Pongo Pygmaeus - Fakultas Kedokteran Hewan

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT
ASAL FESES ORANGUTAN (Pongo pygmaeus) SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF LACTIC ACID BACTERIA FROM
ORANGUTAN’S (Pongo Pygmaeus) FECES AS PROBIOTICS CANDIDATE
Isma Prasthani H.P, Masdiana C. Padaga, Dyah A. Oktavianie
Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya
Email : [email protected];
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan mengetahui potensi probiotik
BAL pada feses orangutan (Pongo pygmaeus). Sampel feses diisolasi dari 3 orangutan berusia lebih
kurang 2 tahun yang diambil dari Taman Safari Indonesia II. Karakterisasi BAL berdasarkan sifat
fenotip dan profil protein menggunakan SDS-PAGE. Kemampuan BAL sebagai probiotik
berdasarkan ketahanan isolat pada kondisi saluran pencernaan menggunakan model cairan lambung
pH 2,5 dan cairan getah empedu (Oxgall 0,3%). Hasil isolasi feses orangutan ditemukan kisaran
jumlah BAL dengan rerata 5,09±1,74 107 cfu/ml yang ditumbuhkan secara aerobic dan 5,86±2,15x107
cfu/ml yang ditumbuhkan secara anaerobic. Dari 14 isolat BAL menunjukkan 2 isolat berbentuk
kokus dan 12 isolat berbentuk batang yang berhasil diisolasi dari feses orangutan. 14 isolat BAL hasil
karakterisasi fenotip berhasil dilakukan pendugaan isolat mendekati genus Lactobacillus sp,
Pedicoccus sp, Aerococcus sp dan Enterococcus sp. Berdasarkan hasil SDS-PAGE menunjukkan
sebagian besar isolat BAL memiliki pita protein fungsional yang sama dengan berat molekul 111,6
kDa dan 99,96 kDa yang diduga merupakan protein bile salt hidrolase dan pita protein dengan berat
molekul 33,25 kDa dan 31,47 kDa yang diduga merupakan protein bacteriocins. Hasil uji potensi
BAL sebagai kandidat probiotik menunjukkan bahwa 14 isolat BAL mempunyai kemampuan tumbuh
yang tinggi pada media asam (pH 2,5) dan garam empedu (Oxgall 0,3 %). Dapat disimpulkan bahwa
Isolat BAL hasil isolasi dari feses orangutan (Pongo pygmaeus) memiliki potensi untuk
dikembangkan sebagai probiotik.
Kata kunci : Orangutan, BAL, Karakterisasi, Probiotik
ABSTRACT
This study was aimed to isolate, characterize and discovered a potency of probiotics from
orangutan (Pongo pygmaeus) feces. Feces samples were used from 3 orangutans approximately 2
years old, which were taken from Taman Safari Indonesia II. LAB characterization based on
phenotype and protein profile was conducted by SDS-PAGE. Pottential assay of LAB as probiotic
candidate was discovered by isolates resistance in gastrointestinal with pH of gastric fluid was 2.5 and
bile fluid (Oxgall) was 0,3 %. The result of isolation LAB from orangutan feces was found LAB with
average 5.09 ± 1.74 107 cfu / ml in aerobic condition and 5.86 ± 2.15 x107 cfu / ml in anaerobic
condition. The results showed from 14 isolates of LAB there were 2 isolates with cocci form and 12
isolates with rods form. From phenotypic characterization of 14 LAB isolates can be predicted that
the isolates have similiarity with Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus sp and Enterococcus
sp. Based on the results of SDS-PAGE, the majority of LAB isolates has a functional protein bands
with a molecular weight of 111.6 kDa and 99.96 kDa which suspected as bile salt hydrolase protein
and the protein bands with molecular weight 33.25 kDa and 31.47 kDa which suspected as
bacteriocins protein. The conclusion showed that the 14 LAB isolates from the orangutan (Pongo
pygmaeus) feces have a potency as a probiotic candidates.
Key words: Orangutan, LAB, Characterization, Probiotics
1
daging ayam mentah dan minuman
tradisional yogurt.
Namun demikian, penelitian tentang
BAL pada wild animal terutama orangutan
untuk mendapat isolat indigenous belum
pernah dilakukan sebelumnya dan perlu
penelitian lebih lanjut agar BAL dapat
berperan sebagai probiotik. Oleh karena itu,
penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi
dan
mengkarakterisasi
BAL
serta
mengetahui potensi BAL sebagai kandidat
probiotik yang diisolasi dari feses orangutan
(Pongo pygmaeus).
PENDAHULUAN
Pemanfaatan probiotik terbukti telah
meningkatkan kesehatan saluran pencernaan.
Sesuai yang disampaikan Schrezenmeir & de
Vrese (2008) bahwa probiotik merupakan
mikroorganisme hidup non patogen yang
berpengaruh positif bagi kesehatan hewan
dengan cara memperbaiki keseimbangan
mikroflora indigenous dalam saluran
pencernaan. Probiotik bermanfaat untuk
kesehatan antara lain: meningkatkan
ketahanan terhadap penyakit infeksi terutama
diare, menurunkan resiko lactose intolerance
dan
meningkatkan
sistem
imunitas
(Roberfroid, 2000). Penelitian mengenai
bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi
probiotik untuk kesehatan telah banyak
dilakukan seperti pemanfaatan probiotik
dalam penanggulangan penyakit infeksi
saluran pencernaan (Laudanno, 2006;
Savadogo, 2006). Beberapa spesies BAL
yang umum digunakan sebagai probiotik
adalah lactobacillus, enterococcus dan
lactococcus (Gibson, 2000).
