ABSTRAK Sifat Fungsional Lactobacillus rhamnosus SKG34 dan
advertisement
ABSTRAK Sifat Fungsional Lactobacillus rhamnosus SKG34 dan Lactobacillus rhamnosus FBB42 Sebagai Antioksidan Dan Penurun Kolesterol Darah Secara In Vivo Fakta terbaru menujukkan bahwa pola konsumsi pangan masyarakat modern telah mulai mengalami pergeseran ditandai dengan semakin meningkatnya konsumsi pangan cepat saji dengan kandungan lemak tinggi dan rendah serat. Makanan berlemak dapat meningkatkan kadar kolesterol darah dan juga dapat menjadi sumber radikal bebas. Bakteri asam laktat (BAL) telah banyak dimanfaatkan oleh industri pangan untuk menciptakan produk pangan fungsional untuk memelihara kesehatan saluran pencernaan manusia, misalnya sebagai probiotik. Potensi menyehatkan dari probiotik diantaranya dapat menurunkan kolesterol dan sebagai antioksidan. L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 merupakan strain BAL yang mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai probiotik, sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengeksplorasi sifat fungsional dari kedua strain ini sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah, untuk memberi potensi baru pada probiotik isolat lokal dalam pengembangan pangan fungsional. Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap; tahap pertama merupakan tahapan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 secara in vitro. Tahap kedua adalah untuk menguji apakah L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dapat bertahan dalam keadaan hidup pada saluran pencernaan tikus serta menguji sifat fungsional dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah secara in vivo pada tikus putih dengan pemberian pakan tinggi lemak. Penelitian tahap kedua menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) sederhana dengan 4 perlakuan yaitu: Pakan tinggi lemak (HF), Pakan tinggi lemak dan L. rhamnosus SKG34 (HF-SKG34), Pakan tinggi lemak dan L. rhamnosus FBB42 (HF-FBB42), dan Pakan tinggi lemak dan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 (HF-SKG34-FBB42). Perlakuan probiotik diberikan selama 4 minggu. Hasil penelitian tahap pertama menunjukkan bahwa Kemampuan L. rhamnosus SKG34 dalam menghambat peroksidasi lipid, mengikat ion logam Fe, menangkap radikal hidroksil (OH•), dan aktivitas enzim superoxida dismutase (SOD) berturut-turut sebesar 52,12%, 32,15%, 25,06%, dan 66,15% serta L. rhamnosus FBB42 berturutturut sebesar 49,77%, 22,48%, 23,95% dan 56,50%. Hasil penelitian tahap kedua menunjukkan bahwa L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 mampu bertahan hidup dalam saluran pencernaan tikus. Berat konsumsi pakan per hari, total pakan, dan penambahan berat badan tikus, pH sekum, dan total BAL berbeda tidak nyata (P>0,05) antar grup perlakuan. Total BAL meningkat setelah diberi perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dan pH sekum berkisar dari 6,64 sampai dengan 6,57. Perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap penurunan kadar TC, i LDL, dan TG, peningkatan kadar HDL pada serum, peningkatan aktivitas enzim SOD dan GPx pada hati dan penurunan kadar MDA pada hati dan serum tikus yang diberi pakan tinggi lemak. Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 mempunyai sifat fungsional sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah dan sifat fungsional dari L. rhamnosus SKG34 lebih baik dibandingkan dengan L. rhamnosus FBB42. Kata Kunci: Probiotik, L. rhamnosus, kolesterol, antioksidan ii ABSTRACT Functional properties of Lactobacillus rhamnosus SKG34 and Lactobacillus rhamnosus FBB42 as Antioxidants and As Agents to Reduce Blood Cholesterol Level In Vivo Recent evident shows that food consumption pattern in modern society is determined by increasing fast food, which contains high fat and low fiber. Consumption of high fat containing foods increase blood cholesterol level and the main sources of free radicals. These are proved associated with high blood pressure and oxidative streess-related diseases. The lactic acid bacteria (LAB) has been used as probiotic to improve blood chlosterol level