Bab III Materi dan Metode

4
hewan dan dapat ditemukan di lingkungan. Termasuk dalam kelompok ini yaitu
Salmonella, Shigella, Escherichia, Proteus danYersinia (Gillespie 2008).
Bakteri pada Ulat Sutera Bombyx mori
Sebagai perbandingan, terdapat penelitian yang memaparkan beberapa
koloni bakteri dari ulat sutera Bombyx mori yang berhasil diisolasi dan
diidentifikasi ditabulasi dalam Tabel1.
Tabel 1. Identifikasi bakteri pada ulat sutera Bombyx mori yang sakit (Sakthivel et
al. 2012)
No
1
2
3
4
5
6
7
Bakteri
Bacillus subtilis
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas fluorescence
Bacillus cereus
Klebsiella cloacae
Bombyx mori merupakan salah satu jenis ulat sutera yang juga
memberikan keuntungan ekonomis karena mampu menghasilkan benang
sutera. Ulat sutera memiliki bentuk tubuh yang berwarna putih. Ulat sutera dapat
melakukan molting (berganti kulit) pada saat memasuki instar baru. Larva ulat
sutera mempunyai tanduk anal yang pendek dan memakan daun murbei (Morus
sp.) (Borror 1992).
MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai dengan Oktober
2014. Pemeliharaan ulat sutera liar Attacus atlas dilaksanakan di Laboratorium
Metabolisme Bagian Fisiologi Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi
Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Pengamatan dan
identifikasi bakteri dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Bagian
Mikrobiologi Medis Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah imago ulat sutera liar
Attacus atlas sejumlah 5 ekor, akuades steril, media untuk mengisolasi bakteri
5
yakni agar darah, MacConkey Agar (MCA) dan trypticase soy agar (TSA). Media
untuk mengidentifikasi bakteri yakni Indol, Triple Sugar Iron Agar (TSIA),
Oksidase, Urea, Simmon’s citrate Agar, Voges-proskauer (VP) dan kaldu gulagula (glukosa, sukrosa, manitol, maltosa, dan laktosa). Bahan-bahan untuk
pewarnaan Gram yakni kristal violet, lugol, aseton alkohol, safranin, dan alkohol
70%.
Alat yang digunakan pada penelitian kali ini adalah kandang kasa berukuran
50 cm x 50 cm x 50 cm, alat bedah minor seperti pinset, gunting dan scalpel, ose,
needel, korek api, cawan petri, pipet, mikropipet, pembakar bunsen, inkubator,
tabung reaksi, botol kaca 5 ml, tabung evendorf, mikroskop cahaya, pensil, kertas
label, lemari pendingin dan kamera.
Prosedur Penelitian
Pengambilan dan penyimpanan kokon
Pengambilan kokon ulat sutera Attacus atlas dilakukan diperkebunan teh
PTPN VIII Panleujar kabupaten Purwakarta provinsi Jawa Barat. Kokon dibawa
ke Lab. Metabolisme kemudian disimpan dalam kandang kasa berukuran 50 cm X
50 cm X 50 cm. Pemisahan antara kokon betina dan jantan dilakukan dengan cara
membuka kokon dan melihat bakal antena pada pupa, antena yang besar akan
menjadi imago jantan, sedangkan antena yang kecil akan menjadi imago betina.
Pengambilan kloaka
Sampel diambil dari 5 ekor imago betina A. atlas. Imago betina A. atlas
dimasukkan ke dalam freezer selama 60 menit agar imago mati. Dilakukan
nekropsi pada imago menggunakan alat bedah minor yang sebelumnya telah
disterilkan. Pengambilan kloaka dilakukan menggunakan pinset steril lalu
dimasukkan ke dalam botol kaca yang berisi aquades steril 2 ml.
Isolasi bakteri
Sampel yang telah disiapkan diambil menggunakan ose dan dibiakkan ke
dalam agar darah dan MacConkey Agar (MCA) dengan tehnik goresan T. Agar
yang telah diinokulasi dengan sampel dimasukkan ke dalam inkubator selama 24
jam dengan suhu 370C. Setelah itu, koloni yang tumbuh dilakukan pengamatan
dan pencatatan koloninya. Setiap bentuk koloni berbeda yang terpisah dibiakkan
kembali ke agar miring trypticase soy agar (TSA) dan diberikan label agar tidak
terjadi kekeliruan. Agar miring yang telah dibiakkan dimasukkan ke dalam
inkubator selama 24 jam dengan suhu 370C.
