STZ setelah tikus tersebut lahir(810 minggu).34 Telah dilaporkan pada penelitian bahwa STZ memiliki LD50 dengan dosis 240 mg/kgBB pada tikus coba. STZ memiliki waktu paruh sekitar 19 menit didalam sel. Studi menunjukkan bahwa sebanyak 77% dari STZ yang disuntikkan akan dipecah dan diekskresikan utuh dalam waktu 6 jam setelah penyuntikan. Dari jumlah itu 30% diekskresikan dalam satu jam pertama. Sebagian besar metabolit dieliminasi (74%) dalam urin dan sisanya (3%) dihilangkan dalam tinja. Sebagian besar materi yang tersisa, ditemukan di hati dan ginjal.36 2.4 Pewarnaan Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) deteksi apoptosis sel Apoptosis merupakan kematian sel secara terprogram yang dikontrol oleh gen dan berperan penting dalam perkembangan biologis dan pemeliharaan jaringan 23 yang aktif membelah supaya selalu dalam kondisi seimbang. Apoptosis dapat menjadi suatu peristiwa penting dalam proses fisiologis serta dalam kondisi patologis.40 Metode untuk mendeteksi sel yang mengalami apoptosis dapat didasarkan pada karakteristik apoptosis itu sendiri. Salah satu karakteristik dari sel apoptosis adalah degradasi DNA oleh endonuklease, yang menghasilkan untai ganda fragmentasi DNA berukuran 180-200 bp.41 Enzim ini diaktifkan oleh caspase yang merupakan protein pencetus program kematian sel.42 Salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi kerusakan DNA in situ adalah pewarnaan TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL). Pewarnaan TUNEL digambarkan sebagai metode untuk pewarnaan sel yang telah mengalami apoptosis, dan menunjukkan ciri khas biokimia berupa DNA fragmentasi. 43 Reagen TUNEL terdiri dari enzim terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dan fluorescein-dUTP. Prinsip metode TUNEL yaitu menggunakan enzim TdT yang bertugas mengenali ujung 3’-OH (nick end) yang dihasilkan oleh fragmentasi DNA yang dihasilkan selama proses apoptosis. dan fluorescein-dUTP untuk memvisualisasikan ujung 3’OH tersebut. Sel-sel yang mengalami apoptosis secara khusus diberi label dengan fluorescein-dUTP dengan sensitivitas tinggi, memungkinkan deteksi langsung dengan melihat dengan mikroskop fluorescein. Selain itu dapat juga dideteksi dengan peroxidase-labeled anti-fluorescein antibody, yang mungkin untuk dideteksi dengan mikroskop cahaya.44 24 2.5 Kerangka konsep C. cassia 200mg/kgbb Streptozotocin Selektif menyerang sel β pankreas MHCP Antioksidan Via GLUT2 sel β pankreas Carbamoylation dan alkilasi dari komponen seluler Pelepasan NO Merangsang autofosforilasi reseptor insulin Pembentuk kan radikal bebas dan stres oksidatif. Penambahan ekspresi PPAR ↑Sensitivitas insulin Nekrosis sel β pankreas Aksi insulin pada sel target ↓ Defisiensi insulin Hiperglikemia (DM) ↑ Aktivasi jalur poliol ↑ produksi AGEs ↑ aktivasi jalur PKC ↑ Produksi ROS Aktivasi enzim poly-ADP ribose polimerase (PARP). Kerusakan pada DNA sel jantung Terjadi remodeling Hipertrofi ventrikel jantung Cinnamaldehid Fibrosis Diabetik kardiomiopati Apoptosis sel jantung ↑ ↓ Fraksi ejeksi ventrikel 25 Mengaktifkan sinyal NrF2 Mencegah pembentukan ROS ↑ jalur hexosamine 2.6 Definisi Operasional No Variabel Definisi operasional Alat Ukur Cara Pengukuran 1 Apoptosis sel jantung Gambaran nukleus sel jantung yang berwarna coklat karena pewarnaan TUNEL Mikroskop Olympus BX-41 Mengidentifikasi apoptosis sel jantung pada pembesaran 20x, kemudian dihitung secara manual. 26 Skala Pengukuran Numerik BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian Desain yang digunakan dalam penelitian ini adalah desain eksperimental laboraturium. 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian 3.2.1 Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai April 2016 3.2.2 Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Animal House, laboratorium Biologi, laboraturium MPR, laboraturium Histologi, laboratorium Riset, dan laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Jl. Kertamukti no. 05 Pisangan, Ciputat 15419, Tangerang Selatan. 