and as an antioxidative (antioxidant) to improve human health through modulation of human gastrointestinal microbiota. Since a succesful-probiotic is strain dependent, it is gaining interest to explore the Indonesian indigenous lactobacilli as a cholesterol lowering and an antioxidative probiotics. Lactobacillus rhamnosus SKG34 and Lactobacillus rhamnosus FBB42 has been screened and meet requiements for candidate of probiotics. Therefore, it is worthy to investigate the functional properties of both strains especially in antioxidant and cholesterol lowering activities in order to develop a functional foods. This research was carried out in two steps both in vitro and in vivo studies. The first step was aimed to find out the antioxidantive capabilitiy of L. rhamnosus SKG34 and L. rhamnosus FBB42 by determining their ability for inhibiting lipid peroxidation, chelating Fe ions, scavenging ability of hydroxyl radical (OH •), and activity of superoxida dismutase (SOD) enzyme. The second step was to find out the resistant of L. rhamnosus SKG34 and L. rhamnosus FBB42 in gastrointestinal tract and their functionality as antioxidant and cholesterol lowering probiotics, which was performed by feeding rats with high fat containing diet. The second step of research was performed using simple randomized block design (RBD) with 4 treatments, namely rats feeding a high fat diet (HF), rats feeding high fat diet and L. rhamnosus SKG34 (HF-SKG34), rats feeding high fat diet and L. rhamnosus FBB42 (HF-FBB42) and rats feeding high fat diet and L. rhamnosus SKG34 and L. rhamnosus FBB42 (HF-SKG34FBB42). Administrtaion of pobiotics were performed for 4 weeks. The results of the first step research showed that the ability of L. rhamnosus SKG34 in inhibiting lipid peroxidation, chelating Fe ions, the hydroxyl radical (OH •) scavenging ability, and superoxide dismutase (SOD) enzyme activity were 52.12%, 32.15%, 25.06%, and 66.15%, respectively, while the abilities of L. rhamnosus FBB42 in those parameters of the first step study above were 49.77%, 22.48%, 23.95% and 56.50%, respectively. The results of the second step showed that L. rhamnosus SKG34 and L. rhamnosus FBB42 were able to survive in the gastrointestinal tract of rats. Total consumption of diet per day, the total diet, and body weight gain of rats, the pH of the cecum, and LAB population was not significantly different (P>0.05) between treatment iii groups. Population of LAB increased after L. rhamnosus SKG34 and L. rhamnosus FBB42 administration, resulted in slightly decreased in cecal pH from pH 6.64 before administration to pH 6.57 after administration. Adminstration of L. rhamnosus SKG34 and L. rhamnosus FBB42 significantly (P <0.05) decreased serum levels of TC, LDL and TG, increased HDL levels, increased liver SOD and GPx activities and decreased MDA levels both in serum and in liver of rat fed a high-fat diet. These results can be concluded that L. rhamnosus SKG34 and L. rhamnosus FBB42 are promising antioxidative and cholesterol lowering probiotics, where L. rhamnosus SKG34 showed better functionality than L. rhamnosus FBB42. Key word: Probiotic, L. rhamnosus, cholesterol, antioxidant iv RINGKASAN Dewasa ini informasi dan teknologi berkembang dengan pesat sehingga menimbulkan kecendrungan perubahan pola makan. Masyarakat modern cenderung mengkonsumsi pangan cepat saji dengan kandungan lemak tinggi dan rendah serat. Makanan berlemak dapat meningkatkan kadar kolesterol darah dan juga dapat menjadi sumber radikal bebas. Bakteri asam laktat (BAL) telah banyak dimanfaatkan oleh industri pangan untuk menciptakan produk pangan fungsional untuk memelihara kesehatan saluran pencernaan manusia, yang dikenal dengan istilah probiotik. Potensi menyehatkan dari probiotik diantaranya dapat menurunkan kolesterol dan sebagai antioksidan. L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 merupakan strain BAL yang mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai probiotik, sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengeksplorasi sifat fungsional dari kedua strain ini sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah, untuk memberi potensi baru pada probiotik isolat lokal dalam pengembangan pangan fungsional. Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap; tahap pertama merupakan tahapan untuk menguji aktivitas antioksidan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 secara in vitro. Variabel yang diamati pada penelitian tahap pertama meliputi: penghambatan peroksidasi lipid berdasarkan penghambatan peroksidasi asam linoleat menurut metode Kapila et al., (2006), aktivitas penangkapan radikal hidroksil ditentukan dengan metode yang dijelaskan oleh de Avellar et al. (2004), aktivitas pengikatan ion logam Fe diuji dengan mengukur pembentukan kompleks besi-ferrozine v (Kim et al., 2005), dan aktivitas enzim SOD menggunakan kit merek BioVision yang tersedia secara komersial (Kim et al., 2005). Data disajikan dalam bentuk tabel dan dibahas secara diskriptif. Penelitian tahap kedua adalah untuk menguji apakah L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dapat bertahan dalam keadaan hidup pada saluran pencernaan tikus serta menguji sifat fungsional dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah secara in vivo pada tikus putih dengan pemberian pakan tinggi lemak. Penelitian tahap kedua menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) sederhana dengan 4 perlakuan yaitu: Pakan tinggi lemak (HF), Pakan tinggi lemak dan L. rhamnosus SKG34 (HF-SKG34), Pakan lemak tinggi dan L. rhamnosus FBB42 (HF-FBB42), dan Pakan tinggi lemak dan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 (HF-SKG34-FBB42). Penelitian ini menggunakan tikus putih strain Wistar umur 3-4 minggu dengan berat kurang lebih 80 g. Setiap perlakuan terdiri dari 6 ekor tikus yang masing-masing diberikan pakan dan probiotik sesuai perlakuan selama 4 minggu. Variabel yang diamati pada penelitian tahap ke dua meliputi: ketahanan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 pada sekum dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk L. rhamnosus (Song et al., 2000), total bakteri asam laktat (Fardiaz, 1993), pH sekum, profil lipid pada serum (total kolesterol, HDL, LDL dan trigliserida) dengan menggunakan KIT merek DiaSys, aktivitas enzim antioksidan pada hati meliputi; enzim SOD dan GPx menggunakan Kit vi merek BioVision, kadar MDA pada hati dan serum diukur mengunakan metode menurut Tokur et al. (2006). Hasil penelitian tahap pertama menunjukkan bahwa kemampuan L. rhamnosus SKG34 dalam menghambat peroksidasi lipid, mengikat ion logam Fe (Fe2+), menangkap radikal hidroksil (OH•), dan aktivitas enzim superoxida dismutase (SOD) berturut-turut sebesar 52,12%, 32,15%, 25,06%, dan 66,15%, serta L. rhamnosus FBB42 berturut-turut sebesar 49,77%, 22,48%, 23,95%, dan 56,50%. Hasil penelitian tahap kedua menunjukkan bahwa L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 mampu bertahan hidup dalam saluran pencernaan tikus. Berat konsumsi pakan per hari, total pakan, dan penambahan berat tikus, pH sekum, dan total BAL berbeda tidak nyata (P>0,05) antar grup perlakuan. Total BAL meningkat setelah diberi perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dan pH sekum sedikit mengalami penurunan dari 6,64 sampai dengan 6,57. Perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap penurunan kadar TC, LDL, dan TG, peningkatan kadar HDL pada serum. Dibandingkan dengan perlakuan HF, perlakuan HF-SKG34 dapat menurunkan TC sebesar 13,60%, TG sebesar 28,82%, LDL sebesar 71,22% dan meningkatkan HDL sebesar 15,29%. Perlakuan HF-FBB42 dapat menurunkan TC sebesar 16,22%, TG sebesar 20,76%, LDL sebesar 66,01 % dan meningkatkan HDL sebesar 8,71%. Sementara pemberian dua probiotik L. rhamnosus secara bersamaan HF-SKG34-FBB42, menurunkan TC sebesar 13,32%, TG sebesar 23,17%, LDL sebesar 72,18% dan meningkatkan HDL sebesar 15,23%. Perlakuan vii L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 secara nyata (P<0,05) meningkatkan aktivitas enzim SOD dan GPx pada hati tikus dengan pakan tinggi lemak. Perlakuan HF-SKG34 dapat meningkatkan aktivitas enzim SOD pada hati sebesar 33,95%, HFFBB42 sebesar 19,46% dan HF-SKG34-FBB42 sebesar 30,48%. Aktivitas enzim GPx pada hati meningkat 2,03 kali pada perlakuan HF-SKG34 dan 2.08 kali pada perlakuan HF-SKG34-FBB42, sedangkan HF-FBB42 meningkatkan aktifitas enzim GPx 1,38 kali. Perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dapat menurunkan kadar MDA pada hati dan serum tikus. Dibandingkan dengan perlakuan HF, HFSKG34 dapat menurunkan kadar MDA sebesar 28,67% pada hati dan 37,40% pada serum, HF-FBB42 sebesar 45,03% pada hati dan 19,62% pada serum, dan HF- SKG34-FBB42 sebesar 46,09% pada hati dan 25,89% pada serum tikus. Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 mempunyai sifat fungsional sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah dan sifat fungsional dari L. rhamnosus SKG34 lebih baik dibandingkan dengan L. rhamnosus FBB42. viii DAFTAR ISI Hal. SAMPUL DALAM …….…………………………………………………….. i PRASYARAT GELAR ………………………………………………………. ii LEMBAR PENGESAHAN ………………………………………………….. iii SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ………………………………. iv PENETAPAN PANITIA PENGUJI …………………………………………. v UCAPAN TERIMA KASIH …………………………………………………. vi ABSTRAK …………………………………………………………………… viii ABSTRACT ………………………………………………………………….. x RINGKASAN ………………………………………………………………... xii DAFTAR ISI ………………………………………………………………... xvi DAFTAR TABEL …………………………………………………………… xix DAFTARA GAMBAR ……………………………………………………… xx DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………………. xxii BAB I PENDAHULUAN …………………………………………………... 1 1.1 Latar Belakang ………………………………………………….. 1 1.2 Rumusan Masalah ……………………………………………..... 5 1.3 Tujuan Penelitian ……………………………………………….. 6 1.4 Manfaat Penelitian ……………………………………………… 7 BAB II KAJIAN PUSTAKA ……………………………………………….. 8 2.1 Bakteri Asam Laktat (BAL) ……………………………………. 8 2.2 Probiotik ………………………………………………………... 9 2.3 Antioksidan ……………………………………………………... 13 2.4 Lipoprotein ……………………………………………………… 18 2.3. Efek Fungsional Probiotik ……………………………………… 26 2.3.1. Menurunkan kolesterol …………………………………... 26 2.3.2. Aktivitas antioksidan dari probiotik ……………………... 30 ix BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS ………… 34 3.1. Kerangka Berpikir ……………………………………………… 34 3.2. Konsep Penelitian ………………………………………………. 37 3.3. Hipotesis Penelitian …………………………………………….. 40 BAB IV METODE PENELITIAN …………………………………............. 41 4.1 Rancangan Penelitian …………………………………………… 41 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian …………………………………… 41 4.3 Penentuan Sumber Data ………………………………………… 42 4.4 Variabel Penelitian ………………………………………………. 43 4.5 Bahan Penelitian ………………………………………………... 43 4.5.1 Subyek penelitian ………………………………………... 43 4.5.2 Bahan penelitian ………………………………………….. 44 4.6 Instrumen Penelitian …………………………………………….. 44 4.7 Penelitian Tahap Pertama : Menguji aktivitas antioksidan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 secara in vitro ...... 4.7.1 Subyek penelitian ………………………………………… 45 45 4.7.2 Variabel penelitian ……………………………………….. 45 4.7.3 Prosedur penelitian ……………………………………….. 46 4.8 Penelitian Tahap kedua : Ketahanan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dalam Saluran Pencernaan Tikus dan Sifat Fungsional sebagai Antioksidan dan Penurun Kolesterol Darah Secara in vivo pada Tikus Putih dengan Pakan Tinggi Lemak. 51 4.8.1 Rancangan penelitian ............................................................ 51 4.8.2 Pelaksanaan penelitian …………………………………….. 52 4.8.3 Variabel yang diamati ........................................................... 56 4.8.4 Analisis data ………………………………………………. 66 BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN …………………………………….. 67 5.1 Aktivitas Antioksidan dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 Secara in vitro ............................................... 67 x 5.1.1 Kemampuan menghambat peroksidasi lipid ……………... 68 5.1.2 Kemampuan mengikat ion logam Fe ……………………... 69 5.1.2 Kemampuan menangkap radikal hidroksil ………………. 71 5.1.3 Aktivitas enzim superoxide dismutase (SOD) ………….. 72 5.2. Ketahanan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dalam saluran pencernaan tikus dan sifat fungsional sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah secara in vivo pada tikus putih dengan pakan tinggi lemak ......................................... 