4 Hasil dan Pembahasan

4
Hasil dan Pembahasan
Dalam bab ini akan dipaparkan hasil dari tahap-tahap penelitian yang telah dilakukan.
Melalui tahapan tersebut diperoleh urutan nukleotida sampel yang positif diabetes dan
sampel yang negatif dengan panjang fragmen 1.800 pasang basa. Pembahasan dimulai
dengan penyiapan templat DNA, hasil PCR, dan hasil sequencing. Selanjutnya dilakukan
analisis terhadap hasil sequencing dengan melakukan perbandingan terhadap urutan
nukleotida standar CRS dan data yang sudah dipublikasikan dalam Mitomap.
4.1
Pengambilan sampel
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi mengenai kaitan antara DNA
mitokondria pada sampel Diabetes Mellitus (DM) yang ada di laboratorium Biokimia ITB.
Secara umum untuk menganalisis mutasi pada DNA mitokondria yang berkaitan dengan
penyakit, biasanya dilakukan pengambilan sampel dari sel darah putih, jaringan otot (secara
biopsi), plasenta, ataupun jaringan lain yang terlibat dalam penyakit tersebut. Pengambilan
sampel DNA mitokondria dari sel darah pun dilaporkan lebih mudah untuk dianalisis
mutasinya terutama jika sifat DNA mitokondria individu tersebut bersifat heteroplasmi.
Akan tetapi, pengambilan sampel dari sel darah ataupun jaringan dalam tubuh dengan cara
biopsi tentu menyakitkan bagi penderita. Oleh karena itu, untuk mempermudah penyiapan
templat DNA yang tidak menyakitkan, dapat diterapkan pada setiap orang, serta sampel
tersebut cukup stabil pada suhu kamar untuk jangka waktu tertentu, maka dilakukan
pengambilan sampel dari sel epitel rongga mulut manusia (Noer et al., 1997).
Pengambilan sampel dari sel epitel mulut ini diasumsikan memiliki mutasi mtDNA yang
sama dengan mutasi mtDNA pada jaringan lain terutama sel beta-pankreas, sehingga
diharapkan jika ditemukan terdapat mutasi pada sel epitel mulut akan sama mutasinya
dengan yang terjadi pada sel beta-pankreas individu tersebut. Selain itu, amplifikasi
fragmen-B (daerah 2364-4249) pada mtDNA dari sampel sel epitel mulut juga belum pernah
dilaporkan menghasilkan hasil amplifikasi yang berhasil dan konsisten. Adapun keberhasilan
amplifikasi sel epitel mulut pada fragmen-B ini jika dilakukan isolasi DNA mitokondria
terlebih dahulu. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan amplifikasi fragmen-B
mtDNA yang diperoleh melalui metode lisis sel epitel mulut (Noer et al., 1997).
4.2
Hasil Lisis Sel
Pengambilan sampel dari sel epitel mulut dilakukan menggunakan metode kertas saring, yaitu
diharapkan sel epitel mulut akan menempel pada kertas saring yang ditempel dan ditekan ke
atas rongga mulut. Perlakuan sampel sel epitel mulut selanjutnya dilakukan dengan metode
lisis sel untuk mendapatkan DNA mitokondria. Lisis sel ini bertujuan untuk memecah dinding
sel dan mengeluarkan seluruh isi sel termasuk DNA. Pemecahan dinding sel epitel ini
dilakukan menggunakan bufer lisis yang di dalamnya mengandung Tween-20 (Merck).
Tween-20 merupakan deterjen non-ionik yang akan membentuk micelles di dalam larutannya.
Struktur Tween-20 yang berbentuk misel ini berarti memiliki bagian hidrofob yang tersusun
dari senyawa hidrokarbon dengan rantai yang cukup panjang, dan bagian hidrofilik yang
tersusun oleh senyawa ester atau alkohol. Senyawa fosfolipid yang berada dalam sel akan larut
dalam misel Tween-20 ini karena adanya interaksi dari bagian hidrofilik misel dengan
senyawa fosfolipid tersebut.
