1. SAMPUL_THESIS

20
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. KONDISI OPTIMAL REAKSI AMPLIFIKASI
Sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 dilakukan dengan teknik overlapping extension PCR.
Overlapping extension PCR merupakan metode PCR yang digunakan untuk
menghasilkan polinukleotida dari fragmen-fragmen kecil (Heckman & Pease
2007: 924). Amplifikasi dilakukan dengan metode HotStar PCR
menggunakan enzim HotStar Taq DNA polymerase. Metode HotStar PCR
sesuai digunakan karena amplifikasi menggunakan banyak pasangan primer
(multiple primer pairs). Sintesis tersebut dilakukan dengan variasi
penambahan pasangan primer pada selang 3 siklus dari reaksi PCR, yang
terbagi ke dalam lima metode (Gambar 6--10).
Metode-metode penambahan pasangan primer tersebut ditentukan
berdasarkan jumlah pasangan primer yang digunakan. Pasangan primer
yang digunakan berjumlah delapan pasangan primer, sehingga diperoleh
metode penambahan primer, yaitu delapan pasang, empat pasang, dua
pasang, dan satu pasang primer dalam satu reaksi PCR. Hal tersebut
didasarkan pada proporsional jumlah pasangan primer yang ditambahkan
dalam setiap reaksi PCR, sehingga jumlah pasangan primer yang
ditambahkan sama untuk setiap reaksi PCR dalam satu metode. Pasangan
20
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
21
primer ditambahkan pada selang 3 siklus. Hal tersebut dilakukan atas dasar
variasi terhadap penelitian sintesis gen HA yang dilakukan di IHVCB-UI.
Penelitian sintesis fragmen 688--1119 gen HA sebelumnya telah dilakukan
dengan variasi penambahan dua pasang primer dengan selang 8 siklus
dalam satu reaksi PCR (Widyaningtyas, komunikasi pribadi, 25 September
2007).
Keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh beberapa
faktor, yaitu DNA cetakan (template), primer, buffer PCR, MgCl2, enzim DNA
polimerase, suhu, waktu denaturasi, annealing, dan jumlah siklus (Sambrook
& Russell 2001: 8.4--8.6). Optimasi PCR perlu dilakukan terlebih dahulu
untuk mendapatkan kondisi PCR yang tepat dalam proses PCR sehingga
dihasilkan produk PCR yang spesifik. Optimasi PCR perlu dilakukan karena
tidak ada satu protokol pun yang sesuai digunakan untuk semua reaksi PCR
(Ahmed 2006: 118). Optimasi yang dilakukan dalam amplifikasi untuk
sintesis fragmen 688--1119 gen HA meliputi suhu annealing, konsentrasi
MgCl2, dan konsentrasi primer.
Optimasi suhu annealing pada penelitian pendahuluan dilakukan pada
suhu 55° C dan 60° C. Suhu annealing tersebut ditentukan berdasarkan hasil
optimasi suhu annealing yang pernah dilakukan oleh peneliti IHVCB-UI, yang
juga melakukan penelitian sintesis gen HA menggunakan pasangan primer
yang sama dengan penelitian sintesis fragmen 688--1119 gen HA. Hasil
optimasi menunjukkan bahwa amplifikasi dengan suhu annealing 60° C
selama 30 detik tidak menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik dari
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
22
kelima metode penambahan primer (Gambar 11). Sementara itu, amplifikasi
dengan suhu annealing 55° C selama 30 detik menghasilkan produk
amplifikasi yang spesifik untuk metode ke-4 dan ke-5, dan menghasilkan
produk PCR dimer untuk metode ke-2 dan ke-4, serta tidak menghasilkan
produk PCR yang spesifik untuk metode ke-1 (Gambar 12).
Amplifikasi dapat berjalan dengan suhu annealing 55° C selama 30 detik
dikarenakan penggunaan Qiagen PCR buffer. Qiagen PCR buffer
memungkinkan untuk tidak dilakukan optimasi suhu annealing. Hal tersebut
dikarenakan Qiagen PCR buffer mampu menyediakan ruang suhu yang lebih
luas (wider temperature window) (Qiagen 1997: 3). Penelitian menggunakan
Qiagen PCR buffer dengan variasi suhu annealing 50-- 60° C menunjukkan
bahwa suhu annealing 54--60° C menghasilkan produk amplifikasi yang
spesifik tanpa adanya produk dimer. Sementara itu, suhu annealing di
bawah 54° C menghasilkan produk amplifikasi dimer ( Qiagen 1997: 5).
