tyuioojh - Repository Unhas

AMPLIFIKASI DAN SEKUENSING GEN ESAT-6 DARI Mycobacterium tuberculosis
SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN TUBERKULOSIS
Oleh : Rosana Agus*, Agnes Kwenang**, Ernawati G.Rachman*** dan Debbie S.R****
* Biologi FMIPA UNHAS ** FK UNHAS *** Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati ITB
**** Sekolah Farmasi ITB
ABSTRAK
Sampai saat ini, vaksin BCG untuk mencegah tuberkulosis tidak berhasil, karena tetap
tingginya penderita tuberkulosis di dunia. Demikian pula di Indonesia, walaupun hampir semua
penduduk Indonesia telah divaksinasi dengan BCG, namun jumlah penderita tuberkulosis selalu
meningkat dan menjadikan Indonesia pada peringkat ketiga tertinggi di dunia setelah India dan
Cina. Oleh karena itu, diperlukan pengganti vaksin BCG yang efektif sehingga pemberantasan
tuberkulosis dapat dilakukan.
Salah satu antigen yang banyak diteliti sebagai kandidat vaksin tuberkulosis adalah early
secreted antigen target yang berbobot molekul 6 kDa (ESAT-6). Protein ini disekresikan oleh M.
tuberculosis pada fase awal dari pertumbuhannya, dan telah dibuktikan dapat menginduksi
produksi interferon gamma (INF) oleh sel T CD8. INF ini dapat mengaktivasi makrofag yang
terinfeksi M. tuberculosis untuk membunuh bakteri tersebut.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengamplifikasi gen ESAT-6 M.tuberculosis dan
mengurutkan urutan nukleotidanya dengan sekuensing. Tahapan penelitian yang digunakan
adalah pengumpulan sampel dari beberapa daerah di Indonesia, mengisolasi DNA genom M.
tuberculosis dengan metode Boom, merancang primer ESAT-6, mengamplifikasi dengan PCR
dan analisis data sekuensing dilakukan dengan BLAST.
Hasil penelitian diperoleh gen pengkode ESAT-6 M. tuberculosis dengan ukuran 285 bp
dan dari analis sekuensing menunjukkan bahwa urutan nukleotida dan urutan asam amino yang
dideduksi memiliki tingkat konservasi yang tinggi, yaitu 95 – 100%..
Kata kunci : ESAT-6, Mycobacterium .tuberculosis, kandidat vaksin
I. PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Tuberkulosis merupakan salah satu masalah dalam bidang kesehatan, karena berada di
antara sepuluh penyebab tertinggi kematian di dunia. Sekitar sepertiga dari populasi dunia
terinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis. Setiap tahun, sekitar 8 juta orang yang terinfeksi
berkembang menjadi penyakit aktif dan 2 juta diantaranya meninggal karena tuberkulosis. Sekitar
10% dari kasus infeksi Mycobacterium tuberculosis di dunia ditemukan di Indonesia, dan
menempatkan Indonesia di posisii ketiga setelah India dan Cina. Indonesia berlokasi di daerah
yang merupakan kondisi terbaik bagi perkembangan Hal lain adalah meningkatnya jumlah
penderita HIV dan adanya resistensi multidrug M. tuberculosis menyebabkan penderita
tuberkulosis semakin bertambah. Oleh karenanya, vaksin yang efektif dan terjangkau serta
metoda diagnostik yang tepat diperlukan untuk mengatasi situasi ini.
Sejauh ini vaksin yang telah digunakan secara luas untuk imunisasi tuberculosis adalah
vaksin BCG (von Reyn, et.al, 2002). Vaksin ini terdiri dari sel hidup Mycobacterium bovis galur
BCG (Bacille Calmette- Guerin) yang telah dilemahkan. Namun saat ini telah diketahui bahwa
vaksin BCG tidak efektif. Beberapa usaha telah dilakukan untuk mengembangkan vaksin baru
( von Reyn, et.al, 2002, Mustafa Abu & Al Attiyah, 2003) yang difokuskan pada identifikasi
antigen Mycobacterium tuberculosis sebagai vaksin sub unit potensial.
Ruang lingkup penelitian ini adalah mencari antigen yang menginduksi respons selular
dan humoral yang terdapat pada M. tuberculosis tetapi tidak terdapat pada M. bovis galur BGG.
Antigen yang dipilih dalam penelitian ini adalah ESAT-6 M . tuberculosis yang diperoleh dari
isolat klinis yang telah dikoleksi sebelumnya.