Orangutan merupakan satwa liar yang
rentan terserang penyakit infeksi saluran
pencernaan. Berdasarkan data yang diperoleh
dari Taman Safari
tahun 2003-2004
penyakit yang sering menyerang orangutan
adalah diare yang merupakan tanda
terjadinya enteritis (Tilley & Smith, 1980;
Lestari, 2004). Data tersebut didukung oleh
studi yang dilakukan Minarwanto (2008)
bahwa kasus penyakit pada orangutan
sebagian besar berupa gangguan pencernaan
seperti enteritis, gastritis dan lactose
intolerance. Penggunaan bakteri probiotik
dari saluran pencernaan orangutan mampu
menurunkan resiko gangguan pencernaan
karena lebih mudah beradaptasi dengan
lingkungannya sehingga keseimbangan
mikroflora dengan cepat dapat diperoleh.
Penelitian terdahulu mengenai isolasi
dan karakterisasi BAL sebagai kandidat
probiotik telah dilakukan oleh Beasly, 2004;
Lengkey, 2009; Azhari, 2011 yang
melakukan
isolasi,
identifikasi
dan
eksploitasi BAL dari mikrobiota manusia
MATERI DAN METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan adalah
seperangkat alat steril pengambilan sampel,
glass ware, vortex (Maxi Mix II), Laminar
Air Flow (LAF) (Nuaire Labgard Class II),
inkubator (MMM Medcenter), mikroskop
cahaya (Olympus TL2), foto digital
mikroskopik (Olympus CX41), anerobic jar
(OXOID), spektrofotometer (Genesys 20),
sentrifugasi, Ultrasonic clearer (Branson
200), power pac basic (Bio-Rad), cetakan gel
20x16x1 cm3, elektroforesis chamber.
Sedangkan bahan-bahan yang digunakan
adalah Peptone (HIMEDIA REF RM 001500G), MRS Agar (De Man,Rogosa And
Sharpe 1.10660.0500), MRS broth (Merck),
beef ekstrak, Oksidase stick, OF Basal
medium (MERCK 1.10282), H2O2 3 %,
Oksidase kit, NaCl 6,5%, 10%, dan 18%,
pewarna gram, perwarna spora, cairan
empedu (Oxgall) 0,3%, HCl, NaOH, Gel
Polyacrylamide, inhibitor protease 1 mM
PSMF, cell-lytic B-II-Bactreial solution, 0,3
% Tris, 1,44% glycine, 0,1% SDS,
Coomassie blue R-250 (MP001), 50%
methanol, 10 % acetic acid, Page Ruler TM
Prestained Protein Ladder Plus (SM1811).
Prosedur Penelitian
Preparasi Sampel Feses
Penelitian ini menggunakan sampel
feses yang berasal dari tiga orangutan yang
berusia lebih kurang 2 tahun diambil dari
2
TSI II Prigen-Pasuruan. Pengambilan sampel
diambil dilakukan 2 kali ulangan dan sampel
yang diambil pada setiap ulangan dilakukan
duplo sebanyak 1 gram secara aseptis
menggunakan cotton swab yang dimasukan
kedalam botol sampel steril dan disimpan
pada suhu 5oC.
pair group
averages).
method
using
arithmetic
Uji Potensi Bakteri Asam Laktat sebagai
Kandidat Probiotik (Lin et al., 2006)
Uji potensi isolat BAL sebagai
probiotik meliputi uji ketahanan BAL
terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) dan
uji ketahanan terhadap sekresi garam
empedu (Oxgall 0,3%) dengan menggunakan
media MRS broth dengan menginokulasi
isolat bakteri pada populasi awal minimal
108 cfu/ml kedalam media uji.
a) Uji ketahanan BAL terhadap asam
lambung
Isolat BAL diinokulasikan kedalam
medium selektif MRS broth
yang
ditambahkan HCL 2 N sehingga pH
mencapai 2,5-3 (disesuaikan dengan pH
lambung). Selanjutnya isolat diinkubasi pada
suhu 37oC selama 3-4 jam. Pengamatan
pertumbuhan isolat dinyatakan dengan
tingkat
kekeruhan
menggunakan
spektrofotometer berdasarkan nilai OD
(optical dencity) pada λ= 660 nm dan
penanaman 1 ml isolat ke dalam media
MRSA dengan metode pourplate yang
kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama
24 jam. Intepretasi hasil positif akan terlihat
dengan peningkatan nilai OD dan
pertumbuhan isolat pada media MRSA
setelah inkubasi.
b) Uji ketahanan BAL terhadap garam
empedu
ketahanan BAL terhadap getah empedu
disesuaikan dengan kadar garam empedu
pada saluran pencernaan yaitu dengan
menggunakan oxgall sebanyak 0,3 % w/v
dalam media MRS broth dengan pH 7,2.
Pengujian pada konsentrasi garam empedu
0,3 % mengacu pada Marteu et al., (1997).