73 5.2.1 Kondisi hewan coba ……………………………………... 74 5.2.2 pH sekum, total bakteri asam laktat, ketahanan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dalam saluran pencernaan tikus …………………………………. 76 5.2.3 Profil lipid ………………………………………………... 80 5.2.4 Aktivitas antioksidan ……………………………………... 85 5.3 Temuan Baru (Novelty) ………………………………………….. 91 BAB VII. SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………. 92 6.1 Simpulan ……………………………………………………….... 92 6.2 Saran …………………………………………………………….. 93 DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………... 94 xi DAFTAR TABEL No Hal 2.1 Mikroorganisme yang digunakan sebagai probiotik …………………… 9 2.2 Strain probiotik yang dapat menurunkan kadar kolesterol …………….. 26 4.1 Komposisi pakan tikus (g/kg) ………………………………………… 52 5.1 Aktivitas antioksidan dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 secara in vitro ………………………………………………… 68 Total pakan, berat konsumsi pakan per hari dan penambahan berat tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi ……………………………………………. 75 Nilai pH dan total bakteri asam laktat (BAL) pada sekum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi …………………………………………………… 76 Profil lipid pada serum dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi ………………………… 81 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) dan gluthatione peroksidase (GPx) pada hati tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi ………….. Kadar malondialdehyde (MDA) pada hati dan serum darah tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi …………………………………………………… xii 86 89 DAFTAR GAMBAR No. 2.1 Hal Mekanisme enzim antioksidan dalam menangkal radikal bebas (Krishnamurthy dan Wadhwani, 2012) ……………………………….. 18 2.2 Struktur lipoprotein (Jhon-Sy, 2008) …………………………………. 19 2.3 Metabolisme lipoprotein (Kwiterovich, 2000) ……………………… 24 2.4 Sintesis garam empedu dari kolesterol (Li, 2012) ……………………. 25 2.5 Dekonjugasi garam empedu (Lye et al., 2009) ……………………….. 28 3.1 Konsep penelitian sifat fungsional dari probiotik …………………… 39 4.1 Tahapan penelitian sifat fungsional L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 …………………………………………………….. 42 4.2 Persiapan masa sel L. rhamnosus SKG34 dan L.rhamnosus FBB42. (A) Koloni L. rhamnosus SKG34; (B) Koloni L.rhamnosus FBB42; (C) Isolat dalam MRS broth; (D) Konsentrasi sel dalam suspensi sebanyak +108cfu/ml ............................................................................ 54 Persiapan Tikus percobaan. (A) Tikus putih jenis wistar; (B) Tikus dalam kandang individual; (C) Tikus putih dalam kandang percobaan; (D) Pemberian probiotik ad libitum……………………………………. 55 Skema penelitian dengan hewan coba. (PS) Pakan standar; (HF) Pakan lemak tinggi; (SKG34) L. rhamnosus SKG34; (FBB42) L. rhamnosus FBB42. ................................................................................................. 55 5.1 Perubahan berat badan tikus selama 7 minggu ……………………… 75 5.2 Hasil PCR bakteri sekum tikus yang diberi perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi. A = HF; B = HF-SKG34; C = HF-FBB42; D = HF-SKG34-FBB42; M = Marker 100bp ladder; K+1 = Kontrol positif L. rhamnosus SKG34; dan K+2 = Kontrol positif L. rhamnosus FBB42 ……………………. 79 4.3 4.4 xiii 5.3 Profil lipid pada serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi. A: total kolesterol, B:trigliserida, C: LDL, dan D: HDL. Huruf yang sama diatas batang menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (p >0.05, n = 6) ……………………………………………………………………… xiv 83 DAFTAR LAMPIRAN No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hal. Data penghambatan peroksidasi lipid (%) dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 …………………………………………… 103 Data kemampuan mengikat logam Fe (%)dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ……………………………………............ 