3.3 Populasi dan Sampel Penelitian Perlakuan pada semua kelompok tikus telah dilakukan pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Rachmah dkk mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada tahun 2015 yang dilakukan selama 28 hari. Objek percobaan yang digunakan adalah organ jantung tikus jantan Sprague Dawley usia 16 minggu, dengan berat badan rata-rata 192-337 gram, yang didapatkan dari Departemen Patologi Institut Pertanian bogor. Penelitian ini dilakukan dengan membagi hewan coba menjadi 3 kelompok. Kelompok pertama merupakan kelompok N (normal) sebagai kontrol negatif. Kelompok kedua merupakan kelompok D (diabetes) sebagai kontrol positif. Kelompok ketiga merupakan kelompok D+Cc 200 (diabetes dengan terapi Cinnamomun cassia) yaitu kelompok tikus DM yang diinduksi STZ dan diberikan terapi daun kayu manis (Cinnamomum cassia) dengan dosis 200 mg/kgBB/hari selama 28 hari. 27 Besarnya jumlah sampel yang digunakan, ditentukan dengan menggunakan Mead’s Equation Formula sebagai berikut: 46 E=N-B-T E : Error Component (10-20) N : Jumlah individu percobaan (sampel) dalam semua kelompok (dikurang 1) B : Blocking Component (dikurang 1) B=0 T : Jumlah kelompok terapi (dikurang 1) E=N–B–T E=N–0–T ≥10 = (N-1) – (T-1) E= N-0-T ≤20=(N-1)-(T-1) ≤20=(N-1)-(3-1) ≤20=(N-1)-2 ≤20=N-3 ≥10 = (N-1) – (3-1) ≥10 = N -3 N≤23 N ≥13 N = 13 – 23 kemudian dibagi menjadi 3 kelompok dengan jumlah yang sama. Sehingga jumlah sampelnya adalah 4-7. Kemudian pada setiap kelompok diambil 2 sampel pada kelompok normal dan 3 sampel pada kelompok D dan D+Cc untuk 2 dijadikan preparat mikroskopik. 0 = ( N 3.3.1 Kriteria Inklusi Tikus kontrol negatif : tikus jantan strain Sprague dawley dengan glukosa darah sewaktu < 250 mg/dL 1 ) Tikus kontrol positif dan tikus terapi : tikus jantan strain Sprague – dawley dengan glukosa darah sewaktu >250 mg/dL. ( T 1 28 ) 2 3.3.2 Kriteria Eksklusi Tikus mati sebelum perlakuan Tikus jantan strain Sprague dawley yang diinduksi STZ dengan glukosa darah sewaktu <250 mg/dL setelah dilakukan tiga kali pengukuran dengan waktu tiga hari. 3.4 Cara Kerja Penelitian 3.4.1 Alat Penelitian Alat-alat yang harus disiapkan untuk penelitian ini antara lain : Sentrifuge Tabung EDTA Toples Coolbox Mikropipet Tabung effendorf Object glass Sentrifugasi Cover glass Kulkas -80 C Mikrotom Sarung tangan Rotamax Vortex Waterbath Valcon tube Rak preparat Mikroskop konfokal Thermometer Microwave Mikroskop Olympus BX41 Oven Komputer laboraturium Stirer 3.4.2 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Ekstrak kayu manis Sukrosa 10% (Cinnamomum cassia) Destilated water (DW) 29 Ethanol Entellan Ether Deionized water Buffer Sitrat Kit pewarnaan Tunel Streotozotocin (STZ) 3.4.3 Adaptasi Hewan Sampel Sebelum dilakukan percobaan, dilakukan tahap adaptasi pada semua hewan sampel di laboratorium Animal House selama 2 minggu. Hewan diadaptasikan dengan lingkungan barunya, makanan dan minumannya disamakan semua. Tujuan dari proses ini adalah untuk mengkondisikan semua tikus dalam kondisi yang sama sebelum diberikan perlakuan. 3.4.4 Induksi Streptozotocin (STZ) Setelah dilakukan proses adaptasi, pada hari ke-15 tikus diinduksi STZ 55 mg/kgbb secara intraperitoneal. Setelah hewan diinduksi STZ, selanjutnya diberi sukrosa 10% dalam waktu 24 jam untuk mencegah hipoglikemia. Pengukuran kadar gula darah dilakukan 4 hari setelah induksi STZ. Tikus dengan glukosa >250 mg/dl dikatakan sebagai tikus DM. 3.4.5 Pemberian Ekstrak Kayu Manis Terhadap Tikus Pada tikus yang telah DM, kelompok tikus uji diberikan terapi ekstrak kayu manis 200 mg/kgBB peroral dengan menggunakan alat sonde. Pemberian ini dilakukan sekali dalam sehari selama 28 hari. 3.4.6 Tahap Sacrifice (Pembedahan) Setelah perlakuan selesai, semua tikus disacrifice dengan memasukkan tikus kedalam toples yang berisi kapas yang diberi ether sampai tidak berespon ketika diberi rangsangan, kemudian tikus dibedah untuk diambil jantungnya dan difiksasi dengan formalin 10%. Kemudian dilakukan pembuatan sediaan 30 mikroskopis dengan metode paraffin. Pembuatan sediaan mikroskopis ini dilakukan di Departemen Histologi Universitas Indonesia, Salemba. 