Untuk merusak struktur membran sel dilakukan dengan menambahkan enzim proteinase-K
yang aktif bekerja pada suhu 54OC, sehingga waktu inkubasi dilakukan pada suhu ini selama
satu jam. Penambahan enzim proteinase-K ini berfungsi untuk mendegradasi enzim-enzim
DNAse dan protein lainnya untuk menghindari degradasi DNA terutama DNA mitokondria
pada larutan sampel. Deaktivasi enzim proteinase-K dilakukan pada suhu 95OC selama 15
menit, lalu dilakukan sentrifugasi sehingga ekstrak DNA mitokondria hasil lisis akan berada
dalam supernatan dan dapat langsung digunakan sebagai templat untuk amplifikasi (Noer et
al., 1994). Templat mtDNA yang berada di supernatan dipisahkan ke dalam tabung aliquot
baru untuk menghindari bercampurnya kembali DNA dengan molekul lainnya. Templat
kemudian dapat disimpan pada freezer suhu -20OC.
4.3
Fragmen 1,8 kb Hasil Amplifikasi PCR
Perbanyakan DNA atau amplifikasi DNA secara in vitro dilakukan dengan metode PCR.
Siklus PCR pada penelitian ini meliputi tiga tahap yaitu tahap denaturasi awal (inisiasi), tahap
perpanjangan (ekstensi), dan tahap pemantapan. Tahap denaturasi bertujuan untuk melepaskan
37
semua ikatan hidrogen yang menghubungkan dua untai DNA sehingga menghasilkan untai
DNA tunggal. Tahap annealing yang suhunya lebih rendah dibanding denaturasi ini berbedabeda untuk tiap primer yang digunakan. Pada penelitian kali ini dengan menggunakan primer
Bfor dan Brev maka suhu annealing yang digunakan adalah pada suhu 53OC. Setelah tahap
perpanjangan rantai, dilakukan tahap pemantapan untuk meyakinkan bahwa untai tunggal
DNA yang tersisa sudah teramplifikasi.
Setiap melakukan reaksi PCR maka dibutuhkan komponen atau reagen PCR, dan keberhasilan
PCR ini ditentukan dari komposisi komponen atau reagen PCR tersebut. Campuran dari
semua reagen PCR yang dibutuhkan dalam setiap kali reaksi PCR seringkali disebut mastermix. Untuk mendapatkan fragmen hasil amplifikasi yang diinginkan yang artinya proses
perbanyakan berhasil dilakukan, maka komponen PCR harus dipastikan sudah berada dalam
campuran atau master-mix tadi. Masing-masing komponen memiliki komposisi tertentu dalam
setiap campuran bahkan komposisi templat yang juga harus sesuai agar hasil amplifikasi yang
diperoleh optimal.
Pada dasarnya sudah terdapat komposisi tertentu untuk melakukan satu kali reaksi PCR. Akan
tetapi, untuk mendapatkan hasil yang optimal dibutuhkan optimasi terhadap masing-masing
komponen PCR yang ada. Optimasi komponen PCR pada penelitian ini dirasakan perlu karena
pada penelitian sebelumnya amplifikasi DNA mitokondria dari sel epitel mulut yang
dilaporkan belum menghasilkan satu pita fragmen yang konsisten. Optimasi yang sempat
dilakukan adalah konsentrasi ion Mg2+ dalam larutan MgCl2 karena ion Mg2+ merupakan
kofaktor enzim yang dapat meningkatkan kinerja enzim Taq polimerase. Akan tetapi,
penggunaan konsentrasi yang terlalu tinggi juga tidak diperoleh satu pita fragmen hasil
amplifikasi yang optimal sehingga ditentukan konsentrasi ion Mg2+ 2,5 mM untuk tiap reaksi
PCR yang dilakukan.
Selain optimasi konsentrasi Mg2+ (dalam MgCl2), dilakukan juga optimasi jumlah templat
yang diamplifikasi. Penggunaan konsentrasi templat yang berlebih ternyata menimbulkan pita
fragmen hasil PCR yang tidak jelas dan mendatar tetapi pita yang smear. Hal ini dapat terjadi
dimungkinkan karena templat yang berlebih ketika diamplifikasi maka akan menghasilkan
jumlah molekul DNA yang sangat banyak sehingga pita fragmen terlihat menjadi smear.
Selain diperoleh pita yang smear, peningkatan jumlah templat juga menyebabkan proses
amplifikasi justru tidak berhasil. Hal ini dapat terjadi karena kemungkinan templat yang justru
dapat menjadi inhibitor reaksi PCR ketika jumlah DNA pada templatnya terlalu banyak.
Komponen penting lain yang juga berbeda untuk tiap reaksi PCR adalah penggunaan primer.