104 Data kemampuan menangkap radikal hidroksil (%)dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 …………………… 105 Data aktivitas enzim superoxida dismutase (SOD) (%) dari L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 …………………… 106 Kelaikan etik/ ethical clearance penggunaan hewan dalam penelitian dan pendidikan …………………………………………………… 107 Data dan analisis statistik berat konsumsi pakan per hari (g) dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ………... 108 Data dan analisis statistik total berat pakan (g) tikus dengan Perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ……… 110 Data dan analisis statistik berat tikus pada akhir perlakuan (g) dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 112 Data dan analisis statistik penambahan berat tikus (g) dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ……… 114 Data dan analisis statistik pH sekum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 …………………… 116 xv 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Data total bakteri asam laktat (BAL) cfu/g Sekum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ………... 118 Data dan analisis statistik total kolesterol serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ………… 119 Data dan analisis statistik trigliserida (TG) serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ………… 121 Data dan analisis statistik high density lipoprotein (HDL) serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 123 Data dan analisis statistik low density lipoprotein (LDL) serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 125 Data dan analisis statistik rasio total kolesterol/HDL serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 127 Data dan analisis statistik rasio rasio TG/HDL serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ……… 129 Data dan analisis statistik rasio rasio LDL/HDL serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ……… 131 Data aktvitas enzim superoksida dismutase (SOD) pada hati tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 .. 133 Data aktvitas enzim glutathione peroksidase (GPx) pada hati tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 135 Data dan analisis satistik kadar MDA pada hati tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ………... 138 xvi 22 Data dan analisis satistik kadar MDA pada serum tikus dengan perlakuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ………… 141 Foto pengujian aktivitas antioksidan oleh L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 secara in vitro ……………………………… 143 24 Foto bahan dan proses pembuatan pakan tikus ……………………... 145 25 Foto persiapan tikus percobaan …………………………………….. 146 26 Foto bentuk koloni, persiapan masa sel, dan pemberian L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 ad libitum dengan sonde ………... 147 23 27 Foto proses pengambilan darah tikus dan pengambilan organ hati dan sekum ……………………………………………………… 148 28 Foto pengujian total BAL dan pH pada sekum tikus ………………. 150 29 Pewarnaan gram sampel sekum dari masing-masing perlakuan yang telah ditumbuhkan dalam media MRS Broth ……………………….. 152 xvii BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Bahan pangan dalam paradigma gizi modern tidak hanya diharapkan dapat memenuhi kebutuhan zat nutrisi yang diperlukan, tetapi juga diharapkan dapat menstimulasi salah satu fungsi khusus dalam kesehatan individu, yang dikenal sebagai efek fungsional (Gibon dan Roberfroid, 1997). Bakteri asam laktat (BAL) telah banyak dimanfaatkan oleh industri pangan untuk menciptakan produk pangan fungsional untuk memelihara kesehatan saluran pencernaan manusia, yang dikenal dengan istilah probiotik. Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang apabila diberikan pada jumlah yang tepat dapat bermanfaat bagi kesehatan saluran pencernaan (FAO. 2002). Memodulasi komposisi bakteri saluran pencernaan yang dapat memberikan dampak ke arah yang lebih menyehatkan secara umum, dapat dilakukan melalui tiga pendekatan yaitu: (1)mengkonsumsi probiotik yaitu mengkonsumsi bakteri hidup yang menguntungkan; (2) mengkonsumsi prebiotik yaitu mengkonsumsi bahan pangan atau komponen bahan pangan khusus sehingga mampu secara selektif memacu pertumbuhan bakteri menguntungkan; dan (3) mengkonsumsi sinbiotik yaitu kombinasi probiotik dan prebiotik. Mikroba yang