Pewarnaan Gram
Koloni yang tumbuh pada media agar miring diwarnai dengan pewarnaan
Gram untuk melihat morfologi, sifat Gram, dan kemurniannya. Kaca objek
dibersihkan menggunakan alkohol kemudian dikeringkan dengan cara didekatkan
api bunsen. Kemudian, kaca objek ditetesi dengan aquades diatasnya. Ose dibakar
terlebih dahulu sampai berwarna merah, didinginkan sejenak lalu masukkan
kedalam tabung kaca berisi isolat bakteri kemudian tempelkan ose ke aquades
pada kaca objek. Aquades dihomogenkan perlahan dengan cara membentuk
lingkaran biarkan sejenak kemudian difiksasi dengan api bunsen dan diletakkan di
6
atas rak kaca objek. Ditetesi kristal violet dan didiamkan selama satu menit.
Dicuci dengan aquades. Ditetesi lagi dengan lugol pada kaca objek dan didiamkan
selama satu menit dan dicuci dengan aquades. Kemudian, ditetesi dengan larutan
pemucat (aseton alkohol)selama 10 detik, kemudian dicuci lagi dengan aquades.
Terakhir, ditetesi dengan safranin selama 10-20 detik lalu dicuci dengan aquades
hingga bersih. Dikeringkan kaca objek dengan kertas saring lalu diamati di bawah
mikroskop dengan perbesaran 1000x dengan bantuan minyak emersi dan
ditentukan sifat Gramnya. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu sedangkan
bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah. Jika koloni bakteri yang
terlihat belum murni, maka dilakukan kembali isolasi pada agar darah maupun
MCA dengan goresan T. Apabila hasil dari pewarnaan Gram tidak meyakinkan,
dapat dilakukan Uji KOH 3% untuk menentukan sifat Gramnya. Jika pada hasil
uji terlihat massa gelatin berupa benang-benang halus ketika diangkat
menggunakan ose artinya sampel merupakan bakteri Gram negatif. Identifikasi
Gram positif dan Gram negatif dapat dilihat dari Gambar 2 dan Gambar 3.
Bakteri
Gram
positif
Batang
kokus
Katalase
Negatif
Katalase
positif
Streptoc
occus sp.
α-hemolitik
Microco
ccaceae
β-hemolitik
γ-hemolitik
Uji
Glukosa
Mikroaer
olitik
(+)
(-)
Tanam ke
MSA
kuning
(fermentasi)
Stapylococcus
aureus
Micrococcaceae
Staphylococcus
epidermidis
Anaaero
b
Aerob
Merah
(tidak
fermentasi
Batang
kecil tidak
membent
uk spora
Batang
besar
memben
tuk spora
Clostridium
Bacillus
Tahan
asam
Mycobacterium
Tidak
tahan
asam
Listeris
Erysopelothrix
Corynebacteriu
m
Lactobacillus
Gambar 2 Diagram identifikasi bakteri Gram positif (Bergey dan Breed 1994; Lay 1994)
7
Bakteri Gram
Negatif
Batang
Kokus
Uji oksidase
(+)
(-)
Nonenterobakteriaceaae
Enterobakteriaceae
Neisseria
MacConkey Agar
Pewarnaan Zielhl
Neelsen
Pseudomonas
Aeromonas
Vibrio
Laktosa positif
Laktosa
Negatif
TSIA
Indol
Sitrat
MRVP
Fermentasi Karbohidrat
Gambar 3 Diagram identifikasi bakteri Gram negatif (Bergey dan Breed 1994; Lay 1994)
Identifikasi bakteri
Isolat dikeluarkan dari lemari pendingin dan dihangatkan dulu dalam
inkubator selama beberapa menit. Ose dibakar terlebih dahulu pada api bunsen
sampai terlihat merah, didinginkan beberapa saat lalu disentuhkan dengan isolat
yang telah disiapkan kemudian ditanam ke setiap media identifikasi seperti indol,
tripel sugar iron agar (TSIA), oksidase, urea, Simmon’s citrate agar, vogesproskauer (VP) serta kaldu gula-gula yang terdiri atas glukosa, sukrosa, manitol,
maltosa dan laktosa Setelah itu, dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam
pada suhu 370C.
Analisis Data
Analisis data menggunakan metode deskripsi.