Oleh karena penelitian ini adalah untuk mendeteksi adanya mutasi pada posisi 3243, maka
amplifikasi dilakukan pada daerah tersebut yaitu daerah 2364-4249 menggunakan primer Bfor
38
dan Brev. Kedua primer akan menempel pada ujung-ujung fragmen tersebut dengan sisi
penempelan mtDNA yang berkebalikan dan akan memperpanjang kedua fragmen dengan arah
yang berlawanan. Setelah melalui optimasi yang telah dilakukan, termasuk penggunaan
primer yang tepat, maka dapat disimpulkan bahwa proses amplifikasi fragmen-B mtDNA
menggunakan metode PCR berhasil dilakukan dan memiliki peranan penting dalam penelitian
selanjutnya terhadap DNA mitokondria.
Metode PCR ini memiliki kelebihan dibandingkan metode rekombinan, yaitu hanya
membutuhkan sampel dalam jumlah sedikit. Namun perlu diketahui bahwa urutan asam amino
pada ujung segmen mtDNA akan digunakan sebagai primer dan membutuhkan kriteria khusus
untuk primer yang digunakan di antaranya: (1) jumlah G-C lebih besar dibanding jumlah A-T;
(2) harus terletak pada arah yang benar; (3) ujung 3’ harus G atau C; (5) diusahakan primer
tersebut tidak mempunyai komplemen di untai lain selain untai awal; (6) ujung-ujung jangan
saling berkomplemen untuk menghindari terbentuknya polindron atau loop.
4.4
Analisis Hasil PCR
Hasil PCR kemudian dianalisis menggunakan metode elektroforesis gel agarosa dan
visualisasinya dapat dilihat di bawah sinar UV. Metode ini mampu memperlihatkan ukuran
fragmen hasil PCR yang diperoleh dalam penelitian. Untuk menentukan ukuran hasil PCR
digunakan penanda (marker) pUC19/HinfI dengan ukuran pasang basa tertentu. Proses
amplifikasi dinyatakan berhasil jika kontrol positif memberikan hasil positif yaitu adanya satu
pita fragmen pada ukuran 1,8 kb dan sampel yang juga menghasilkan pita pada ukuran 1,8 kb
serta kontrol negatif memberikan hasil negatif yaitu tidak adanya pita pada gel (Gambar 4.1).
Gambar 4. 1
Elektroforesis gel agarosa hasil amplifikasi fragmen-B mtDNA
Sumur sebelum nomor 1 merupakan sumur penanda pUC19/HinfI dengan ukuran-ukuran tersebut.
Satu pita hasil amplifikasi pada kontrol positif (1) dan sampel (2) dengan ukuran 1,8 kb. Kontrol
negatif tidak memberikan pita.
39
Gambar 4.1 merupakan foto hasil elektroforesis gel agarosa terhadap satu sampel yang negatif
Diabetes Mellitus (DM). Pada gambar tersebut dapat dilihat bahwa baik kontrol positif dan
sampel negatif-diabetes menghasilkan satu pita berukuran 1,8 kb dan kontrol negatif yang
tidak menghasilkan pita. Kontrol positif ini digunakan sebagai pembanding apabila tidak
diperoleh pita pada sampel dengan ukuran yang diinginkan, sementara kontrol negatif yang
tidak menghasilkan pita mengindikasikan bahwa pita pada sampel bukan berasal dari
kontaminan. Setelah menganalisis hasil elektroforesis ini, maka dapat disimpulkan bahwa
penelitian kali ini berhasil melakukan perbanyakan DNA mitokondria pada fragmen-B (23644249) dari sampel sel epitel mulut dan menghasilkan satu pita. Selain itu, metode lisis dari sel
epitel mulut tanpa adanya isolasi DNA mitokondria juga berhasil dilakukan. Setelah berhasil
mendapatkan satu pita fragmen-B mtDNA pada sampel negatif-diabetes, maka penelitian
selanjutnya adalah untuk mengamplifikasi fragmen-B pada sampel yang positif diabetes.
Satu pita fragmen hasil amplifikasi pada sampel tersebut sesuai dengan yang diinginkan, yaitu
mengamplifikasi daerah fragmen-B pada DNA mitokondria atau daerah yang diperlukan
untuk mengetahui mutasi yang terjadi pada posisi 3243. Satu pita pada hasil elektroforesis
merupakan visualisasi dari skema fragmen-B pada mitokondria seperti pada Gambar 4.2.
Gambar 4. 2
Skema amplifikasi fragmen-B DNA mitokondria
Satu pita fragmen yang terlihat dari hasil elektroforesis merupakan visualisasi dari skema amplifikasi
fragmen-B mtDNA seperti di atas, sehingga berhasil menghasilkan fragmen berukuran 1,8 kb.