Kultur kerja isolat BAL diinokulasikan ke
dalam medium selektif MRS broth yang
ditambahkan
garam
empedu
0,3%.
Selanjutnya isolat diinkubasi pada suhu 37oC
selama 3-4 jam. Pengamatan pertumbuhan
isolat dinyatakan dengan tingkat kekeruhan
menggunakan spektrofotometer berdasarkan
nilai OD (optical dencity) pada λ= 660 nm
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi bakteri dilakukan sesuai dengan
Standar Nasional Indonesia (SNI) ISO 68871: 2012. Sampel feses yang telah dikoleksi
dilakukan pengenceran secara berseri (101
,10-2, 10-3, 10-4,10-5dan 10-6) menggunakan
pepton water steril. Hasil pengenceran 10-2,
10-4, dan 10-6 ditanam menggunakan metode
pour plate pada media selektif MRS agar
(MRSA) (steril, diinkubasi secara anerobic
dalam 5% CO2 pada suhu 37°C selama 48
jam.
Pemurnian
bakteri
dengan
menggunakan teknik penggoresan kuadran
pada media MRSA. Target pemurnian adalah
koloni yang memiliki morfologi koloni
berbeda, bersifat katalase negatif dan
termasuk kedalam bakteri Gram positif.
Selanjutnya, dipilih 3 jenis koloni dominan
untuk dilakukan karakterisasi koloni dan
bakteri. Setiap koloni dibuat triplo sehingga
diperoleh 54 isolat yang berasal dari
orangutan A, orangutan B dan orangutan C.
Karakterisasi Fenotip Bakteri Asam Laktat
Karakterisasi isolat BAL berpedoman
pada buku Cowan and Steel’s Manual for the
identification of medical bacteria (Barrow &
Feltham, 1993). Sifat morfologi yang diamati
meliputi morfologi koloni dan morfologi sel.
Pengamatan fisiologis yang meliputi
motilitas, uji kemampuan tumbuh pada suhu
15°C, 37°C, dan 45°C, pada MRS broth
dengan konsentrasi NaCl 6,5%, 10%, dan
18% Sedangkan karakterisasi secara
biokimiawi yang dilakukan antara lain : uji
katalase, oksidase, Indole, reduksi nitrat,
hidrolisis pati, oksidatif-fermentatif (OF) dan
uji fermentasi glukosa. Pendugaan isolat
BAL berdasarkan nilai uji similaritas yang
menggunakan metode UPGMA (Unwighted
3
dan penanaman 1 ml isolat ke dalam media
MRSA dengan metode pourplate yang
kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama
24 jam. Intepretasi hasil yang menandakan
positif akan terlihat dengan peningkatan nilai
OD dan pertumbuhan isolat pada media
MRSA setelah inkubasi.
ditambahkan 5 ml phospat buffer 0,1 M
(pH7,4). Sel bakteri didapat setelah
dilakukan sentifugasi pada kecepatan 6000
rpm selama 15 menit. Sel bakteri
sebelumnya dilakukan sonifikasi selama 10
menit. Pellet ditambahkan etanol 96 %
dengan rasio (1:1) kemudian di inkubasi
pada suhu dingin -20oC selama 24 jam dan di
sentifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 10 menit. Pellet yang dihasilkan
selanjutnya di tambahkan Tris Hcl dengan
rasio (1:1). Protein marker yang digunakan
dalam penelitian ini PageRuler™ Prestained
Protein Ladder Plus (10 hingga 250 kDa).
Analisa Profil Protein BAL menggunakan
SDS-PAGE (Ghazi et al., 2009)
Hanya 9 isolat representatif dipilih
berdasarkan nilai uji similaritas terdekat
untuk diketahui profil proteinnya. Preparasi
sampel protein menggunakan fresh culture
isolat BAL dalam media MRS broth yang
Rerata jumlah BAL (cfu/ml) pada
sampel feses tiga orangutan usia lebih
kurang 2 tahun di TSI II dapat dilihat pada
Tabel 1 berikut ini :
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah Bakteri Asam Laktat Pada Feses
Orangutan
Tabel 1. Rerata Jumlah BAL pada Feses Orangutan di TSI II
Kode Sampel
Rerata Jumlah Koloni BAL
(107cfu/ml)*
Aerobic
Anaerobic
3,20±1,33
3,47±1,68
A
6,82±1,11
7,67±1,28
B
5,25±0,11
6.45±0,41
C
5,09±1,74
5,86±2,15
Rerata
5,09±1,74x107 cfu/ ml. Menurut Candra
(2006)
BAL
termasuk
kedalam
mikroorganisme bersifat anaerob facultatif
yang menggunakan proses fermentasi
sebagai
metabolisme
utama
dalam
menghasilkan energi, tergantung dari
ketersedian oksigen dalam lingkungan
pertumbuhannya. Pada Tabel 1. dapat dilihat
bahwa masing-masing individu orangutan
mempunyai rerata jumlah koloni
BAL
berbeda. Perbedaan jumlah koloni BAL pada
saluran pencernaan orangutan dipengaruhi
oleh kapasitas fermentasi pada colon yang
memungkinkan
bakteri
probiotik
berkembangbiak dengan jumlah yang
berbeda. Menurut Freitas et al., (2003)
keseimbangan jumlah BAL yang ada di
saluran pencernaan sangat bergantung pada
kebiasaan makan dan kemampuan orangutan
Pada penelitian ini BAL memiliki
jumlah yang cukup besar pada populasi
mikroflora dalam feses orangutan dapat
dilihat pada Tabel 1. Menurut Salminen
(1998) saluran pencernaan orangutan
diperkirakan mengandung flora normal
mencapai 1012 bakteri per gram isi saluran
cerna dan lebih kurang 500 spesies
merupakan BAL. Penelitian terdahulu pernah
dilakukan oleh Pertiwi (2008) yang berhasil
mengisolasi BAL dari feses tikus dengan
9
rerata jumlah BAL berkisar 9,12 x10 cfu/ml.