digunakan sebagai probiotik dapat diisolasi dari berbagai sumber. Probiotik untuk diaplikasikan pada manusia sebaiknya diisolasi dari manusia yang sehat (tubuh, saluran pencernaan atau feses), demikian juga untuk hewan, 1 sebaiknya diisolasi dari hewan yang sehat. Namun mikroba probiotik khususnya BAL dapat juga diisolasi dari susu dan produk susu atau dari tanaman dan produk olahannya. Probiotik yang beredar di Indonesia pada saat ini kebanyakan dari strain BAL yang bukan asli Indonsia (import). Hal ini memacu penelitian untuk menggali potensi BAL dari sumber alam Indonesia guna meningkatkan derajat kesehatan penduduk Indonesia. Probiotik memberikan dampak menyehatkan pada individu yang mengkonsumsinya. Beberapa potensi menyehatkan dari probiotik antara lain: penanggulangan diare (Salazar et al., 2007; Pant et al., 2007; Collado et al., 2009), menstimulasi sistem kekebalan (immune) tubuh (Isolauri et al., 2001; Isolauri dan Salminen, 2008), pencegahan kanker kolon dan usus (Pato, 2003; Liong, 2008), dan penanggulangan dermatitis atopik pada anak-anak (Betsi et al., 2008; Torii et al., 2010). Potensi probiotik yang lain adalah mempunyai aktivitas sebagai antioksidan (Sekhon dan Jairath, 2010; Kim, 2006a; Kim, 2006b; Gao, 2011, Spyropoulos et al., 2011, Chu-Chyn et al., 2009), dan menurunkan kadar kolesterol (Ooi dan Liong, 2010; Kumar et al., 2012; Lee et al., 2009). Bakteri probiotik menunjukkan aktivitas antioksidan dengan mekanisme antara lain: (1) mensekresikan enzim-enzim antioksidan seperti superoksida dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx), glutation reduktase (GR) serta enzim katalase yang dapat dihasilkan oleh probiotik Lactobacillus plantarum dan Lactococcus lactis (Spyropoulos et al., 2011), Lactobacillus casei Zhang (Zhang et al., 2010); Lactobacillus gasseri (Caroll et al., 2007), Lactobacillus fermentum E-3 dan E-18 dan 2 Streptococcus thermophilus (Kullisaar et al., 2002; Chang dan Hassan, 1997). (2) Melepaskan dan memacu produksi glutatione (GSH) yaitu antioksidan non-enzimatik utama dan penangkap radikal bebas seperti pada probiotik bifidobacterium dan lactococcus (Musenga et al., 2007), Lactobacillus fermentum (Peran et al., 2006), Lactobacillus acidophilus W70, L. Casei W56, L. salivarius W24, Lactococcus lactis W58, Bifidobacterium bifidum W23, dan B. lactis W52 (Lutgendorff et al., 2008). (3) Meningkatkan produksi biomolekul antioksidan tertentu, seperti EPSS yaitu pada probiotik Bacillus coagulans RK-02 (Kodali dan Sen, 2008). (4) Pengikatan ion logam Cu2+ dan Fe2+ yaitu pada bakteri Streptococcus thermophilus 821 dan Bifidobacterium longum (Lin dan Yen, 1999), Lactobacillus sake dan L. casei KCTC 3260 (Amanatidou et al., 2001 dan Lee et al., 2005). Penurunan kadar kolesterol oleh bakteri probiotik dapat terjadi melalui beberapa mekanisme antara lain : (1) deconjugasi asam empedu secara enzimatik oleh enzim bile salt hidrolase (BSH) yang dihasilkan oleh bakteri probiotik, (2) asimilasi kolesterol oleh probiotik, (3) penggabungan kolesterol ke dalam membran sel probiotik selama pertumbuhan, (4) konversi kolesterol menjadi koprostanol, dan (5) produksi asam lemak rantai pendek pada fermentasi prebiotik oleh probiotik (Ooi dan Liong, 2010). Bakteri probiotik yang menunjukkan potensi sebagai penurun kolesterol antara lain: Lactobacillus acidofillus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium, Lactobacillus reuteri, Bifidobacerium lactis, Bifidobacerium longum, Bifidobacterium dari susu, Lactobacillus acidofillus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus 3 sporogenes, Lactobacillus reuteri NCIMB30242, Enterococcus faecium (Kumar et al., 2012) Lactobacillus rhamnosus SKG34 merupakan strain BAL yang diisolasi dari susu kuda sumbawa dan berpotensi untuk dikembangkan menjadi probiotik baru. Lactobacillus rhamnosus SKG34 secara in vitro mampu melewati simulasi kondisi lambung dengan pH 3 dan 4, tidak mengubah asam kolat primer (kolat) menjadi asam kolat sekunder (deoksikolat) (Sujaya et al., 2008a), dan dapat menghidrolisis garam empedu (Sujaya et al., 2008b). Selain