Fragmen ini merupakan fragmen yang diinginkan untuk menganalisis daerah mutasi pada posisi
3243.
Sampel positif-diabetes (sampel DM) juga menggunakan metode lisis dan kondisi PCR yang
sama dengan sampel negatif-diabetes sebelumnya, dan menghasilkan hasil yang sama dengan
sampel sebelumnya. Hasil elektroforesis sampel positif-diabetes (sampel DM) ini dapat dilihat
pada Gambar 4.3 yang menunjukkan bahwa hasil amplifikasi fragmen-B mtDNA dari sel
epitel mulut pada sampel DM telah berhasil dilakukan. Hal ini ditandai dengan munculnya
satu pita pada lajur (1) kontrol positif, lajur (2) sampel negatif-diabetes, dan lajur (4) sampel
DM serta tidak adanya pita pada lajur (3) yang menandakan bahwa pita tersebut bukanlah
berasal dari kontaminan.
40
Gambar 4. 3
Elektroforesis hasil amplifikasi fragmen-B mtDNA pada sampel diabetes
Sumur sebelum nomor 1 merupakan penanda pUC19/HinfI, terlihat bahwa kontrol positif (1), sampel
negatif-diabetes (2), dan sampel DM (4) menghasilkan satu pita pada posisi 1,8 kb. Sementara pada
kontrol negatif (3) tidak menghasilkan pita.
4.5
Hasil Sequencing dan Urutan Nukleotida Sampel
Setelah berhasil dilakukan amplifikasi atau perbanyakan sampel DM yang ada di laboratorium
Biokimia ITB dan divisualisasikan melalui elektroforesis gel agarosa yang mengindikasikan
bahwa hasil PCR berhasil mengamplifikasi fragmen-B berukuran 1,8 kb, maka sampel hasil
PCR tersebut kemudian diproses dengan sequencing. Proses sequencing ini bertujuan untuk
menganalisis urutan nukleotida sampel DM dan sampel negatif-diabetes yang selanjutnya
akan dibandingkan dengan urutan nukleotida standar CRS. Proses sequencing ini dilakukan
oleh Macrogen Inc. dan hasil yang diperoleh berupa elektroforegram sampel pada penelitian
ini (Gambar 4.4). Pada proses sequencing untuk sampel-sampel kali ini digunakan primer
yang berbeda dengan primer yang sebelumnya digunakan untuk amplifikasi. Primer yang
digunakan untuk sequencing kali ini adalah 5F dengan posisi (2995-3013). Tujuan dari
penggunaan primer 5F ini adalah untuk mempermudah analisis daerah mutasi yang
diamplifikasi dengan ukuran fragmen yang disequencing adalah sekitar 750-850 pb.
41
Gambar 4. 4
Elektroforegram hasil sequencing sampel diabetes
Elektroforegram yang merupakan representasi urutan nukleotida sampel. Kurva berwarna hijau
menunjukkan basa adenin (A), kurva berwarna hitam menunjukkan basa guanin (G), kurva berwarna
merah menunjukkan basa timin (T), dan kurva berwarna biru menunjukkan basa sitosin (C).
Perbedaan warna puncak-puncak pada elektroforegram di atas menandakan adanya perbedaan
jenis basanya. Satu warna puncak elektroforegram mewakili satu basa yang memiliki
intensitas berbeda-beda dan dengan notasi yang berbeda-beda, yaitu notasi A untuk basa
adenin; C untuk basa sitosin; T untuk basa timin; dan G untuk basa guanin. Sementara untuk
notasi N memiliki arti bahwa puncak tersebut tidak jelas akibat bertumpuknya beberapa
puncak pada satu posisi atau terlalu rendahnya puncak yang dihasilkan dari nukleotida
tersebut. Akan tetapi, dengan melihat puncak elektroforegram untuk notasi N ini dapat
diperbaiki dan diganti secara manual dengan notasi yang sesuai. Selain itu, pada Gambar 4.4
dapat dilihat bahwa tinggi puncak untuk setiap nukleotida berbeda-beda karena jumlah
molekul DNA mitokondria yang sangat banyak dalam satu sel. Interpretasi dari tinggi atau
rendahnya suatu puncak adalah bahwa puncak yang rendah menunjukkan nukleotida dengan
jumlah yang sedikit atau minoritas, sedangkan puncak yang tinggi menunjukkan jumlah
nukleotida yang banyak atau mayoritas.