Berdasarkan Tabel 1. diketahui bahwa
sampel feses orangutan yang di inkubasi
secara anaerobic memiliki kisaran jumlah
BAL dengan rerata 5,86±2,15x107 cfu/ml.
Nilai ini lebih tinggi dibandingkan sampel
feses yang diinkubasi secara aerobic yang
memiliki kisaran jumlah BAL dengan rerata
4
untuk memfermentasi serat dalam jumlah
yang signifikan.
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi BAL asal feses orangutan
(Pongo pygmaeus) diperoleh 54 koloni
(Lampiran 5) setelah dilakukan pewarnaan
Gram dan Uji katalase di dapatkan 14 koloni
murni dipilih berdasarkan kemampuan tubuh
isolat dengan karakteristik yang disajikan
dalam Tabel 2.
Tabel 2. Karakterisasi Isolat BAL
Karakteristik
fenotipe
Growth in air
Anaerobic
Suhu 370C
Suhu 450C
Suhu 150C
NaCl 6,5%
NaCl 10 %
NaCl 18 %
Oksidase
Katalase
Motilitas
Indole
Reduksi nitrat
Hidrolisis pati
O/F
Galaktosa
Glukosa
Xylose
Arabinos
Fruktosa
Laktosa
Maltose
Sukrosa
Manitol
AA
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
-
AF
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
-
AG
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
-
BD
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
-
CI
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
+
+
AK
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
AL
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
BM
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
BN
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
-
BO
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
CP
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
+
CQ
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
+
CR
+
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
AJ
5
Lactobacillus sp
Keterangan : O : Oksidatif; F: Fermentatif; (+): Reaksi positif; (-): Reaksi negatif.
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Enterococcus sp\
Aerococcus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
ccus spp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Pedicoccus sp
Ribose
Pendugaan
Genus
Kode Isolat
Karakterisasi isolat berpedoman pada
buku Cowan and Steel Manual of The
Identification of Medical Bacteria. Hasil
karakterisasi
isolat
dapat
dilakukan
Pendugaan isolat BAL mendekati genus
Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus
sp dan Enterococcus sp berdasarkan nilai uji
similaritas masing-masing isolat yang
disajikan dalam bentuk fenogram untuk
mengetahui jarak kedekatan antar isolat BAL
hasil isolasi dengan isolat BAL acuan. Nilai
similaritas mendekati 1 menunjukan bahwa
ada kemungkinan isolat tersebut dari genus
dan spesies yang sama. Dari nilai similaritas
diperoleh
14
isolat
BAL
yang
dikelompokkan kedalam 5 kelompok bakteri
yang memiliki genus dan spesies berbeda
seperti pada Tabel 3.
Tabel 3. Pengelompokan dugaan isolat BAL hasil karakterisasi berdasarkan nilai uji
similaritas dengan isolat acuan (Lactobacillus sp, Pedicoccus spp,
Aerococcus spp dan Enterococcus spp)
Kode
Sumber Isolat
Nilai
Dugaan isolat
Isolat
similaritas
CP
Orangutan C
0,919
Lactobacillus casei /plantarum
CQ
Orangutan C
0,919
Lactobacillus casei /plantarum
CR
Orangutan C
0,919
Lactobacillus casei /plantarum
BO
Orangutan B
1,000
Lactobacillus casei /plantarum
AL
Orangutan A
0,919
Lactobacillus casei/plantarum
AK
Orangutan A
0,919
Lactobacillus casei/plantarum
AJ
Orangutan A
1,000
Lactobacillus casei/plantarum
BN
Orangutan B
1,000
Lactobacillus acidophilus
AF
Orangutan A
0,944
Lactobacillus acidophilus
BD
Orangutan B
0,933
Lactobacillus delbrueckii /brevis
AG
Orangutan A
0,741
Lactobacillus delbrueckii /brevis
CI
Orangutan C
0,741
Lactobacillus delbrueckii /brevis
AA
Orangutan A
0,730
Pedicoccus sp
BM
Orangutan B
0,740
Aerococcus sp /Enterococcus sp
Berdasarkan Tabel 3 isolat BAL yang
terkoleksi dapat dikelompokkan menjadi 5
kelompok isolat BAL yang mempunyai
genus dan spesies yang berbeda. Kelompok
satu terdiri dari isolat CP, CR, CQ, BO, AL,
AK dan AJ yang memiliki karakteristik
mendekati spesies Lactobacillus casei dan
Lactobacillus plantarum. Kelompok dua
terdiri dari isolat BN dan AF yang memiliki
karakteristik mendekati spesies Lactobacillus
acidophilus. Kelompok tiga terdiri dari isolat
BD, AG dan CI yang memiliki karakteristik
mendekati spesies Lactobacillus delbrueckii
dan Lactobacillus brevis. Kelompok empat,
isolat AA yang memiliki karakteristik
mendekati genus Pedicoccus sp. Kelompok
lima, isolat BM yang memiliki karakteristik
mendekati genus Aerococcus sp dan
Enterococcus sp. Hasil karakterisasi isolat
BAL asal feses orangutan didominasi oleh
genus Lactobacillus sp. Menurut pendapat
Dibner & Richard (2005); Carol et al.,
(2011)
bahwa
koloni
BAL
genus
Lactobacillus banyak ditemukan pada
saluran pencernaan hewan.