ESAT-6 (early secretory antigenic target)) dikode oleh gen Rv3874. Dalam penelitian
yang menggunakan pendekatan hibridisasi Southern, diketahui bahwa gen pengkode ESAT-6
terdapat pada M. tuberculosis, M. africanum, M. marinum, M. leprae, M. bovis, M. gastri, M.
kansasii tetapi tidak ditemukan pada M. bovis galur BCG (Colangeli, R.et al., 2000 dan Geluk,
A. et.al., 2004). Protein ini telah banyak digunakan sebagai antigen dalam uji pengenalan sistem
imunitas. Penelitian lain juga menunjukkan bahwa ESAT-6 merupakan antigen sel B yang kuat.
ESAT-6 juga telah diketahui mengenali sera dari semua hewan terinfeksi (Daugelat, S. et.al.,
2003; Mustafa et al., 2002). Ketika diujikan ke serum penderita dan subjek kontrol (penderita
yang terinfeksi oleh Mycobacterium lain selain M. tuberculosis dan orang sehat), diketahui
bahwa 25% penderita tuberkulosis membentuk antibodi, namun tidak ada antibodi terhadap
ESAT-6 untuk subjek kontrol.
II. TUJUAN PENELITIAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi dan mengurutkan urutan nukleotida gen pengkode
ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis sebagai kandidat vaksin tuberkulosis
III. METODE PENELITIAN
III.1 Bahan dan alat yang digunakan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium Lowenstein Jensen, M.
tuberculosis, bufer L6, bufer L2, celite, etanol 70%, aceton, bufer TE, bufer PCR, dNTP, Taq
polimerase, agarosa, DNA ladder, primer ESAT-6, kit GFX. Sedang alat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah tabung eppendorf, vortex, microcentrifuge, mesin PCR, kolom GFX, collect
tube
III.2 Prosedur Kerja
a. Pengambilan sampel
Sampel penderita TB berupa sputum diperoleh dari Makassar, Jakarta, Surabaya,
Jogyakarta dan Semarang. Sputum tersebut kemudian didekontaminasi dan ditumbuhkan
dalam medium Lowenstein Jensen. Selanjutnya dilakukan pewarnaan Zn untuk menguji
keberadaan M. tuberculosis.
b. Isolasi DNA kromosom
Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode Boom dengan celite yang akan
mengikat DNA. Ke dalam sampel ditambahkan buffer lisis
L6, dan suspensi Celite.
Pencucian dilakukan dengan menambahkan buffer L2, kemudian etanol 70% dan aseton.
Terakhir DNA dilarutkan dalam buffer TE.
c. Perancangan dan sintesis primer untuk amplifikasi orf ESAT-6 Mycobacterium
tuberculosis
Perancangan primer dilakukan dengan bantuan program komputer DNA star berdasarkan
urutan nukleotida gen pengkode ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis (No akses :
AF420491) yang terdapat pada bank data di National Centre for Biotechnology Information
(NCBI, Bethesda, MS, USA).
d. Amplifikasi orf ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis menggunakan PCR
Amplifikasi orf ESAT-6 dari Mycobacterium tuberculosis dilakukan dengan menggunakan
PCR. Templat yang digunakan adalah hasil isolasi DNA kromosom Mycobacterium
tuberculosis isolat Makassar yang telah diperoleh sebelumnya dengan primer yang telah
dirancang. Produk PCR yang diharapkan berukuran 285 bp, dan akan dikarakterisasi
dengan elektroforesis gel agarosa
e. Pemurnian DNA
Produk PCR sebelum disekuensing terlebih dahulu dimurnikan dengan menggunakan
kolom GFX, dengan tujuan menghilangkan kemungkinan adanya kontaminan pada saat
amplifikasi
f. Sekuensing DNA ESAT-6
Produk PCR disekuensing dua arah menggunakan primer yang sama pada saat amplifikasi,
dan untuk menguji kebenarannya dilakukan dengan membandingkan dengan sekuens
ESAT-6 yang diakses dari NCBI (dengan BLAST)
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Pengambilan Sampel
Sampel penderita TB berupa sputum yang diperoleh dari beberapa kota di Indonesia, dan
setelah pewarnaan Zn diperoleh sampel adalah positif Mycobacterium tuberculosis seperti
pada gambar 1.
Gambar 1. Mycobacterium tuberculosis setelah pewarnaan Zn (warna merah)
IV.2 Isolasi DNA kromosom Mycobacterium tuberculosis
Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan metode Boom, dan DNA akan terikat oleh
celite, sehingga DNA kromosom yang diperoleh lebih murni.
IV.3 Amplifikasi orf ESAT-6 M.tuberculosis menggunakan PCR
Dari gambar 2 terlihat bahwa produk PCR yang diperoleh hanya satu pita dengan ukuran
285 bp. Hal ini terlihat pada kolom 1 dan terakhir dari gel agarosa adalah marka DNA
ladder 100 bp. Produk PCR ini selanjutnya dimurnikan dengan kit GFX sebelum dilakukan
sekuensing.