3.4.7 Tahap pewarnaan Tunel Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan TdT-mediated dUTP nick endlabeling (TUNEL) untuk dapat mengidentifikasi apoptosis sel pada masingmasing kelompok. Kit pewarnaan TUNEL yang digunakan adalah Takara bio. pada setiap kelompok diambil 2 sampel pada kelompok normal dan 3 sampel pada kelompok D dan D+Cc untuk dijadikan dilakukan pewarnaan. Tahap pewarnaan Tunel Takara bio sebagai berikut: 3.4.7.1 Deparafinisasi Preparat mikroskopis yang telah siap, diletakan pada rak preparat, dan kemudian dicelupkan secara berurutan kedalam 3 toples yang berisi cairan xylene I, xylene II, dan xylene III dengan cara bergantian masingmasing selama 5 menit. Pada saat pencelupan, toples diletakkan diatas Rotamax dengan pengaturan kecepatan ±125 rpm. Setiap sebelum diputar dengan Rotamax preparat diangkat celup sebanyak 3 kali terlebih dahulu. Selanjunya preparat dicelupkan secara berurutan kedalam toples yang berisi cairan ethanol 100%, ethanol 100%, ethanol 90%, dan ethanol 70% masing-masing selama 5 menit. Setiap pencelupan, toples diletakkan juga diatas Rotamax dengan pengaturan kecepatan ±125 rpm. Preparat kemudian dicelupkan ke dalam toples berisi DW dan diletakkan diatas Rotamax selama 2 menit. 3.4.7.2 Proses Enzimatik Mengeringkan dan meletakkan preparat secara berjajar diatas alas. Kemudian meneteskan Proteinase K sebanyak 10-20 µg/ml dan didiamkan pada suhu ruangan selama 15 menit. Preparat diletakkan kembali pada rak preparat dan dicelupkan kedalam toples berisi cairan PBS yang selanjutnya diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 10 menit. 31 3.4.7.3 Proses inaktivasi endogen peroksidase Meneteskan H2O2 3% pada setiap preparat sampai seluruh permukaan potongan organ tertutup. Kemudian ditunggu selama 5 menit. Preparat dicelupkan kembali kedalam toples berisi cairan PBS yang kemudian diputar selama 10 menit, kemudian dengan cairan PBS yang baru preparat diputar kembali diatas Rotamax selama 5 menit. 3.4.7.4 Proses labeling Meneteskan Labeling reaction mixture 50µl (berisi 5µl TdT enzyme dicampurkan dengan 45 µl Labeling safe buffer) pada setiap preparat dan kemudian ditutup dengan cover glass. Preparat dimasukan kedalam wadah humidified chamber dan dioven dengan suhu 37o selama 70 menit. Setelah itu, preparat dikeluarkan dari oven dan dibuka cover glassnya. Preparat kembali diletakkan pada rak, dan dicelupkan ke dalam toples berisi cairan PBS yang diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 5 menit. 3.4.7.5 Proses Reaksi Antibody Meneteskan anti-FITC HRP conjugate sebanyak 70 µl pada masing-masing preparat dan ditutup dengan cover glass. Preparat dimasukan ke dalam oven dengan suhu 37o selama 30 menit. Selanjutnya membuka cover glass, dan preparat dicelupkan ke dalam toples berisi cairan PBS yang kemudian diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 5 menit. 3.4.7.6 Proses pengembangan warna Preparat dimasukan dalam toples berisi diaminobenzidine (DAB) dan diletakkan diatas rotamax selama 12 menit. Kemudian preparat dicelupkan ke dalam toples berisi Deionized water yang kemudian diputar diatas rotamax sebanyak 2 kali dengan Deionized water yang berbeda masing-masing selama 5 menit. 32 3.4.7.7 Proses Counterstaining Meneteskan methyl green 3% pada masing-masing preparat sampai seluruh permukaan potongan organ tertutup. Kemudian ditunggu sampai 7 menit. Kemudian preparat dicelupkan ke dalam toples berisi Deionized water dan diputar diatas rotamax selama 5 menit. 3.4.7.8 Proses dehidrasi preparat Preparat diangkat-celupkan sebanyak 3 kali secara berurutan kedalam toples yang berisi cairan ethanol 70 %, ethanol 90%, ethanol 100%, kemudian celupkan satu persatu preparat kedalam xylene dan dikeringkan. 