Uji Potensi BAL sebagai Kandidat
Probiotik
Kondisi yang kritikal bagi BAL
pertama kali pada saat bakteri memasuki
saluran pencernaan, yakni terpapar pada
cairan asam lambung dan cairan garam
empedu yang ada di usus. Menurut Havenaar
et al., (1992) untuk mengembangkan galur
probiotik baru perlu dilakukan seleksi secara
6
in vitro yang meliputi sensitivitas ketahanan
terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) dan
cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %). Data
hasil ketahanan isolat terhadap asam
lambung dan cairan garam empedu dapat
dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Kemampuan hidup isolat BAL pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 % diukur
menggunakan spektrofotometer λ= 660nm dengan satuan Optical density
(OD)
Kode
Isolat
Nilai Optical dencity (OD) isolat pada jam kepH 2,5
Oxgall 0,3 %
t0
t4
t0
0,444
0,569
0,404
AA
0,439
0,546
0,402
BD
0,369
0,383
0,316
AF
0,521
0,677
0,521
AG
0,464
0,588
0,441
CI
0,504
0,529
0,457
AJ
0,428
0,508
0,365
AK
0.490
0,538
0,435
AL
0,476
0,539
0,414
BM
0,459
0,501
0,499
BN
0,537
0,618
0,497
BO
0,401
0,575
0,491
CP
0,501
0,593
0,504
CQ
0,455
0,567
0,438
CR
Keterangan : t0 : sebelum inkubasi; t4: setelah 4 jam inkubasi
Hasil kemampuan tumbuh isolat BAL
menunjukkan bahwa terdapat peningkatan
nilai OD dari sebelum inkubasi (t0) dan
setelah inkubasi (t4). Peningkatan nilai OD
menunjukkan isolat BAL yang diisolasi dari
feses orangutan mempunyai ketahanan cukup
tinggi terhadap cairan asam lambung dan
garam empedu.
t4
0,888
0,678
0,510
0,874
0,870
0,696
0,482
0,658
0,678
0,660
0,949
0,722
0,865
0,714
mempunyai ketahanan untuk beradaptasi
pada cairan asam lambung (pH 2,5) karena
kemampuannya dalam mempertahankan pH
sitoplasma melalui translokasi protein yang
dibantu oleh enzim. Enzim-enzim yang
berperan dalam ketahanan BAL terhadap
cairan asam lambung (pH 2,5) adalah enzim
histidin dekarboksilase, enzim arginin
deiminase dan enzim protease (De Angelis
et al., 2002; Casiano-Colon & Marquis
1998).
Isolat AA merupakan isolat BAL
berbentuk kokus memiliki ketahanan
terhadap cairan garam empedu (Oxgall 0,3
%) paling tinggi diantara isolat yang
berbentuk kokus. Isolat BO merupakan isolat
BAL berbentuk batang memiliki ketahanan
terhadap cairan garam empedu (Oxgall 0,3
%) paling tinggi diantara isolat yang
berbentuk batang. Hal ini menunjukkkan
Isolat CP merupakan isolat BAL
berbentuk batang yang memiliki ketahanan
terhadap cairan asam lambung (pH 2,5)
paling tinggi diantara isolat yang berbentuk
batang. Isolat AA merupakan isolat BAL
berbentuk kokus memiliki ketahanan
terhadap cairan asam lambung (pH 2,5)
paling tinggi diantara isolat yang berbentuk
kokus. Hal ini menunjukkkan bahwa Isolat
BAL yang di uji mampu melewati saluran
lambung yang bersifat asam. Isolat BAL
7
bahwa Isolat BAL yang di uji mampu
melewati saluran pencernaan terutama usus
tempat disekresikannya cairan garam
empedu.
Hasil
penelitian
terdahulu
(Kusumawati, 2002; Ngatriah et al., 2000;
Wijayanto, 2009) menunjukan bahwa BAL
memiliki ketahanan terhadap cairan garam
empedu yang beragam. Menurut Smet et al.,
(1995) beberapa jenis BAL memiliki enzim
bile salt hydrolase dengan aktivitas untuk
menghidrolisis garam empedu yang mampu
mengubah kemampuan fisik dari kimia
garam empedu sehingga tidak bersifat racun
bagi BAL. Hal ini yang menyebabkan isolat
BAL mempu bertahan pada kondisi kritikal
ketika terpapar pada cairan garam empedu
yang ada di usus.
Penanaman pada media MRSA
merupakan pengujian tahap lanjut terhadap
isolat BAL yang terlebih dahulu telah
ditumbuhkan pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 %.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolat
BAL mampu tumbuh dengan baik setelah
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam
(Gambar 1).