Gambar 2. Produk PCR dari ESAT-6 berukuran 285 bp
IV.4 Sekuensing DNA
Hasil sekuensing menunjukkan bahwa gen ESAT-6 yang diperoleh memiliki tingkat
homologi 95-100%, seperti dalam tabel 1.
Tabel 1. Hasil analisis sekuensing dan analisis kemiripan ESAT-6 dari beberapa daerah
`
Kode Sampel
Daerah asal
Homologi dengan H37Rv
JK1, JK2, JK3, JK4
Sm1, Sm2, Sm3, Sm4
Sb1, Sb2, Sb3, Sb4
Jg1, Jg2, Jg3, Jg4
Mk1, Mk2, Mk3, Mk4
Jakarta
Semarang
Surabaya
Jogyakarta
Makassar
95 – 100%
96 – 100%
97 – 98%
97 – 98%
97-100%
Dari tabel terlihat bahwa gen ESAT-6 M.tuberculosis dari beberapa daerah memiliki
homologi yang tinggi yaitu antara 95-100%. Hal ini berarti bahwa gen tersebut sangat
dikonservasi, sehingga dapat digunakan sebagai antigen vaksin tuberkulosis.
Hasil sekuensing, urutan nukleotida dan analisis dengan BLAST dapat dilihat pada gambar
berikut.
Gambar 3. Hasil sekuensing Isolat Jakarta 1
Dari hasil sekuensing tersebut dapat dilihat urutan nukleotida dari isolat Jakarta 1 adalah
sebagai berikut :
TTCTGGGGATGAGGCGCGGCAGCGCATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTC
ATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCC
TGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGG
ACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGAC
GATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTG
GGATGTTCGCATAGCTCGAGAA
Gambar 4. Urutan nukleotida isolat Jakarta 1
Selanjutnya dilakukan analisis BLAST seperti pada gambar berikut :
Gambar 5. Hasil BLAST dari Isolat Jakarta 1
Dari gambar terlihat bahwa isolat Jakarta memiliki homologi 97 %. Hal ini berarti bahwa
gen tersebut sangat dikonservasi.
V. KESIMPULAN
Gen pengkode ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis telah berhasil diamplifikasi dengan
PCR dengan ukuran 285 bp. Data sekuensing menunjukkan adanya tingkat homologi yang tinggi
yaitu 95-100%. Hal ini berarti bahwa gen ESAT-6 sangat dikonservasi, sehingga dapat digunakan
sebagai antigen vaksin tuberkulosis.
Ucapan Terima Kasih
Ppeneliti ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada Lembaga Biologi Molekular
Eijkman dan Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan yang telah
mendanai penelitian ini melalui Risbin Iptekdok 2006=2007.
DAFTAR PUSTAKA
1.
Al-Attiyah, R., A. Mustafa, A.T. Abal, N.M, Madi and P. Andersen 2003, Restoration
of mycobacterial antigen-induced proliferation and interferon-gamma responses in
peripheral blood mononuclear cells of tuberculosis patients upon effective chemotherapy,
FEMS Immunol Med Microbiol 38 : 249 - 256
2.
Colangeli, R., J.S Spencer, P. Bifani, A. Williams, K. Lyashchenko, M.A. Keen, P.j.
Hill, J. Belisle, M.L. Gennaro, 2000. MTSA-10, the product of the Rv3874 gene of
Mycobacterium tuberculosis, elicit tuberculosis-spesific, Delayed-Type Hypersensitivity
in Guinea Pigs, Infect Immun, 2000 Feb, 68 (2) : 990-993
3.
Daugelat, S.J. Kowell, J.Mattow, D. Bumann, R. Winter, R.Hurwitz and S.H
Kaufmann, 2003. The RD1 proteins orf Mycobacterium tuberculosis; expression in
Mycobacterium smegmatis and biochemicals characterization microbes Infect Immun 5;
1082-1095
4.
Geluk, A., K.E. van Meijgaarden, K.L. Franken, B. wieles, S.M. arend, W.R. Faber,
B. Naafs, T.H. Ottenhoff, 1997, Immunological crossreactivity of the Mycobacterium
leprae CFP-10 with its homologue in Mycobacterium tuberculosis, lize the Coiled-Coil
Conformation, Biochemistry, 30, 8107-8113
5.
Mustafa Abu., S and R. Al-Attiyah, 2003. Tuberculosis : looking beyond BCG
vaccines, J. Postgrad Med 49 : 134 – 140
6.
Mustafa, A.S, P.J Cockle, F. Shaban, R.G. Hewinson, H.M Vordermeier, 2002,
Immunogenicity of Mycobacterium tuberculosis RD1 region gene products in infected
cattle, Clin. Exp Immunol, Oct, 130 (1) : 37 – 42
7.
von Reyn, C,F., and J.M.Vuola.2002. New vaccines for thye prevention of tuberculosis.
Clin Infect Dis 35:465-474.