3.4.7.9 Fiksasi preparat Setelah preparat kering, kemudian teteskan Entelan diatas potongan organ preparat sebanyak 1 tetes dan ditutup dengan cover glass dan diperhatikan agar tidak terdapat gelembung udara. Preparat didiamkan minimal 12 jam. 3.4.8 Pengamatan Jaringan Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop Olympus BX41 pada perbesaran 20x. Persentase apoptosis dihitung dengan menghitung jumlah total apoptosis dalam semua lapang pandang dalam satuan persen. 45 3.6 Pengolahan dan Analisa Data Setelah dilakukan pengambilan data, selanjutnya data di olah dengan menggunakan program SPSS versi 16.0. Uji yang digunakan adalah Uji Oneway Anova karena penelitian ini termasuk analitik kategorik numerik, yang membandingkan variabel dengan skala pengukuran numerik pada lebih dari dua kelompok yang tidak berpasangan. Untuk melakukan uji Oneway Anova, terlebih dahulu dilakukan uji normalitas data dan uji homogenitas. Hasil menunjukkan 33 signifikan apabila nilai P<0,05. Kemudian untuk mengetahui perbandingan antar kelompok, dilakukan uji Post hoc dan hasil dikatakan signifikan terdapat perbedaan apabila P<0,05. 34 3.5 Alur Penelitian Perizinan kode etik hewan coba Tikus tiba di laboraturium Animal House Adaptasi hewan sampel selama 14 hari Pembagian kelompok Kontrol Negatif Kelompok Normal (N), dengan gula darah <250 mg/dl Tikus diinduksi dengan STZ 55 mg/kgbb pada hari ke 15 Kontrol positif Kelompok DM (D), dengan gula darah >250 mg/dl Perlakuan Kelompok D+Cc 200 mg/kgBB (DM dengan Cinnamomum cassia dosis 200 mg/KgBB) Sacrifice Pembiusan dengan menggunakan ether, pembedahan dan pengambilan organ jantung tikus Pembuatan preparat Pembuatan sediaan mikroskopik dengan metode paraffin di Departemen Histologi UI Analisa Statistik data Pewarnaan preparat Pewarnaan preparat dilakukan sesuai dengan protocol TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End.Labelling) TAKARA Identifikasi miksroskop 35 Penghitungan Sampel Preparat Sampel TUNEL dibaca secara kuantitatif dengan menghitung persen apoptosis BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil dan Pembahasan Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Rachmah dkk. 2015, didapatkan data glukosa darah yang merupakan jumlah rata-rata glukosa darah pada awal penelitian hari ke-1, yaitu saat tikus dinyatakan DM dan normal, hari ke-7, hari ke14, hari ke-21 dan hari ke-28. Data yang didapatkan selama penelitian adalah : Tabel 4.1 Rata-rata dan standar deviasi glukosa darah tikus setiap kelompok penelitian GDS Mean±SD (mg/dl) Kelompok Hari-1 Hari-7 Hari-14 Hari-21 Hari-28 N 83.3±10.5 116.8±12 94.3±17.3 117.5±12.6 103.3±7.5 D 481.3±98.2 532.8±91.2 521±102.4 531.5±26.3 600±0* D+CC 200 503.3±134.3 441.3±203.8 460.3±235.2 426.5±241.3 479.3±221.9# Ket: SD = Standard Deviasi, N = Normal (n=2), D = Diabetes(n=3), D+Cc200 = Diabetes dengan terapi kayu manis 200mg/kgBB (n=3), D+ Cc400= Diabetes dengan terapi kayu manis 400 mg/kgBB. *P<0,05 dibandingkan N, #P<0,05 dibandingkan D.39 Kemudian data apoptosis sel yang diambil pada penelitian adalah jumlah rerata dari sel yang mengalami apoptosis pada semua lapang pandang yang didapatkan pada setiap preparat jantung tikus masing-masing kelompok. Kelompok normal (N) yang menjadi kontrol negatif, kelompok tikus diabetes (D) yang merupakan kontrol positif, dan kelompok perlakuan terapi kayu manis (D + Cc) yaitu kelompok tikus diabetes yang diberikan terapi ekstrak Cinnamomum cassia 200 mg/kgBB selama 28 hari. Dimana preparat tersebut telah dilakukan pewarnaan dengan menggunakan pewarnaan TUNEL yang dapat mengidentifikasi apoptosis sel. Data yang didapatkan selama penelitian adalah : 36 80 ## ** Rerata PerseApoptosis Sel JantungRerata Persentase Apoptosis Sel Jantung (%) 70 N 60 D 50 D + Cc 40 30 20 10 0 Grafik 4.1 Rerata persentase jumlah apoptosis sel jantung pada semua kelompok penelitian. N = Normal (n=2), D = Diabetes (n=3), D+Cc200= Diabetes dengan terapi kayu manis 200 mg/kgBB (n=3). *P<0,05, **P<0,01 untuk N vs D, #P<0,05, ##P<0,01 untuntuk D vs D+Cc. Berdasarkan hasil yang didapati pada grafik 4.1 menunjukkan bahwa rerata persentase apoptosis sel jantung pada sampel normal, menunjukkan hasil yang rendah (15%). Sedangkan pada sampel diabetes, hasil memperlihatkan kenaikan jumlah rerata persentase apoptosis sel jantung sebanyak 61%. Kemudian pada sampel perlakuan terapi C. cassia 200 mg/kgBB (D + Cc) menunjukkan nilai yang rendah yaitu 12%. Pada hal ini memperlihatkan bahwa jumlah rerata apoptosis sel jantung pada sampel D + Cc lebih rendah jika dibandingkan dengan sampel diabetes. Namun, jumlah rerata sampel D + Cc hampir setara dengan sampel normal walaupun persentasenya berselisih 3% dengan sampel D + Cc yang relatif lebih rendah. Selanjutnya perbedaan persentase apoptosis sel jantung yang telah didapat diuji secara statistik dengan menggunakan Oneway Annova. Setelah dipastikan distribusi data persentase apoptosis sel jantung ini normal, dan juga varian datanya heterogen. Uji Oneway Annova yang didapatkan p-value 0,001, yang berarti bahwa terdapat perbedaan jumlah persentase apoptosis sel jantung yang bermakna diantara semua kelompok penelitian (Tabel 4.1). 37 Tabel 4.2 Hasil analisis Uji Oneway Annova Kelompok Mean±SD N 0,15±0,045 D 0,61±0,096 D + Cc 0,12±0,48 P value 0,001 Ket: SD = Standard deviasi, N = Normal (n=2), D = Diabetes (n=3), D+Cc200 = Diabetes dengan terapi kayu manis 200 mg/kgBB (n=3). Kemudian untuk melihat rata-rata perbedaan sampel pada dua kelompok penelitian dilakukan uji analisis Post-hoc LSD. Uji Post-hoc LSD dapat dilakukan setelah mendapat uji Oneway Annova. Tabel 4.3 Hasil analisis Uji Post-hoc LSD CI 95% Sampel Perbedaan Rerata Minimum Maksimum N vs D -46,50 -63,04 -29,96 0,001 N vs D+Cc 2,50 -14,04 19,04 0,714 D vs D+Cc 49,00 34,20 63,80 <0,001 P value Ket: CI= Confident Interval, N = Normal (n=2), D = Diabetes (n=3), D+Cc200 = Diabetes dengan terapi kayu manis 200 mg/kgBB (n=3) Hasil uji statistik menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan pada nilai rata-rata persentase jumlah apoptosis sel jantung pada sampel normal dengan sampel diabetes (p value= 0,001), yang berarti bahwa terjadi peningkatan signifikan apoptosis sel jantung pada sampel diabetes jika dibandingkan sampel normal. Selanjutnya perbandingan sampel diabetes dengan perlakuan kayu manis 200 mg/kgBB (p value < 0,001) menunjukkan penurunan jumlah apoptosis sel jantung yang signifikan pada sampel kayu manis jika dibandingkan diabetes. Sementara itu, tidak terdapat perbedaan rata-rata persentase jumlah apoptosis sel jantung pada sampel normal dengan sampel kayu manis 200 mg/kgBB (p value = 0,714). 38 (a) (a) (b) (c)(c) Gambar 4.1 Hasil pewarnaan TUNEL perbesaran 20x; (a) N = Normal (n=2), (b) D = Diabetes (n=3), (c) D+Cc = Perlakuan kayu manis 200 mg/kgBB (n=3), ( ) sel apoptosis 39 Pemberian STZ sebagai agen diabetogenik pada tikus Sprague Dawley, telah dibuktikan pada penelitian sebelumnya oleh Rachmah dkk tahun 2015 (tabel 4.1) signifikan meningkatkan kadar gula darah tikus menjadi >200 mg/kgBB (p value= 0,014).39 Dalam hal ini dapat dikatakan bahwa tikus telah mengalami DM. Kemudian penelitian ini, memperlihatkan bahwa keadaan hiperglikemia dapat meningkatkan jumlah apoptosis sel jantung (gambar 4.1 dan grafik 4.1). Keadaan hiperglikemia dapat meningkatkan produksi AGEs yang terbentuk dari reaksi nonenzimatik glukosa dan juga dari peningkatan oksidasi asam lemak di sel endotel dan jantung. Selain itu, terjadi peningkatan produksi ROS dan RNS yang akan merusak secara langsug protein dan DNA sel jantung dengan menginduksi apoptosis sel. Penelitian yang telah dilakukan oleh Abeer et al. 2014, memperlihatkan adanya peningkatan signifikan jumlah apoptosis sel jantung tikus Wistar Albino yang diinduksi STZ. Pada penelitiannya juga berhasil mengidentifikasi hubungan apoptosis sel jantung dengan