Gambar 1. Isolat BAL yang mempunyai kemampuan tumbuh paling tinggi pada media
MRSA setelah ditumbuhkan pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 %.
Menurut Zavaglia et al., (1998) dan
Jacobsen et al., (1999), bakteri yang berhasil
hidup setelah ditumbuhkan dalam media
selektif MRS yang ditambahkan oxgall 0,3
% dan pH asam dinyatakan bersifat tahan
terhadap garam empedu dan tahan terhadap
asam lambung.
mendukung hasil karakteristik fenotip isolat
BAL.
Dari
hasil
running
dengan
elektroforesis menggunakan acuan protein
marker PageRuler™ Prestained Protein
Ladder Plus (10 hingga 250 kDa) dapat
terdeteksi berat molekul isolat BAL dengan
kisaran 12, 34 kDa hingga 155,26 kDa, berat
molekul protein dan jumlah pita masingmasing isolat BAL dapat dilihat pada
(Gambar 2).
Analisa Profil Protein BAL
Analisa profil protein isolat akan
mendukung dari hasil karakterisasi isolat
BAL. Sesuai dengan pendapat Ghazi et al.,
(2009) yang menyatakan metode analisa
SDS-PAGE dengan ekspresi profil protein
yang berbeda dapat digunakan untuk
8
Marker
K (1)
K (2)
K (3)
K (4)
K (5)
Gambar 2. Profil Pita Protein Isolat BAL berdasarkan kelompok
Keterangan : K(1): kelompok isolat bakteri 1
K(2): kelompok isolat bakteri 2
K(3): kelompok isolat bakteri 3
K(4): kelompok isolat bakteri 4
K(5): kelompok isolat bakteri 5
Dari hasil SDS-PAGE dapat dilihat
karakteristik profil pita protein masingmasing isolat yang memperlihatkan jumlah
profil pita protein yang terdeteksi beserta
berat molekul protein terdeteksi. Isolat CR,
AJ dan BO memiliki karakteristik yang sama
ditunjukkan dengan adanya profil pita
protein dengan berat molekul 64,36 kDa
yang dimiliki ketiga isolat tersebut, antara AJ
dan BO memiliki kemiripan karakteristik
yang lebih tinggi dengan adanya 3 pita
protein yang sama dengan berat molekul
berturut-turut 111,6 kDa, 71,85kDa dan
64,36 kDa. Isolat BN dan AF memiliki
karakteristik sama ditunjukkan dengan pita
protein yang memiliki berat molekul sama
yakni 64,36 kDa. Selain itu, isolat AG dan
BD memiliki tingkat kemiripan karakteristik
yang tinggi ditunjukkan dengan banyaknya
pita protein yang sama dengan berat molekul
111,6 kDa, 94,6 kDa, 71,8 kDa dan 20,2
kDa. Sesuai Tabel 5.6 hasil karakterisasi
pita protein Isolat AA dan BM mampu
terdeteksi berturut-turut sebanyak 17 dan 7
pita protein. Hal tersebut sesuai dengan
karakteristik fenotip isolat BAL yang
mengkelompokan isolat BAL kedalam genus
yang sama. Hasil penelitian ini didukung
oleh Sanchez et al., 2003; Ghazi et al., 2009
yang menyebutkan adanya profil protein
yang terlihat pada karakterisasi profil protein
menggunakan SDS-PAGE akan mendukung
hasil karakterisasi fenotip isolat.
Bakteri asam laktat mempunyai profil
protein
yang
menunjukkan
protein
fungsional. Hasil analisa profil protein
terlihat adanya kesamaan beberapa profil
protein dari sebagian besar isolat BAL (AJ,
BO, BN, AG, BD, AA dan BM) dengan
berat molekul 111,6 kDa dan 99,96 kDa
yang diduga protein tersebut merupakan
protein fungsional yang dimiliki oleh
sebagian besar isolat BAL. Profil protein
yang menunjukkan berat molekul 111,6 kDa
9
dan 99,96 kDa diduga jenis protein bile salt
hidrolase (BSH) yang dimiliki oleh BAL.
Hasil tersebut didukung oleh penelitian yang
dilakukan Lundeen & Savage (1992) berhasil
mendeteksi berat molekul protein BSH dari
Lactobacillus.sp dengan kisaran berat
molekul 80,00 sampai 115,00 kDa. Bile salt
hidrolase adalah enzim untuk menghidrolisis
garam empedu yang mampu mengubah
kemampuan fisik dari kimia garam empedu
sehingga tidak bersifat racun bagi BAL dan
menyebabkan BAL mampu tahan terhadap
garam empedu. Hal ini mendukung hasil uji
potensi BAL sebagai probiotik yang
ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan
isolat BAL pada media yang telah
ditambahkan Oxgall 0,3 %. Pada isolat BAL
(AJ, BD, AG dan BO) mempunyai profil
protein dengan berat molekul berturut-turut
33,25 kDa dan 31,47 kDa yang diduga
merupakan berat molekul dari protein
bacteriocins.