Menurut Qiagen (2005: 16), suhu annealing yang disarankan berkisar antara
50--68° C selama 30 detik sampai 1 menit.
Proses penempelan primer pada DNA cetakan dipengaruhi oleh ion
Mg2+. Masing-masing pasangan primer memerlukan kondisi ion Mg2+ yang
berbeda untuk dapat menempel pada DNA cetakan dengan optimal sehingga
menghasilkan produk PCR yang spesifik (Kramer & Coen: 2001: 15.1.7).
Peningkatan konsentrasi ion Mg2+ dilakukan untuk mengetahui kondisi
optimal yang dibutuhkan bagi setiap pasangan primer agar dapat
menghasilkan produk PCR yang spesifik.
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
23
Optimasi konsentrasi ion Mg2+ dalam reaksi amplifikasi dilakukan
dengan konsentrasi 1,5 mM MgCl2 dan 2 mM MgCl2. Campuran reaksi PCR
dengan final concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM tidak perlu ditambahkan
larutan 25 mM MgCl2 karena larutan 10x HotStar PCR buffer [Qiagen] telah
mengandung 1,5 mM MgCl2. Pembuatan campuran reaksi PCR dengan final
concentration MgCl2 sebesar 2 mM dilakukan dengan menambahkan 0,26 µL
25 mM MgCl2. Cara menghitung jumlah volume MgCl2 yang harus
ditambahkan ke dalam campuran reaksi PCR dengan final concentration
MgCl2 2 mM dapat dilihat pada Lampiran 10.
Hasil optimasi menunjukkan bahwa final concentration MgCl2 sebesar
2 mM menghasilkan pita DNA yang lebih tebal daripada final concentration
MgCl2 sebesar 1,5 mM. Namun, final concentration MgCl2 sebesar 2 mM
menghasilkan produk dimer untuk 3 metode penambahan primer, sedangkan
final concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM hanya menghasilkan produk dimer
untuk 2 metode penambahan primer (Gambar 11 dan 12). Konsentrasi
MgCl2 yang dianjurkan untuk reaksi PCR dengan konsentrasi dNTP sebesar
200 µM adalah 1,5 mM (Hanegariu 1997: 1). Berdasarkan hasil tersebut
maka reaksi amplifikasi menggunakan final concentration MgCl2 sebesar 1,5
mM yang telah terkandung dalam 10x HotStar PCR buffer [Qiagen] yang
digunakan dalam reaksi amplifikasi.
Konsentrasi primer merupakan salah satu faktor yang berpengaruh
terhadap spesifitas produk PCR. Konsentrasi primer yang digunakan dalam
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
24
reaksi PCR sebaiknya berkisar antara 0,1--0,5 µM (Qiagen 1997: 3).
Konsentrasi primer yang terlalu tinggi dapat menyebabkan penempelan
primer pada sekuen DNA cetakan yang tidak spesifik, sedangkan konsentrasi
primer yang terlalu rendah akan menghasilkan sedikit produk PCR (Muladno
2002: 66). Menurut Qiagen (1997: 5), konsentrasi primer 0,2 µM memberikan
hasil amplifikasi yang memuaskan. Penelitian yang dilakukan menggunakan
variasi konsentrasi primer 0,1--1,0 µM menunjukkan bahwa konsentrasi
primer 0,1--0,2 µM menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik.
Sementara itu, konsentrasi primer 0,5--1,0 µM menghasilkan produk
amplifikasi dimer (Qiagen 1997: 5).