overaktivitas radikal bebas, yang terlihat pada peningkatan malonaldialdehyde (MDA) dan penurunan signifikan level glutathione (GSH-PX) pada organ jantung (p <0,001).6 Pada tabel statistik (tabel 4.2 dan 4.3) dan gambar histologik (gambar 4.1), penurunan jumlah rerata apoptosis sel jantung dapat terlihat pada perlakuan kayu manis 200 mg/kgBB. Pada penelitian sebelumnya dilaporkan terdapat penurunan gula darah yang signifkan pada sampel diabetes dengan kayu manis 200 mg/kgBB (p value = 0,047).39 Pemberian kayu manis yang mengandung methyl hidroxy chalcone polymer (MHCP) yang dapat meningkatkan ekspresi peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) akan menurunkan resistensi insulin dan juga memperbaiki metabolisme glukosa, sehingga dapat mengendalikan glukosa darah pada DM. Hal ini akan menurukan produksi radikal bebas yang telah banyak dihasilkan pada keadaan hiperglikemia, sehingga secara tidak langsung kayu manis ini dapat menurunkan terjadinya apoptosis sel jantung pada DM. Selain itu, kayu manis juga dapat secara langsung mencegah apoptosis sel jantung karena kandungan cinnamaldehid mencegah pembentukan reactive oxygen species (ROS) dengan cara mengaktivasi Nrf2 pada sel jantung.28 40 Penelitian sebelumnya yang dilaporkan oleh Elobeid et al. 2013, menggunakan ekstrak kayu manis (Cinnamomum cassia) dalam waktu 6 minggu dengan dosis 200 mg/kgBB memberikan efek antihiperglikemik pada tikus jantan Wistar yang diinduksi Streptozotozin.11 Penelitian lain yang dilakukan oleh Wang et al. 2015, menggunakan cinnamaldehid dari ekstraksi C. cassia pada jantung tikus memberikan efek antioksidan yang mencegah kerusakan pada sel jantung melalui aktivasi sinyal Nrf2.28 4.2 Keterbatasan Penelitian Cinnamon cassia yang digunakan hanya satu dosis saja (200 mg/kgBB) dengan lama pemberian 28 hari sehingga data kurang bervariasi. Sampel yang diambil untuk dilakukakan pewarnaan TUNEL sangat sedikit, karena pertimbangan harga kit TUNEL yang sangat mahal. Tidak adanya kelompok normal yang diberikan perlakuan kayu manis. 41 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan pembahasan dan uji statistik pada bab sebelumnya, maka peneliti dapat menyimpulkan: Pemberian ekstrak kayu manis Cinnamomum cassia dengan dosis 200 mg/kgbb/hari yang diberikan selama 28 hari menunjukkan adanya penurunan pada indeks apoptosis sel jantung tikus diabetes melitus yang bermakna jika dibandingkan dengan kelompok diabetes tanpa terapi (pvalue 0.001). 5.2 Saran Diperlukan penilitian lebih lanjut tentang efek kayu manis Cinnamomum cassia dengan membandingkan beberapa dosis, agar dapat ditentukan kadar terbaik. Diperlukan penelitian lebih lanjut tentang efek kayu manis Cinnamomum cassia dengan sampel yang lebih banyak. 42 BAB VI KERJASAMA RISET Riset ini merupakan bagian kerjasama riset mahasiswa dan kelompok riset diabetes dan regenerasi jantung PSPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah yang di biayai oleh Kementrian Agama Republik Indonesia di bawah bimbingan dr. Flori Ratna Sari, Ph.D dan dr. Hari Hendarto, Sp.PD, PhD, FINASIM. 43 Daftar Pustaka 1. Kharroubi AT, Darwish HM. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World J Diabetes. 2015 June 25; 6(6): 850-67 2. Ramachandran A, Snehalatha C, Shetty AS, Nanditha A. Trends in prevalence of diabetes in Asian countries. World J Diabetes. 2012 June 15; 3(6): 110-17 3. International Federation of Diabetes. IDF Diabetes Atlas 6th Ed. 2013 4. Mihardja L, Soetrisno U, Soegondo S. Prevalence and clinical profile of diabetes mellitus in productive aged urban Indonesians. J Diabetes Invest. 2014;5:507–12 5. Badan Penelitian Dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan RI. Riset kesehatan dasar (Riskesdas). 2013 6. Abeer A, Noha S, Hussien. Cardiac apoptosis as a possible cause of diabetic cardiomyopathy and the protective role of alpha lipoic acid and Losartanin diabeticrats. International Journal of Advanced Research. 