Lactobacillus rhamnosus SKG34, Lactobacillus rhamnosus FBB42 juga mempunyai potensi sebagai probiotik, dimana strain ini mempunyai ketahanan terhadap pH rendah yaitu pH 2, 3, dan 4, tahan terhadap garam empedu (NaDCA) 0,6 mM, serta mampu menghidrolisis garam empedu (Uni, 2012). Pola konsumsi pangan masyarakat modern dewasa ini mulai mengalami perubahan dengan semakin meningkatnya konsumsi pangan cepat saji dengan kandungan lemak tinggi dan rendah serat. Kolesterol darah dapat meningkat dengan mengkonsumsi makanan yang mengandung lemak tinggi, disamping itu makanan yang mengandung lemak tinggi dapat menjadi sumber radikal bebas. Keseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan akan terganggu apabila keseimbangan mikroflora usus terganggu. Salah satu cara untuk menjaga keseimbangan mikroflora usus untuk mencegah terjadinya stress oksidatif adalah dengan konsumsi probiotik. L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 merupakan strain BAL yang mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai probiotik. Sifat fungsional L. rhamnosus SKG34 dan L. 4 rhamnosus FBB42 belum dieksplorasi sepenuhnya, sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengeksplorasi sifat fungsional kedua strain ini sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah, sehingga memberi potensi baru pada probiotik isolat lokal dalam pengembangan pangan fungsional. 1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimanakah aktivitas enzim SOD dan kemampuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 menghambat peroksidasi lipid, menangkap radikal hidroksil dan mengikat ion logam Fe secara in vitro? 2. Apakah L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dapat bertahan dalam keadaan hidup dan berkembang pada saluran pencernaan tikus? 3. Bagaimanakah pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi terhadap profil lipid (total kolesterol, trigliserida, HDL dan LDL) pada serum darah tikus putih secara in vivo? 4. Bagaimanakah pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi terhadap aktivitas enzim SOD dan GPx pada hati tikus putih secara in vivo? 5. Bagaimanakah pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi terhadap kadar Malondialdehid (MDA) pada hati dan serum darah tikus putih secara in vivo? 1.3 Tujuan Penelitian 5 1.3.1. Tujuan Umum Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengekplorasi sifat fungsional L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah, sehingga memberi potensi baru pada probiotik isolat lokal untuk pengembangan pangan fungsional. 1.3.2. Tujuan Khusus 1. Untuk mengetahui aktivitas enzim SOD dan kemampuan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 menghambat peroksidasi lipid, menangkap radikal hidroksil dan mengikat ion logam Fe secara in vitro. 2. Untuk mengetahui kemampuan bertahan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dalam keadaan hidup dan berkembang pada saluran pencernaan tikus. 3. Untuk mengetahui pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi terhadap profil lipid (total kolesterol, trigliserida, HDL dan LDL) pada serum darah tikus putih secara in vivo 4. Untuk mengetahui pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi terhadap aktivitas enzim SOD dan GPx pada hati tikus putih secara in vivo. 6 5. Untuk mengetahui pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 dengan pakan lemak tinggi terhadap kadar MDA pada hati dan serum darah tikus putih secara in vivo. 1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1. Manfaat Ilmiah 1. Memberikan informasi strain probiotik L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 yang mempunyai aktivitas antioksidan secara in vitro dan in vivo. 2. Memberikan informasi tentang strain probiotik L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 yang memiliki aktivitas penurunan kolesterol secara in vivo. 1.4.2. Manfaat Praktis Pengembangan pangan fungsional menggunakan L. rhamnosus SKG34 dan L. rhamnosus FBB42 yang mempunyai potensi sebagai antioksidan dan penurun kolesterol darah sehingga dapat meningkatkan derajat kesehatan masyarakat Indonesia. 7