Konsentrasi primer yang digunakan dalam penelitian adalah 0,3 µM
(Lampiran 9) untuk pasangan H896F + H923R dan 0,5 µM untuk pasangan
H869F + H953R, H843F + H979R, H819F + H1003R, H791F + H1028R,
H765F + H1051R, H729F + H1078R, dan H703F + H1104R. Konsentrasi
primer-primer tersebut diperoleh berdasarkan hasil optimasi pada penelitian
pendahuluan. Konsentrasi primer dibedakan untuk pasangan primer H896F
+ H923R. Hal tersebut dikarenakan pasangan primer tersebut memiliki
daerah overlapping pada ujung 3’ sebesar 9 pb, yang nantinya akan
teramplifikasi membentuk produk yang akan dijadikan cetakan (template)
pada reaksi PCR berikutnya. Daerah overlapping yang akan teramplifikasi
hanya berukuran 9 basa dengan amplifikasi sebanyak 3 siklus. Oleh karena
itu, konsentrasi primer dari pasangan primer tersebut dibuat lebih rendah dari
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
25
pasangan primer yang lainnya, sehingga dapat menghasilkan produk
amplifikasi yang spesifik yang nantinya akan menjadi cetakan (template).
B. ANALISIS METODE PENAMBAHAN PRIMER
1. Metode ke-1 (Delapan pasang primer ditambahkan secara bersamaan
pada awal siklus untuk satu kali reaksi PCR)
Delapan pasang primer yang ditambahkan secara bersamaan pada
awal siklus untuk satu kali reaksi PCR tidak berhasil membentuk pita DNA
yang spesifik pada reaksi PCR pertama (Gambar 13, Lajur 1). Hal tersebut
dikarenakan belum terbentuknya DNA cetakan (template) pada reaksi PCR
tersebut. Reaksi PCR yang dilakukan tidak menggunakan DNA cetakan
(template). DNA cetakan (template) terbentuk karena adanya overlap 9 basa
pada ujung 3’ dari pasangan primer H896F + H923R. Pasangan-pasangan
primer yang dicampurkan secara bersamaan di awal siklus tidak memberikan
waktu yang cukup untuk amplifikasi pasangan primer H896F + H923R
membentuk diri sebagai DNA cetakan (template). DNA cetakan (template)
merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap spesifisitas produk
PCR (Sambrook & Russell 2001: 8.5). Tanpa adanya DNA cetakan
(template) maka tidak ada tempat bagi primer untuk menempel pada tahap
annealing sehingga tidak akan terbentuk produk PCR yang spesifik.
Faktor lain yang mengakibatkan tidak terbentuknya produk amplifikasi
yang tidak spesifik pada metode ke-1 adalah adanya penempelan antara
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
26
pasangan-pasangan primer yang saling berkomplemen pada daerah ujung 3’.
Primer-primer tersebut dapat menempel pada daerah ujung 3’ yang
berkomplemen karena konsentrasi primer yang terlalu tinggi (Muladno 2002:
66). Terdapat 8 pasang primer dalam reaksi PCR dengan konsentrasi
pasangan primer H896F + H923R sebesar 0,3 µM dan 7 pasangan primer
lainnya masing-masing primer sebesar 0,5 µM. Dengan demikian, total
konsentrasi primer dalam reaksi PCR tersebut cukup tinggi, yaitu 3,8 µM
sehingga tidak dihasilkan produk PCR yang spesifik. Konsentrasi primer
yang digunakan dalam reaksi PCR sebaiknya berkisar antara 0,1--0,5 µM
(Innis & Gelfand 1990: 5; Qiagen 1997: 3). Menurut Qiagen (1997: 5),
amplifikasi dengan menggunakan konsentrasi primer 0,2 µM memberikan
hasil amplifikasi yang memuaskan. Sementara itu, amplifikasi dengan
menggunakan konsentrasi primer 0,5 µM cenderung menghasilkan produk
amplifikasi yang tidak spesifik, yaitu produk dimer.
2. Metode ke-2 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam satu kali reaksi
PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi
PCR)
Lajur 2 pada Gambar 13 menunjukkan hasil visualisasi produk
amplifikasi dari metode ke-2. Delapan pasang primer yang ditambahkan
dalam satu kali reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer
dalam satu reaksi PCR; berhasil membentuk pita DNA berukuran 134 pb,
tetapi ukuran pita DNA yang dihasilkan tersebut tidak sesuai dengan yang
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
27
diharapkan yaitu 446 pb. Hal tersebut dikarenakan konsentrasi primer yang
tinggi dengan selang siklus yang cukup pendek antara penambahan satu
pasang primer dengan pasangan primer berikutnya. Pasangan primer H896F
+ H923R dengan konsentrasi 0,3 µM dimasukkan pada awal siklus PCR.