2014;2(11): 325-37 7. Sahib AS. Anti-diabetic and antioxidant effect of cinnamon in poorly controlled type-2 diabetic Iraqi patients: A randomized, placebo-controlled clinical trial. J Intercult Ethnopharmacol. 2016;5(2):108-13 8. Liu Q, Wang S, Cai L. Diabetic Cardiomyopathy and its Mechanism: Role of Oxidative Stress and Damage. J Diabetes Invest. 2014;5(6):623-34 9. Nurrachmayanti A. Survey Pengetahuan Dan Kepercayaan Masyarakat Kecamatan Coblong, Kota Bandung, pada Penggunaan Obat Bahan Alam dan Obat Konvensional. Bandung: ITB; 2013 10. Chan KW, Khong NM, Iqbal S, Cheng SE, Younas U, Babji AS. Cinnamon bark deodorised aqueous extract as potential natural antioxidant in meat emulsion system: a comparative study with synthetic and natural food antioxidants. J Food Sci Technol. 2014 Nov;51(11):3269–76 44 11. Elobeid MA, Virk P, Siddiqui MI, Omer SA, Amin ME, Hassan Z, et al. Antihyperglycemic Activity and Body weight effects of Extracts of Emblica officianalis, Tamarix nilotica and Cinnamon Plant in Diabetic Male Rats. Wulfenia Journal. 2013 Nov;20(11):18-31 12. American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 2013 Jan; 36(suppl 1):S67-S74 13. Perkumpulan Endokrinologi Indonesia (PERKENI). Konsensus pengelolaan dan pencegahan diabetes melitus tipe 2 di Indonesia. 2015 14. Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Simadibrata MK, Setiati S. Buku ajar ilmu penyakit dalam ed ke-5; Diabetes Melitus di Indonesia. Jakarta: Interna Publishing. 2010;h1873-929 15. Sugiyama T. Management of Gestational Diabetes Mellitus. Japan Medical Association Journal. 2011 Oct;54(5):293-300 16. Meek CL, Lewis HB, Patient C, Murphy HR, Simmons D. Diagnosis of gestational diabetes mellitus: Falling through the net. Article of Diabetologia. 2015 17. Silverthorn DU. Human physiology an integrated approach 5th ed. San Francisco: Pearson education. 2010: p737-47 18. Barrett K, Barman SM, Boitano S, Brooks HL. Ganong’s review of medical physiology 23rd ed. United states of America: The mcGraw-Hill companies. 2010:10 leave 19. Guyton AC, Hall JE. Guyton and Hall: Textbook of Medical Physiology 12th ed. Philadelpia: Saunders Elsevier. 2011:p940-54 20. Marcdante KJ, Kliegman RM, Jenson HB, Behrman RE. Nelson: Ilmu Kesehatan Anak Esensial ed ke 6. Singapora: Saunders Elsevier. 2014: h682683 45 21. Perkumpulan Endokrinologi Indonesia (PERKENI). Konsensus Pengelolaan dan Pencegahan diabetes melitus Tipe 2 di Indonesia. 2011 22. Price SA, Wilson LM. Patofisiologi : Konsep Klinis Proses-proses Penyakit. Jakarta. Penerbit Buku Kedokteran EGC. 2014:h1259-71 23. Giacco F, Brownlee M. Oxidative Stress and Diabetic Complications. Circulation Research. 2016 May;107:1058-70 24. Daswir. Profil Tanaman Kayumanis di Indonesia (Cinnamomum spp.). Jakarta: Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik;2011 25. Plantamor. Informasi spesies: Kayu Manis Cinnamomum cassia. Diunduh dari http://www.plantamor.com/index.php?plant=331 pada tanggal 20 Mei 2016 pukul 20.00 WIB 26. Versphol EJ, Bauer K, Neddermann E. Antidiabetic Effect of Cinnamomum cassia and Cinnamomum zeylanikum In vivo and In vitro. Phytoterapy Research. 2005;19: 203-6 27. Roussel AN, Hininger I, Benaraba R, Ziegenfus TN, Anderson RA. Antioxidant effect of a cinnamon extract in people with impaired fasting glucose that are overweight and obese. Jurnal of the American college of nutrition. 2009;(1):16-21 28. Wang F, Pu C, Zhou P, Wang P, Liang D, Wang Q, et al. Cinnamaldehyde Prevent Endothelial Dysfuction Induced by High Glucose by Activating Nrf2. Cellular Physiol Biochem. 2015;36:315-24 29. Wang YH, Avula B, Nanayakkara NPD, Zhao J, Khan IA. Cassia Cinnamon as a Source of Coumarin in Cinnamon-Flavored Food and Food Supplements in the United States. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2013:A-G 30. Hoehn AN. Stockert AL. The Effects of Cinnamomum Cassia on Blood Glucose Values are Greater than those of Dietary Changes Alone. Nutrition and Metabolic Insights. 