ii. bahan dan metode

II. BAHAN DAN METODE
2.1
Perlakuan Penelitian
Rancangan penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 5
perlakuan masing-masing 4 ulangan. Adapun perlakuan yang diberikan dapat
dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Perlakuan penelitian kinerja imunitas udang vaname Litopenaeus
vannamei dalam teknologi bioflok dan probiotik terhadap koinfeksi
IMNV (infectious myonecrosis virus) dan Vibrio harveyi
Kode
Keterangan perlakuan
K-
Kontrol Negatif, tanpa penambahan probiotik SKT-b maupun
molase, tanpa koinfeksi virus dan bakteri
K+
Kontrol Positif, tanpa penambahan probiotik SKT-b maupun
molase, serta dikoinfeksi virus dan bakteri
Pro
Probiotik, diberi penambahan probiotik SKT-b serta dikoinfeksi
virus dan bakteri
BFT
Bioflok, diberi penambahan molase dan dikoinfeksi virus dan
bakteri
Pro+BFT
Probiotik+Bioflok, diberi penambahan probiotik dan molase, serta
dikoinfeksi virus dan bakteri
2.2
Persiapan Wadah dan Hewan Uji
Wadah yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium dengan ukuran
60 cm x 30 cm x 35 cm. Sebelum digunakan, akuarium dibersihkan terlebih
dahulu menggunakan deterjen dan dikeringkan. Kemudian akuarium diisi air laut
sebanyak 45 L. Air laut didisinfeksi dengan larutan klorin 30 mg/L dan diaerasi
kuat selama 24 jam. Kemudian ditambahkan sodium tiosulfat 15 mg/L untuk
menetralkan kandungan klorin dan diaerasi kuat selama minimal 4 jam.
Hewan uji yang digunakan adalah udang vaname Litopenaeus vannamei
yang berasal dari Labuan, Banten. Sebelum diberi perlakuan, udang vaname
dipelihara selama 30 hari. Udang vaname yang digunakan memiliki bobot ratarata 0,48 + 0,03 g.
4
2.3
Persiapan Bakteri Probiotik
2.3.1 Pembuatan Mutan Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b (RfR)
Bakteri probiotik yang digunakan yaitu Vibrio SKT-b yang merupakan hasil
penapisan dari media kultur Skeletonema sp. di lingkungan pembenihan udang
windu, Labuan Banten (Widanarni et al. 2003). Bakteri Vibrio SKT-b dibuat
resisten terhadap antibiotik rifampisin sebagai penanda molekuler untuk
membedakan bakteri yang diinokulasikan dengan bakteri yang sebelumnya telah
ada pada media pemeliharaan maupun tubuh udang (Ayuzar 2009). Untuk
selanjutnya bakteri SKT-b yang telah resisten rifampisin disebut dengan SKT-bR.
Bakteri SKT-bR diperoleh dengan menyebar biakan cair SKT-b pada media
TCBS agar yang telah diberi rifampisin 50 µg/mL (Ayuzar 2009). Koloni yang
tumbuh kemudian kultur kembali untuk mendapatkan isolat murni SKT-b yang
resisten terhadap rifampisin.
2.3.2 Kultur Bakteri SKT-bR
Kultur bakteri probiotik SKT-bR dilakukan pada media SWC yang
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Kemudian probiotik diinokulasikan ke
dalam media SWC cair dan diletakkan pada water bath shaker selama 24 jam
dengan suhu 29-30 0C dengan kecepatan 160 rpm. Setelah 24 jam, didapatkan
hasil kultur cair bakteri SKT-bR dengan kepadatan 108 CFU/mL. Kultur cair
tersebut digunakan sebagai probiotik yang ditambahkan pada media pemeliharaan
dengan kepadatan yang diinginkan yaitu 104 CFU/mL setiap 5 hari sekali (Saputra
2008).
2.4
Pemeliharaan Udang Uji
Udang dipelihara dengan padat tebar 25 ekor/akuarium. Jumlah pakan yang
diberikan dengan tingkat pemberian pakan 15 % bobot biomassa dengan frekuensi
pemberian pakan 4 kali sehari yaitu pukul 07.00, 11.00, 15.00 dan 20.00.
Pemberian molase dilakukan 3 kali sehari 2 jam setelah waktu pemberian pakan.
Inokulasi bakteri probiotik dilakukan setiap 5 hari sekali dengan konsentrasi 10 4
CFU/mL. Pemeliharaan udang dilakukan selama 6 minggu (perlakuan).
Selanjutnya udang diuji tantang koinfeksi IMNV dan bakteri Vibrio harveyi
dengan pengamatan selama 10 hari. Selama pemeliharaan, dilakukan pergantian
5
air satu kali seminggu sebanyak 50 % untuk perlakuan tanpa penambahan karbon
(molase), sedangkan untuk perlakuan penambahan karbon tidak dilakukan
pergantian air sama sekali selama pemeliharaan udang.