Profil
protein
yang
menunjukkan berat molekul 33,25 kDa dan
31,47 kDa diduga jenis protein bacteriocins
yang dimiliki oleh BAL. Hasil tersebut
didukung oleh penelitian yang dilakukan
Drider et al., (2006) telah berhasil
mengindentifikasi protein bacteriocins yang
memiliki berat molekul berkisar > 30 kDa
pada BAL. Bacteriocins merupakan salah
satu senyawa antimikroba yang dihasilkan
oleh BAL. Dari hasil running elektroforesis
telah terdeteksi pita-pita protein lain yang
belum diketahui jenis proteinnya, hal ini
dikarenakan hasil ekstraksi yang digunakan
adalah crude protein sehingga diperlukan
penelitian lebih lanjut untuk purifikasi dan
identifikasi protein lain terutama yang
ditemukan pada beberapa isolat BAL.
fenotip mendekati genus Lactobacillus sp,
Pedicoccus sp, Aerococcus sp Enterococcus
sp. Bakteri asam laktat hasil isolasi feses
orangutan memiliki karakteristik profil
protein yang sama dan mempunyai pita
protein
yang
menunnjukkan
protein
fungsional BAL sebagai probiotik. Isolat
BAL hasil isolasi feses orangutan diketahui
mempunyai potensi tinggi sebagai probiotik
yang ditunjukkan dengan kemampuan
tumbuh yang cukup tinggi pada media yang
ditambahkan cairan asam lambung (pH 2,5)
dan cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %).
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada direktorat
jenderal DIKTI yang telah memberikan
pembiayaan
penelitian
ini
sehingga
penelitian ini mampu selesai sesuai dengan
yang diharapkan. Terima kasih kepada pihak
Taman Safari Indonesia II yang telah
membantu dalam penyediaan sampel feses
orangutan.
Terima
kasih
kepada
Laboratorium Sentral Ilmu Hayati dan
Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya
yang telah menjadi tempat penelitian. Terima
kasih kepada dosen pembimbing serta rekanrekan peneliti atas dukungan serta bantuan
dalam kerjasama yang baik untuk
penyelesaian penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Anonimus. 2012. Standar Nasional Indonesia
(SNI) ISO 6887-1: 2012. 2012.
Penyiapan Contoh Uji, Suspensi Awal,
Dan
Pengenceran
Awal
Untuk
Pengujian
Mikrobiologi.
Badan
Standarisasi Nasional Indonesia.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian maka
disimpulkan bahwa dari hasil isolasi BAL
asal feses orangutan didapatkan 14 isolat
BAL dengan rerata jumlah bakteri 5,09±1,74
107 cfu/ml yang ditumbuhkan secara aerobic
dan 5,86±2,15x107 cfu/ml yang ditumbuhkan
secara anaerobic. Bakteri asam laktat hasil
isolasi feses orangutan memiliki karakteristik
Azhari, Asmahan. 2011. Isolation and
Identification of LAB Isolated from
Traditional Drinking Yoghurt in
Khartoum State, Sudan. Current
Research in Bacteriology 4(1) :16-22.
Barrow, G.I. and R. Feltham. 1993. Cowan
and
Steel’s
Manual
for
10
the identification of medical bacteria. 3rd
ed. Cambridge University Press: Great
Britain.
Drider, D., G. Fimlan., Y. Hechard., L. M.
McMullen and H. Prevost. 2006. The
Continuing Story of Class IIa
Bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev
70: 564–582.
Beasley, Shea. 2004. Isolation, Identification
and Exploitation of LAB from Human
and Animal Microbiota. Academic
Dissertation in Microbiology, Faculty of
Agriculture and Forestry and Viikki
Graduate School in Biosciences
University of Helsinki.Finland.
Freitas, M., E. Tavan., C. Cayuela., L. Diop.,
C. Sapin and G. Trugnan. 2003. HostPathogens
Cross-Talk.
Indigenous
Bacteria and Probiotics Also Play The
Game. Biology of the Cell 95 : 503–506.
Candra,
Joddi.
2006.
Isolasi
dan
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari
Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos
Chanos). [Skripsi]. Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan. Institu Pertanian
Bogor.
Ghazi, F., D. E. Henni., Z. Benmechernene
and M. Kihal. 2009. Phenotypic and
Whole Cell Protein Analysis by SDSPAGE for Identification of Dominants
Lactic Acid Bacteria Isolated from
Algerian Raw Milk. World Journal of
Dairy & Food Sciences 4 (1) : 78-87.
Carol, A., V. Reene., and L.M.T. Dicks.
2011. Horizontal Gene Transfer
Amongst Probiotic Lactic Acid Bacteria
and Other Intestinal Microbiota: What
Are The Possibilities?. Arch Microbiol.
193:157-168.
Havenaar, R and J.H.J. Huis in’t Veld. 1992.
Selection of Strains for Probiotic Use.
Dalam: Fuller, R. (ed.). Probiotics : The
Scientific Basic. London.209-224.
Jacobsen, C.N., V.R. Nielsen., A.E.
Hayford.,
P.L.
Moller.,
K.F.
Michaelsen.,
A.P.
Erregard.,
B.
Sandstrom., M. Tvede and M. Jakobsen.
1999. Screening of Probiotic Activities
of Forty Seven Strains of Lactobacillus
spp. by In Vitro Techniques and
Evaluation of The Colonization Ability
of Five Selected Strains in Human. Appl.
Environ. Microbiol. 65 : 4949-4956.