Konsentrasi primer sebesar 0,3 µM cukup untuk mengamplifikasi daerah
overlap pasangan primer H896F + H923R yang hanya berukuran 9 pb,
sebanyak 3 siklus. Dengan demikian, DNA cetakan (template) telah
terbentuk pada selang 3 siklus pertama. Pasangan primer H869F + H953R
dimasukkan ke dalam reaksi PCR dengan konsentrasi 0,5 µM pada siklus
ketiga. Pasangan primer H869F + H953R berhasil mengamplifikasi DNA
cetakan (template) yang telah terbentuk pada selang 3 siklus pertama,
sehingga terbentuk produk amplifikasi berukuran 134 pb.
Pasangan primer H843F + H979R dimasukkan ke dalam reaksi PCR
dengan konsentrasi 0,5 µM pada siklus keenam. Demikian seterusnya,
pasangan-pasangan primer berikutnya dimasukkan ke dalam reaksi PCR
hingga kedelapan pasangan primer digunakan dalam reaksi PCR pada
metode ke-2. Pasangan primer H843F + H979R tidak berhasil
mengamplifikasi DNA cetakan (template) yang telah terbentuk pada selang 3
siklus sebelumnya, terlihat dari pita DNA yang dihasilkan hanya berukuran
134 pb yang merupakan hasil amplifikasi antara pasangan primer H869F +
H953R dengan pasangan primer H896F + H923R. Hal tersebut dikarenakan
pada saat penambahan pasangan primer H843F + H979R, pasangan primer
H869F + H953R belum teramplifikasi dengan sempurna akibat selang siklus
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
28
yang cukup pendek sehingga pasangan primer H843F + H979R tidak ada
tempat untuk menempel pada tahap annealing. Demikian seterusnya terjadi
pada pasangan primer H819F + H1003R, H791F + H1028R, H765F +
H1051R, H729F + H1078R, dan H703F + H1104R yang tidak ada tempat
untuk menempel pada tahap annealing akibat belum sempurnanya
amplifikasi pasangan primer H869F + H953R. Dengan demikian, produk
amplifikasi yang dihasilkan hanya berukuran 134 pb, yang merupakan hasil
amplifikasi pasangan primer H869F + H953R dengan pasangan primer
H896F + H923R. Produk amplifikasi yang dihasilkan tidak sesuai dengan
yang diharapkan, yaitu 446 pb.
Produk amplifikasi yang dihasilkan pada metode ke-2, disamping tidak
spesifik, juga terlihat adanya produk dimer. Produk dimer tersebut terlihat
dengan adanya pita DNA tipis di bawah pita DNA berukuran 134 pb tersebut
(Gambar 13, Lajur 2). Produk dimer tersebut akan mengurangi spesifitas
produk PCR yang dihasilkan. Produk dimer terbentuk karena adanya
amplifikasi antara ujung 3’ dari salah satu primer dengan ujung 5’ dari primer
lainnya yang saling berkomplemen (Singh & Kumar 2001: 29). Produk dimer
dapat terjadi karena konsentrasi primer yang terlalu tinggi. Konsentrasi
primer yang tinggi dapat meningkatkan mispriming, akumulasi produk
amplifikasi yang tidak spesifik, dan meningkatkan kemungkinan terjadinya
reaksi amplifikasi antar primer yang akan menghasilkan produk dimer (Innis &
Gelfand 1990: 7). Percobaan reaksi amplifikasi menggunakan variasi
konsentrasi primer 0,1; 0,2; 0,5; dan 1,0 µM menunjukkan bahwa reaksi
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
29
amplifikasi dengan konsentrasi primer 0,5 dan 1,0 cenderung menghasilkan
produk dimer (Qiagen 1997: 5).
3. Metode ke-3 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam dua kali reaksi
PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi
PCR)
Visualisasi produk amplifikasi dari reaksi PCR pertama pada metode
ke-3 terlihat pada lajur 3 dari Gambar 13. Berdasarkan hasil visualisasi
tersebut, terlihat bahwa produk amplifikasi pada metode ke-3 serupa dengan
produk amplifikasi pada metode ke-2. Produk amplifikasi yang dihasilkan
hanya berukuran 134 pb, tidak sesuai dengan yang diharapkan yaitu 239 pb.