Elektroforegram sampel pada Gambar 4.4 yang diperoleh merupakan representasi dari urutan
nukleotida secara keseluruhan. Urutan nukleotida sampel berukuran 850 pb yang sebenarnya
diperoleh adalah dalam bentuk file *.ab1 dan dapat dilihat dengan menggunakan program
EditSeqTM pada Gambar 4.5.
42
Gambar 4. 5
Urutan nukleotida sampel positif-Diabetes (sampel DM)
Urutan nukleotida sampel berukuran 850 nukleotida berupa teks file *.ab1 dan dilihat menggunakan
program EditSeqTM DNASTAR.
4.6
Mutasi pada Sampel
Mutasi yang dibahas dalam penelitian ini merupakan mutasi pada daerah pengode, yaitu
pengode gen tRNA yang memiliki kemungkinan diiringi dengan pengubahan sifat dan fungsi
mitokondria tersebut. Mutasi yang terjadi pada sampel merupakan mutasi yang berkaitan
dengan suatu penyakit mitochondrial disease “Diabetes and Deafness”. Publikasi mengenai
mutasi penyebab penyakit Maternally Inherited Diabetes and Deafness (MIDD) ini sudah ada
di Mitomap beserta referensi-referensinya. Untuk menganalisis mutasi yang terjadi pada
sampel dilakukan perbandingan dengan urutan nukleotida dan elektroforegram sampel
terhadap standar CRS menggunakan program komputer Seqman (DNASTAR).
Pada penelitian ini akan dilihat apakah terjadi mutasi pada posisi 3243 dari basa A ke G. Jenis
mutasi A ke G ini merupakan jenis mutasi substitusi transisi karena terjadi substitusi basa
purin adenin (A) ke basa purin guanin (G). Hasil analisis secara keseluruhan menunjukkan
bahwa pada sampel negatif-diabetes tidak terdapat mutasi pada daerah 3030-3800, terutama
posisi 3243 yang diduga sebagai mutasi titik penyebab Maternally Inherited Diabetes and
Deafness. Setelah itu, dilakukan analisis urutan nukleotida terhadap sampel positif-diabetes
(sampel DM) dengan urutan standar CRS dan sampel negatif-diabetes, yang ditunjukkan pada
Gambar 4.6. Hasil analisis sampel positif-diabetes (sampel DM) terhadap urutan CRS dan
43
terhadap sampel negatif-diabetes menunjukkan bahwa tidak terjadi mutasi pada posisi 3243
dari basa A ke G seperti yang terlihat pada Gambar 4.6 yang dilingkari oleh tanda merah. Oleh
karena itu, disimpulkan bahwa pada sampel DM yang ada di laboratorium, penyakit Diabetes
Mellitus yang diderita individu tersebut tidak ada kaitannya dengan mutasi A3243G penyebab
Maternally Inherited Diabetes and Deafness.
Gambar 4. 6
Hasil elektroforegram sampel DM
Hasil elektroforegram pada sampel positif-diabetes (sampel DM) menunjukkan bahwa pada posisi
3243 tidak terjadi mutasi dari basa A ke basa G.
Analisis tetap dilanjutkan pada daerah 3030-3800 untuk sampel DM dan ternyata ditemukan
mutasi pada posisi 3606, yaitu mutasi jenis substitusi transisi dari basa A ke basa G. Mutasi
ini terjadi pada gen tRNALeu, dan asam amino Leusin yang dibawa oleh tRNA ini merupakan
salah satu asam amino penyusun enzim ND1 (NADH Dehidrogenase subunit I). Sehingga jika
terjadi perubahan asam amino Leu penyusun enzim ND1, diduga terjadi perubahan struktur
enzim dan akhirnya mengubah enzim ND1 tersebut. Mutasi A3606G yang terdeteksi ini dapat
dilihat dari elektroforegram pada Gambar 4.7.
44
Gambar 4. 7
Hasil elektroforegram sampel DM
Hasil analisis selanjutnya pada sampel positif-diabetes (sampel DM) ditemukan adanya mutasi pada
posisi 3606 dari basa A ke basa G. Mutasi A3606G ini merupakan mutasi yang terjadi pada gen
tRNALeu.