Casiano-Colón A, and R.E. Marquis. 1998.
Role of The Arginine Deiminase System
In Protecting Oral Bacteria and An
Enzymatic Basis for Acid Tolerance.
Appl Environ Microbiol. 54(6):1318–
1324.
De Angelis, M., L. Mariotti., J. Rossi., M.
Servili., P. F. Fox.,G. Rollan and
M.Gobbetti. 2002. Arginine Catabolism
By Sourdough Lactic Acid Bacteria:
Purification And Characterization Of
The Arginine Deiminase Pathway
Enzymes
From
Lactobacillus
Sanfranciscensis CB1. Applied And
Environmental Microbiology 68(12):
6193-6201.
Kusumawati, N. 2002. Seleksi Bakteri Asam
Laktat Indigenus sebagai Galur
Probiotik
dengan
Kemampuan
Mempertahankan
Keseimbangan
Mikroflora Usus Feses dan Mereduksi
Kolesterol Serum Darah Tikus. [Tesis].
Program Studi Ilmu Pangan. Institut
Pertanian Bogor.
Dibner, J.J. and J.D. Richards. 2005.
Antibiotic
growth
promoters
in
agriculture: History and mode of action.
Poul. Sci. 84: 634–643.
Laudanno, O. M., L. Vasconcelos., J.
Catalana and J.A. Cesolari. 2006.
Anti-Inflammatory Effect of Bioflora
Probiotic Administered Orally or
11
Subcutaneously with Live or Dead
Bacteria. Dig Dis Sci 51: 2180–2183
Lactobacillus
Plantarum.[Skripsi].
Fakultas Peternakan. Institut Pertanian
Bogor.
Lengkey, H.A.W., R. L. Balia., I. Togoe., B.
A. Tasbac and M. Ludog. 2009.
Isolation and Identification of Lactic
Acid Bacteria from Raw Poultry Meat.
Biotechnology in Animal Husbandry 25
(5-6): 1071-1077.
Salminen, S and A. V. Wright. 1998. Lactic
Acid Bacteria: Microbiology and
Functional Aspecs 2 nded. Marcel
Dekker, Inc. New York.
Sanchez, I., S. Sesena and L. Palop. 2003.
Identification of lactic acid bacteria from
spontaneous fermentation of ‘Almagro’
eggplant by SDS-PAGE whole cell
protein fingerprinting. Int. J. Food
Microbiol. 2555: 181-189.
Lestari, R. 2004. Pengaruh umur, Pakan,
dan
Kesehatan
Terhadap
Kerontokan
Bulu
Orangutan
(Pongo pygmaeus) di Taman Safari
Cisarua Bogor. [Skripsi]. Fakultas
Kedokteran
Hewan.
Institut
Pertanian Bogor.
Savadogo, A., C. Ouattara., I. Bassol and S.
Traore. 2006. Review Bacteriocins
and lactic acid bacteria. African
Journal of Biotechnology 5 (9):
678-683
Lin W. H., C. F. Hwang, L. W. Chen and H.
Y. Tsen. 2006. Viable Counts,
Characteristic
Evaluation
for
Commercial Lactic Acid Bacteria
Products. J. Food Microbiol. 23: 74-81.
Schrezenmeir, J. M. and de Vrese . 2008.
Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics.
Adv Biochem Engin/Biotechnol (111):
1–66.
Lundeen, S.G and D. C. Savage. 1992.
Multiple Forms of Bile Salt Hydrolase
from Lactobacillus sp. Strain 100-100.
Journal of Bacreriology. 174(22): 72177220.
Smet, I.D., L. van Hoorde, M.V. Woestyne,
H. Christiaens and W. Verstraete. 1995.
Significance of Bile Salt Hydrolytic
Activities of Lactobacilli. J. Appl.
Bacteriol. 79 : 292-301.
Minarwanto, Hendra. 2008. Studi Aktivitas
Harian Orangutan (Pongo pygmaeus
wurmbii, Grove, 2001) Di Orangutan
Care Center And Quarantine Pangkalan
Bun, Kalimantan Tengah. [skripsi].
Fakultas Kehutanan. Institu Pertanian
Bogor.
Tilley, L and P. Smith.1980.The 5-minute
veterinary Consult.
Wijayanto, Umar. 2009. Analisis In Vitro
Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat
Asal Daging Sapi Terhadap pH
Lambung, pH Usus dan Garam Empedu
sebagai Kandidat Probiotik. [Skripsi].
Fakultas Peternakan. Institut Pertanian
Bogor.
Ngatirah, A., E. S. Harmayanti dan T. Utami.
2000. Seleksi Bakteri Asam Laktat
Sebagai Agensia Probiotik yang
Berpotensi Menurunkan Kolesterol.
Prosiding Seminar Nasional Industri
Pangan. PATPI (II) : 63-70.
Zavaglia, A. G., G. Kociubinski, P. Perez
and G. De Antoni. 1998. Isolation and
Characterization of Bifidobacterium
Strains for Probiotic Formulation. J.
Food Protect. 61(7) : 865-873.
Pertiwi, Widimartani. A. 2008.
Profil
Mikroflora Feses Dan Usus Tikus Putih
(Rattus Norvegicus) Dengan Konsumsi
Daging Yang Difermentasi Oleh
12
13