Hal tersebut juga dikarenakan belum sempurnanya amplifikasi pasangan
primer H869F + H953R pada selang 3 siklus kedua (siklus keempat sampai
keenam) terhadap pasangan primer H896F + H923R yang telah menjadi
cetakan (template) pada selang 3 siklus sebelumnya. Dengan demikian,
pasangan primer H843F + H979R yang dimasukkan ke dalam reaksi PCR
pada siklus keenam tidak ada tempat untuk menempel secara sempurna
pada tahap annealing, sehingga tidak menghasilkan produk amplifikasi yang
spesifik. Hal tersebut juga terjadi pada pasangan primer H819F + H1003R
yang dimasukkan ke dalam reaksi PCR pada siklus kesembilan (Gambar 7).
Pasangan primer yang tidak menempel secara sempurna pada DNA
cetakan (template) akan saling menempel antara ujung 3’ dengan ujung 5’
yang berkomplemen. Kondisi tersebut akan menghasilkan produk dimer
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
30
(Kaufman dkk. 1993: 552). Produk dimer juga terbentuk pada reaksi PCR
pertama dari metode ke-3 Gambar 13, Lajur 3). Produk dimer terlihat dengan
adanya pita DNA lain yang berukuran kurang dari 134 pb. Produk dimer
terbentuk ketika ujung 3’ dari salah satu primer menempel pada ujung 5’ dari
primer lainnya pada tahap annealing (Kramer & Coen: 2001: 15.1.9).
Adanya produk dimer tersebut akan mengurangi spesifitas produk PCR yang
dihasilkan (Singh & Kumar 2001: 29).
Produk amplifikasi dan produk dimer yang dihasilkan pada metode
ke-3 tampak lebih jelas daripada metode ke-2. Hal tersebut kemungkinan
dikarenakan pada metode ke-3 jumlah siklus PCR yang tersisa setelah
penambahan pasangan primer terakhir dalam satu reaksi PCR lebih banyak
daripada metode ke-2. Metode ke-2 menggunakan delapan pasang primer
dalam satu reaksi PCR, sehingga dibutuhkan sebanyak 21 siklus PCR untuk
penambahan pasangan primer ke dalam reaksi PCR. Dengan demikian,
jumlah siklus PCR yang tersisa hanya 14 siklus. Sementara itu, metode ke-3
menggunakan empat pasang primer dalam satu reaksi PCR, sehingga hanya
dibutuhkan sebanyak 9 siklus PCR untuk penambahan pasangan primer ke
dalam reaksi PCR. Metode ke-3 masih menyisahkan sebanyak 26 siklus
PCR untuk menyelesaikan satu reaksi PCR. Jumlah siklus PCR yang sedikit
akan menghasilkan sedikit produk amplifikasi yang spesifik, sehingga pita
DNA yang terbentuk lebih tipis (Innis & Gelfand 1990: 6).
Reaksi PCR pertama dari metode ke-3 tidak menghasilkan produk
PCR yang spesifik, sehingga tidak ada produk PCR yang akan dijadikan DNA
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
31
cetakan (template). Oleh karena itu, pada metode ke-3 tidak dilanjutnya
untuk reaksi PCR kedua.
4. Metode ke-4 (Delapan pasang primer ditambahakan dalam empat kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu
reaksi PCR)
Reaksi PCR pertama dari metode ke-4 menghasilkan produk
amplifikasi sesuai yang diharapkan, yaitu berukuran 134 pb
(Gambar 13 Lajur 4). Hal tersebut dikarenakan reaksi PCR pertama pada
metode ke-4 hanya menggunakan 2 pasang primer, sehingga tersedia jumlah
siklus yang cukup untuk amplifikasi setelah ditambahkannya pasangan
primer kedua pada siklus ketiga. Pasangan primer H896F + H923R
dimasukkan pada awal siklus reaksi PCR pertama dengan konsentrasi 0,3
µM, selanjutnya reaksi PCR dijalankan sampai siklus ketiga. Pasangan
primer H896F + H923R dengan konsentrasi 0,3 µM berhasil teramplifikasi
dalam rentang 3 siklus. Hal tersebut dikarenakan bagian overlap (berperan
sebagai DNA cetakan) pada pasangan primer H896F + H923R yang
teramplifikasi hanya berukuran 9 pb. Menurut Davis dkk. (1994: 119), proses
amplifikasi lebih efisien untuk fragmen pendek yang diapit oleh beberapa
primer oligonukleotida. Fragmen DNA cetakan yang terlalu panjang kurang
efisien karena fragmen tersebut dapat berasosiasi kembali dengan untai
komplemen dengan cepat dan membentuk untai ganda kembali. Hal tersebut
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
32
menyebabkan terganggunya proses amplifikasi karena untai ganda DNA
tidak dapat menyediakan cetakan untuk siklus berikutnya.