2.5
Prosedur Penambahan Karbon
Sumber karbon yang digunakan adalah molase dengan persentase
kandungan karbon sebesar 44,42 %. Pemberian karbon dengan C/N rasio 10
(Avnimelech 1999). Penambahan molase pada media pemeliharaan sesuai dengan
perhitungan yang dilakukan oleh Avnimelech (1999) (Lampiran 1).
2.6
Prosedur Uji Tantang
Uji tantang yang dilakukan adalah koinfeksi virus myo (IMNV) dan bakteri
Vibrio
harveyi.
Udang
vaname
positif
IMNV
didapatkan
dari
Balai
Pengembangan Budidaya Air Payau (BPBAP) Situbondo, Jawa Timur yang
diekstrak berdasarkan prosedur yang dilakukan Escobedo et al. (2006). Adapun
prosedur pembuatan ekstrak IMNV adalah sebagai berikut. Sebanyak 5 ekor
udang positif IMNV (bobot rata-rata 10 g) dibersihkan dan dibuang bagian
hepatopankreas, usus, dan karapasnya. Kemudian daging udang dicacah hingga
halus dan didapatkan hasil cacahan udang positif IMNV dengan volume 10 mL
yang dilarutkan dalam PBS sebanyak 100 mL (10x volume daging). Selanjutnya
disentrifuse dengan kecepatan 6.500 rpm pada suhu 4 oC selama 20 menit.
Supernatan diambil dan dimasukkan dalam mikrotube baru, kemudian disentrifuse
dengan kecepatan 13.000 rpm (4 oC) selama 20 menit. Selanjutnya supernatan
diambil dan difilter dengan syringe filter berukuran 0,45 µm. Hasil filter itu
merupakan stok ekstrak virus IMNV dan disimpan pada suhu -70 oC.
Sebanyak 10 ekor udang uji (masing-masing ulangan) dipilih untuk diinjeksi
dengan IMNV pada bagian punggung (antara segmen 3 dan 4) sebanyak 100 µL
(Tang et al. 2005). Setelah itu dilakukan infeksi selanjutnya yaitu perendaman
dengan bakteri Vibrio harveyi berdasarkan prosedur yang dilakukan Widagdo
(2011). Sebelumnya dilakukan kultur cair bakteri Vibrio harveyi pada media SWC
dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Kemudian didapatkan hasil kultur
cair bakteri V. harveyi dengan kepadatan awal 108 CFU/mL. Perendaman
dilakukan dengan kepadatan bakteri 106 CFU/mL selama 30 menit pada akuarium
6
terpisah dengan kepadatan 10 ekor/L. Setelah dilakukan perendaman, udang uji
dikembalikan pada akuarium pemeliharaan. Pengamatan dan pemeliharaan setelah
koinfeksi dilakukan selama 10 hari.
2.7
Parameter Pengamatan
2.7.1 Parameter Imun
Parameter imun udang yang diukur terdiri dari total haemocyte count
(THC), aktivitas phenoloxydase (PO), dan respiratory burst (RB) yang dilakukan
sebelum dan sesudah uji tantang. Sampel darah diambil dari 8 ekor udang tiap
perlakuan yang dipilih secara acak. Prosedur pengukuran parameter imun sebagai
berikut:
2.7.2 Total Haemocyte Count (THC)
Sebanyak 0,2 mL hemolim udang diambil dengan menggunakan jarum
suntik 1 mL yang telah berisi 0,2 mL antikoagulan. Kemudian campuran
hemolim-antikoagulan divorteks hingga merata. Campuran hemolim-antikoagulan
tersebut kemudian diteteskan pada haemocytometer. Selanjutnya THC langsung
dihitung di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
2.7.3 Aktivitas Phenoloxydase (PO) (Liu dan Chen 2004)
Aktivitas PO haemocyte diukur berdasarkan formasi dopachrome yang
dihasilkan oleh L-DOPA (L-dihydroxyphenylalanine). Sebanyak 1 mL campuran
hemolim-antikoagulan disentrifuse pada 1.500 rpm selama 10 menit pada
temperatur 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet disuspensi kembali secara perlahan
dengan menambahkan 1 mL larutan cacodylate-citrate buffer (0,01 M sodium
cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, pH 7) dan
disentrifuse kembali (1.500 rpm selama 10 menit pada temperatur 4
o
C).