2012;5:77–83 46 31. Kamble S, Rhambhimaiah S. Antidiabetec Effect of Aqueous Extract of Cinnamomum cassia in Aloxan- Induced Diabetic Rats. Biomedical and Pharmacology Journal. 2013 Feb;6(1):83-8 32. Raza H, John A. Streptozotocin-Induced Cytotoxicity, Oxidative Stress and Mitochondrial Dysfunction in Human Hepatoma HepG2 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 2012; 13:5751-67 33. Malini P, Kanchana G, Rajadurai M. Antibiabetic Efficacy Of Ellagic Acid In Streptozotocin-Induced Diabetes Mellitus In Albino Wistar Rats. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research.2011;4(3):124-8 34. Szkudelski, T. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas. Physiological Research. 2001; 50: 536-46 35. National Center for Biotechnology Information. Open Chemistry database: Streptozotocin. Diunduh dari https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5300#section=Top pada tanggal 21 mei 2016 pukul 08.20 WIB 36. Goud BJ, Dwarakanath, Swamy BKC. Streptozotocin - A Diabetogenic Agent in Animal Models. International Journal of Pharmacy and Pharmatical Research. 2015; 3(1): 253-269 37. Olokoba AB, Obateru OA, Olokoba LB. Type 2 Diabetes Mellitus: A Review of Current Trends. Oman Medical Journal. 2012;27(4):269-73 38. Pollastro, Carla, et al. Pharmacogenomics of Drug Response in Type 2 Diabetes: Toward the Definition of Tailored Therapies. Hindawi Publishing Corporation. 2015:1-10 39. Harahap RU. Efek Ekstrak Kayu Manis (Cinnamomum cassia) Terhadap Kadar Glukosa Darah, Berat Badan dan Trigliserida pada Tikus Jantan Strain Sparague dawley yang diinduksi streptozotosin (STZ). Jakarta:UIN Syarif Hidayatullah Jakarta;2014. 47 40. Ito Y, Shibata MA, Kusakabe K, Otsuki Y. Method of specific detection of apoptosis using formamide-induced DNA denaturation assay. Journal of histochemistry & cytochemistry. 2006; 54(6):683–92 41. Kyrylkova K, Kyryachenko S, Leid M, Kioussi C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Article methods in molecular biology. 2012 Jan:p1-11 42. Jena Bioscience. In cell biology: Apoptosis (TUNEL assay). Diunduh dari http://www.jenabioscience.com/cms/en/1/catalog/2205_apoptosis_tunel_assa y.html pada tanggal 29 Mei 2016 pada pukul 12.26 WIB 43. Loo DT. In situ detection of DNA damage: Methods and protocols. 2002: 2130 44. Takara Bio. In situ Apoptosis Detection Kit. Diunduh dari http://www.takara.co.kr/file/manual/pdf/mk500_e_0712.pdf pada tanggal 29 Mei 2016 pada pukul 12.36 WIB 45. Sari FR, Watanabe K, Thandavarayan RA, Harima M, Zhang S, Muslin AJ, et al. 14-3-3 Protein Protects Against Cardiac Endoplasmic Reticulum Stress (ERS) and ERS-Initiated Apoptosis in Experimental Diabetes. J Pharmacol Sci. 2010;113:325-34 46. Singh AS, Masuku MB. Sampling techniques and determination of sample size in applied statistic research: an overview. Int. J. ECM. 2014 48 LAMPIRAN Lampiran 1 Hasil Determinasi/ Identifikasi Bahan Uji Gambar 7.1 Hasil Determinasi Tanaman 49 Lampiran 2 Surat Keterangan Tikus Sehat Gambar 7.1 Surat Keterangan Tikus Sehat Gambar 7.2 Surat Keterangan Tikus Sehat 50 Lampiran 3 Gambar Proses Penelitian Gambar 7.1 Proses Inkubasi Gambar 7.2 Proses Labeling Gambar 7.4 Proses Deparafinisasi 51 Gambar 7.3 Proses Pencampuran Reagen (Lanjutan) Gambar 7.5 Proses Homogen PBS Gambar 7.6 Proses Covering Gambar 7.7 Proses Pengeringan Preparat Gambar 7.8 Proses Sterilisasi Alat Gambar 7.9 Proses Penataan Preparat Gambar 7.10 Proses Fiksasi Preparat 52 Lampiran 4 Riwayat Penulis Identitas Nama : Haidarotul Milla Jenis Kelamin : Perempuan Tempat, Tanggal Lahir : Demak, 24 Desember1995 Agama : Islam Alamat : Jln. Sultan Fatah No. 37 Demak, Jawa Tengah e-Mail : [email protected] Riwayat Pendidikan 1999-2001 : TK Muslimat NU Demak 2001-2007 : MI Sultan Fatah Demak 2007-2010 : MTs. NU Demak 20010-2013 : MA. NU Banat Kudus 2013-sekarang : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 53