Pasangan primer H869F + H953R dimasukkan ke dalam reaksi PCR
pada siklus ketiga dengan konsentrasi 0,5 µM. Pasangan primer tersebut
dapat menempel pada DNA cetakan (template) yang telah terbentuk
sebelumnya dari pasangan primer H896F + H923R, sehingga menghasilkan
produk amplifikasi yang spesifik berukuran 134 pb. Siklus PCR sebanyak 32
siklus (rentang siklus ke-3 sampai siklus ke-35) memberikan waktu yang
cukup bagi pasangan primer H869F + H953R untuk mengamplifikasi DNA
cetakan (template) tersebut. Menurut Qiagen (2005: 16), jumlah siklus
optimal pada reaksi HotStar PCR berkisar antara 25--35 siklus. Polimerisasi
akhir selama 10 menit memberikan waktu bagi pasangan primer H869F +
H953R untuk menyempurnakan proses amplifikasi.
Produk PCR yang dihasilkan pada reaksi PCR pertama dijadikan DNA
cetakan (template) pada reaksi PCR kedua dengan penambahan pasangan
primer H843F + H979R pada awal siklus dan pasangan primer H819F +
H1003R pada siklus ke-3, dengan konsentrasi masing-masing 0,5 µM.
Reaksi PCR kedua menghasilkan produk PCR yang spesifik berukuran
239 pb. Produk PCR kedua dijadikan DNA cetakan (template) pada rekasi
PCR ketiga dengan penambahan pasangan primer H791F + H1028R pada
awal siklus dan pasangan primer H765F + H1051R pada siklus ke-3, dengan
konsentrasi masing-masing 0,5 µM. Reaksi PCR ketiga juga menghasilkan
produk PCR yang spesifik berukuran 344 pb. Produk PCR ketiga selanjutnya
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
33
dijadikan DNA cetakan (template) pada reaksi PCR keempat dengan
penambahan pasangan primer H729F + H1078R pada awal siklus dan
pasangan primer H703F + H1104R pada siklus ke-3, dengan konsentrasi
masing-masing 0,5 µM. Reaksi PCR keempat menghasilkan produk PCR
yang spesifik berukuran 446 pb (Gambar 14). Dengan demikian, metode
ke-4 berhasil membentuk fragmen 688--1119 gen HA secara utuh berukuran
446 pb.
5. Metode ke-5 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam delapan kali
reaksi PCR)
Visualisasi produk amplifikasi dari reaksi PCR pertama pada metode
ke-5 menunjukkan terbentuknya pita DNA yang spesifik berukuran 83 pb,
sesuai dengan yang diharapakan (Gambar 13, Lajur 5). Pasangan primer
H896F + H923R dimasukkan pada awal siklus dengan konsentrasi 0,3 µM,
selanjutnya PCR dijalankan sampai 35 siklus. Konsentrasi primer sebesar
0,3 µM dari pasangan primer H896F + H923R telah cukup untuk
mengamplifikasi daerah overlap pada ujung 3’ dari masing-masing primer
tersebut selama 35 siklus. Produk PCR yang dihasilkan pada reaksi PCR
pertama selanjutnya dijadikan DNA cetakan (template) pada reaksi PCR
kedua. Produk PCR yang dihasilkan pada reaksi PCR kedua dijadikan DNA
cetakan (template) pada rekasi PCR ketiga. Demikian seterusnya hingga
reaksi PCR kedelapan dan dihasilkan produk PCR berukuran 446 pb
(Gambar 15), sesuai dengan yang diharapkan.