Supernatan yang terbentuk dibuang dan ditambahkan 200 µL cacodylate-citrate
buffer (0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium
citrate, pH 7). Suspensi sel sebanyak 100 µL kemudian diinkubasi dengan 50 µL
trypsin (1 mg/mL cacodylate buffer) sebagai aktivator selama 10 menit pada
temperatur 25-26 oC. Selanjutnya ditambahkan 50 µL L-DOPA (3 mg/mL
cacodylate buffer), didiamkan selama 5 menit dan ditambahkan 800 µL
7
cacodylate buffer. Densitas optikal (OD) diukur dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Larutan standar mengandung
100 µL suspensi hemosit, 50 µL cacodylate buffer (pengganti trypsin), dan 50 µL
L-DOPA. Densitas optikal (OD) dari aktivitas PO dinyatakan sebagai formasi
dopachrome dalam 100 µL hemolim.
2.7.4 Respiratory Burst (RB) (Cheng et al. 2004)
Respiratory burst dari hemosit diukur berdasarkan reduksi NBT (nitroblue
tetrazolium) sebagai ukuran superoxide anion (O2-). Sebanyak 50 µL campuran
hemolim-antikoagulan diinkubasi selama 30 menit dalam suhu ruang. Selanjutnya
disentrifuse dengan kecepatan 3.000 rpm selama 20 menit dan supernatan
dibuang. Ditambahkan 100 µL NBT dalam larutan HBSS (hank's buffered salt
solution dengan konsentrasi 0,3 % dan didiamkan selama 2 jam pada suhu ruang.
Kemudian disentrifuse 3.000 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang dan
ditambahkan 100 µL metanol absolut untuk selanjutnya disentrifuse 3.000 rpm
selama 10 menit (supernatan dibuang). Pelet yang terbentuk kemudian dibilas
sebanyak 2 kali dengan metanol 70 %. Selanjutnya 120 µL KOH (2M) dan 140
µL DMSO (dimethylsulfoxide) ditambahkan untuk melarutkan pelet. Pelet yang
telah larut kemudian dimasukkan ke dalam microplate untuk diukur densitas
optikal (OD) menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 630 nm.
Respiratory burst dinyatakan sebagai reduksi NBT per 10 µL hemolim.
2.7.5 Sintasan
Sintasan atau tingkat kelangsungan hidup udang uji dapat diketahui dari
jumlah udang pada akhir perlakuan dibagi dengan jumlah udang awal (Effendi
2004), dirumuskan sebagai berikut :
Sintasan = [Nt/No] x 100 %
Keterangan :
No = Jumlah udang pada awal perlakuan (ekor)
Nt = Jumlah udang pada akhir perlakuan (ekor)
2.7.6 Perhitungan Bakteri dalam Usus
Perhitungan bakteri pada usus udang dilakukan pada awal pemeliharaan,
akhir perlakuan dan akhir pemeliharaan (setelah uji tantang). Dilakukan
8
perhitungan populasi bakteri total dan total bakteri Vibrio SKT-bR. Sampel udang
diambil sebanyak 4 ekor dari masing-masing perlakuan yang dipilih secara acak.
Udang dibedah dan diambil ususnya, kemudian usus ditimbang dan dimasukkan
ke dalam mikrotube steril yang berisi air laut steril 1 mL dan digerus. Dari hasil
gerusan usus dalam air laut steril dilakukan pengenceran berseri. Selanjutnya hasil
pengenceran berseri disebar pada media SWC agar (sea water complete) pada
tingkat pengenceran 10-5, 10-6,dan 10-7 untuk perhitungan bakteri total dalam usus.
Perhitungan total bakteri Vibrio SKT-bR tidak dilakukan pengenceran berseri (100)
dan langsung disebar pada media TCBS agar (thiosulfate citrate bile-salt sucrose)
yang telah diberi rifampisin (50 µg/mL). Perhitungan bakteri dilakukan
menggunakan metode hitungan cawan.
2.7.7 Perhitungan Populasi Bakteri Vibrio SKT-bR Media Pemeliharaan
Populasi Vibrio SKT-bR pada media pemeliharaan dengan perlakuan
probiotik dilakukan setiap 5 hari sekali selama masa pemeliharaan. Sampel air
sebanyak 1 mL diambil wadah pemeliharaan perlakuan Pro dan Pro+BFT sebelum
dan setelah dilakukan penambahan probiotik SKT-bR, kemudian dilakukan
perhitungan bakteri dengan metode cawan sebar pada media TCBS agar yang
diberi rifampisin (50 µg/mL) yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
2.7.8 Kualitas Air
Pengukuran kualitas air dilakukan dilakukan satu minggu sekali yang
meliputi pengukuran suhu, oksigen terlarut (DO), pH, salinitas, total amoniak
nitrogen (TAN), nitrat, nitrit, TSS (total suspended solid) dan VSS (volatile
suspended solid).
2.8
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam dengan tingkat
kepercayaan 95%. Kemudian dilakukan uji lanjut Duncan dengan menggunakan
software SPSS 17.0 untuk melihat perbedaan antar perlakuan.
9