Seperti yang telah dipaparkan bahwa enzim NADH Dehidrogenase subunit 1 ini merupakan
enzim yang terlibat pada sistem respirasi sel di mitokondria dan berpengaruh pada sekresi
insulin pada sel beta pankreas manusia. Secara keseluruhan bahwa mutasi A3606G pada
tRNALeu ini yang berhubungan dengan enzim NADH Dehidrogenase subunit 1, diduga
memiliki kaitannya dengan sekresi insulin pada sel beta-pankreas. Telah ada laporan atau
publikasi sebelumnya di tahun 2007 oleh peneliti China mengenai mutasi A3606G ini. Pada
publikasi tersebut dilaporkan bahwa mutasi A3606G telah ditemukan pada populasi Han di
China yang juga menderita Diabetes Mellitus tipe-2 (Liu, Song-Mei, et al., 2007). Walaupun
mutasi A3606G yang ditemukan pada sampel DM dalam penelitian ini serupa dengan mutasi
yang terjadi penderita Diabetes Mellitus tipe-2 di China, akan tetapi mutasi A3606G ini
terbilang merupakan mutasi baru yang pernah dilaporkan terjadi pada penderita diabetes di
Indonesia. Hal ini karena belum ada laporan mengenai mutasi A3606G pada DNA
mitokondria untuk penderita diabetes di Indonesia terutama pada populasi suku Sunda. Oleh
karena itu, mutasi A3606G yang ditemukan pada sampel DM di Laboratorium Biokimia ITB
ini diduga memiliki kaitan dengan penyakit Diabetes Mellitus yang diderita oleh individu
tersebut. Mutasi A3606G yang ditemukan pada populasi di China ini telah dilaporkan di
GenBank dengan kode akses DQ092356, DQ473644, dan DQ473645 (Liu, Song-Mei, et al.,
2007). Akan tetapi, mutasi ini belum dilaporkan pada basis data Mitomap sebagai mutasi yang
berhubungan dengan penyakit Diabetes Mellitus.
45
4.7
Perbandingan Mutasi Sampel dengan Data Mitomap
Selain dilakukan perbandingan dengan standar CRS, urutan nukleotida sampel DM ini
kemudian dibandingkan dengan data Mitomap. Setelah dilakukan pencarian data mutasi
substitusi yang berkaitan dengan penyakit pada Mitomap, ternyata tidak terdapat dalam basis
data tersebut. Oleh karena mutasi A3606G ini tidak terdapat dalam basis data di Mitomap
(Gambar 4.9), sehingga dapat dikatakan bahwa mutasi tersebut belum dilaporkan. Tampilan
Mitomap pada situs http://www.mitomap.org dengan tanggal akses 7 Juni 2008 mengenai
mutasi yang berkaitan dengan penyakit dapat dilihat pada Gambar 4.8 dan Gambar 4.9.
Gambar 4. 8
Contoh tampilan Mitomap
Contoh tampilan Mitomap tentang mutasi mtDNA (substitusi nukleotida) yang berhubungan dengan
penyakit dengan perubahan terakhir 2 Juni 2008 dan tanggal akses 7 Juni 2008.
46
Gambar 4. 9
Contoh tampilan Mitomap
Contoh tampilan Mitomap tentang mutasi mtDNA yang berhubungan dengan penyakit, dan dari data
di atas pada tanda lingkaran dan tanda panah berwana merah dapat dilihat bahwa mutasi A3606G
yang ditemukan di sampel DM pada penelitian kali ini belum dilaporkan pada situs ini (Mitomap).
Perubahan data terakhir pada tanggal 2 Juni 2008 dan tanggal akses 7 Juni 2008.
Setelah melalui hasil analisis mutasi dari data elektroforegram berupa urutan nukleotida
dengan panjang fragmen 850 pasang basa pada sampel DM yang ada, maka metode tersebut
telah berhasil digunakan untuk mengamplifikasi daerah fragmen-B (daerah 2364-4249) dalam
satu tahap reaksi. Melalui metode amplifikasi DNA mitokondria dari sampel sel epitel mulut
pada fragmen 2364-4249 ini telah berhasil menghasilkan satu pita fragmen yang belum pernah
dilaporkan sebelumnya. Mutasi A3606G yang ditemukan pada sampel DM di laboratorium
Biokimia ITB diduga memiliki kaitannya dengan penyakit Diabetes Mellitus yang diderita.
Metoda tersebut diharapkan dapat memberikan manfaat bagi penelitian DNA mitokondria
selanjutnya dalam menganalisis terjadinya mutasi, baik berupa substitusi transisi, substitusi
transversi, delesi, maupun insersi pada genom DNA mitokondria.
47