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
34
Pita DNA yang dihasilkan pada metode ke-5 lebih tebal daripada
metode ke-4. Hal tersebut dikarenakan pada metode ke-5 memiliki waktu
amplifikasi yang lebih lama karena dalam satu reaksi PCR selama 35 siklus
hanya dimasukkan 1 pasang primer. Amplifikasi pasangan primer H896F +
H923R yang akan membentuk DNA cetakan (template) berlangsung selama
35 siklus, sehingga amplifikasi akan sempurna dan menghasilkan pita DNA
yang tebal. Sementara itu, pada metode ke-4 amplifikasi pasangan primer
H896F + H923R hanya berlangsung selama 3 siklus, sehingga amplifikasi
kurang sempurna dan pita DNA yang dihasilkan lebih tipis. Jumlah siklus
yang sedikit akan menghasilkan produk amplifikasi spesifik dalam jumlah
kecil, sehingga pita DNA yang terbentuk menjadi tipis (Innis & Gelfand 1990:
6).
C. EFISIENSI WAKTU SERTA EFEKTIVITAS PENGGUNAAN BAHAN
DAN BIAYA
1. Efisiensi waktu
Salah satu kriteria untuk menentukan metode optimal dalam sintesis
fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 adalah efisiensi waktu. Waktu yang dibutuhkan untuk
sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 bervariasi untuk masing-masing metode penambahan
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
35
primer. Waktu tersebut meliputi waktu untuk reaksi amplifikasi dan waktu
untuk running elektroforesis (Tabel 1).
Kriteria utama untuk menentukan metode optimal dalam sintesis
fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 adalah dapat terbentuknya fragmen 688--1119 gen HA
Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 sintetik dengan ukuran
446 pb. Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa metode ke-4 dan
metode ke-5 berhasil membentuk fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza
Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 dengan ukuran 446 pb. Oleh karena itu,
untuk melihat efisiensi waktu maka yang akan dibandingkan adalah metode
ke-4 dan ke-5. Berdasarkan hasil pengamatan dan penghitungan, maka
metode ke-4 memiliki total waktu sintesis lebih singkat dibandingkan metode
ke-5, yaitu 13 jam (Tabel 1). Dengan demikian, berdasarkan efisiensi waktu
maka metode ke-4 lebih optimal daripada metode ke-5.
Perbandingan efisiensi waktu antara metode ke-4 dan metode ke-5
terlihat dari Gambar 14 dan 15 yang menunjukkan visualisasi produk
amplifikasi dari setiap reaksi PCR pada kedua metode tersebut. Metode ke-4
membutuhkan waktu sintesis yang lebih cepat, yaitu hanya membutuhkan
empat kali reaksi PCR (Gambar 14). Sementara itu, metode ke-5
membutuhkan waktu sintesis yang lebih lama, mencapai dua kali lipat waktu
sintesis pada metode ke-4, yaitu delapan kali reaksi PCR (gambar 15).
Berdasarkan hal tersebut, metode ke-4 lebih optimal daripada metode ke-5.
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
36
2. Efektivitas penggunaan bahan dan biaya
Efektivitas penggunaan bahan dan biaya juga merupakan kriteria
untuk menentukan metode optimal dalam sintesis fragmen 688--1119 gen HA
Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005, disamping efisiensi
waktu. Efektivitas penggunaan bahan dan biaya meliputi bahan dan biaya
untuk reaksi amplifikasi dan running elektroforesis (Tabel 2--5). Berdasarkan
hasil penelitian, hanya metode ke-4 dan ke-5 yang berhasil membentuk
fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 sintetik dengan ukuran 446 pb, maka hanya kedua
metode tersebut yang akan dibandingkan untuk kriteria efektivitas
penggunaan bahan dan biaya.
Berdasarkan hasil perhitungan (Tabel 4 dan 5), metode ke-4
membutuhkan biaya untuk reaksi amplifikasi sebesar Rp 170.815,10 dan
untuk running elektroforesis sebesar Rp 87.058,14, sehingga total biaya yang
dibutuhkan untuk sintesis sebesar Rp 257.873,24. Sementara itu, metode
ke-5 membutuhkan biaya untuk reaksi amplifikasi sebesar Rp 202.065,02
dan untuk running elektroforesis sebesar Rp 174.116,27, sehingga total biaya
yang dibutuhkan sebesar Rp 376.181,29. Berdasarkan hasil tersebut, maka
metode ke-4 lebih optimal daripada metode ke-5 karena membutuhkan biaya
sintesis yang lebih murah.
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008