bioteknologi crispr/cas9: caraterbaruuntuk - Biotrends

BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
BIOTEKNOLOGI CRISPR/CAS9: CARATERBARUUNTUK
“MEMUKUL JATUH GEN"
SUPATMI
Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI
Jl Raya Bogor Km 46 Cibinong 16911
Telp.0218754587; Fax. 0218754588
Email:[email protected]
P
ada satu abad terakhir,
kemajuan teknologi di
bidang bioteknologi dan
biologi molekuler mengalami
peningkatan yang luar biasa.
Kemajuan tersebut dimulai sejak
ditemukannya teknologi PCR
(polymerase chain reaction) untuk
amplifikasi gen hingga teknologi
transgenesisyang mengantarkan
berbagai keberhasilan penelitian
di bidang biomedik dan pertanian.
Namun demikian, transgenesis
memiliki keterbatasan. Teknologi
transgenesisadalah teknologi
rekayasa genetika dengan
menyisipkan/mengintroduksi gen
asing untuk menciptakan sifatsifat baru yang memiliki nilai
agronomis/biomedis tinggi
(Hefferon, 2012) atau
memodifikasi sifat-sifat yang tidak
diinginkan. Penyisipan gen asing
tersebut menimbulkan
kekhawatiran publik atas produkproduk hasil rekayasa genetika
khususnya apabila gen yang
diintroduksi memiliki hubungan
kekerabatan yangjauh seperti
misalnya kita menyisipkan gen
tertentu hewan pada tanaman
atau manusia. Hal ini tentu saja
menghambat transgenesis untuk
digunakan secara luas. Selain itu
untuk melepaskan produk
transgenesis diperlukan beberapa
regulasi terkait tentang produkproduk rekayasa genetika
(transgenik) seperti uji keamanan
pangan dan hayati serta
lingkungan dalam rangka untuk
mengatasi keselamatan publik dan
ini menambah beban biaya
produksi yang besar (Todaka et
al., 2015). Untuk itu para ahli
berusaha mencari inovasi baru
untuk mengatasi keterbatasanketerbatasan teknologi
transgenesis tersebut. Berbagai
penelitian dilakukan untuk
mendapatkan metode manipulasi
fungsi gen yang lebih effisien,
aplikatif dan tepat sasaran.
Beberapa usaha tersebut
diantaranya adalah homologous
recombination dan RNA
interference (RNAi). RNAi menjadi
Gambar 1. Ilustrasi kartun genome editing , http://www.ecologise.in/2016/03/13/crispr-is-coming-withbig-implications-for-food-farmers-consumers-and-nature/
31
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
metode yang memungkinkan
untuk mengetahuifungsi dari gen
yang akurat dan murah, namun
demikian, beberapa penelitian
menunjukkan bahwa
penghambatan fungsi gen ini
bersifat sementara dan
dimungkinkan menyebabkan
penghambatan fungsi gen lain
yang bukan merupakan gen target
(off-target effects) (Baulcombe,
2004).
Genome editing adalah metode
perakitan genetik dimana sebuah
sekuens DNA bisa disisipkan,
diganti dihapus, dan atau
dipindahkan dari genom suatu
organisme ke organisme
laindengan bantuan suatu enzim
nuklease yang berfungsi seperti
gunting molekuler (Schinkel &
Schillberg, 2016). Tujuan dari
metode ini tak lain adalah
mengedit susunan basa DNA pada
genom sehingga ketika
Saat ini, telah muncul teknologi
diterjemahkan dalam bahasa
genome editing yang
asam amino bisa merubah sifat
pendekatannya disinyalir lebih
dari organisme tersebut.
baik dari teknologi manipulasi gen Teknologi genome editing
secara transgenesis klasikseperti
tergolong baru karena baru resmi
mengintroduksi sifat baru pada
dipublikasikan pada tahun 2005.
tanaman atau hewan dengan
Beberapa modul teknik genome
rekombinasi genetik alami dengan editing yang telah digunakan
cara mengawinkan dengan induk diantaranya Zinc Finger Nucleases
yang lebih baik atau unggul.
(ZFNs) dan Transcription
Activator-Like
Like Effector Nucleases
(TALENs) (Ledford, 2016). Teknik
ini berbeda dengan teknik
transgenesis klasik sebab tidak
melibatkan pengambilan gen dari
spesies lain melainkan
mempercepat terjadinya pros
proses
mutasi genetik yang secara alami
terjadi saat proses perkawinan
/pemuliaan (Sprink et al., 2015).
Teknologi ini memungkinkan para
peneliti untuk menciptakan
mutasi secara permanen, namun
demikian, teknik ini sangat mahal
dan membutuhkan waktu yang
lamaa serta terbatas untuk
digunakan dalam skala luas
(Lusser et al., 2012). Untuk itu,
para peneliti berusaha untuk
menciptakan modul terbaru
genome editing yang lebih murah
dan memiliki presisi tinggi. Belum
lama ini, teknologi tersebut sudah
Gambar 2. Prinsip kerja dari CRISPR-Cas9
CRISPR Cas9 untuk pengeditan gen. 1) sgRNA yang terdiri dari sekuen
crRNA yang spesifik menyasar DNA target dan tracrRNA yang berinteraksi dengan Cas9
protein. 2) Terbentuk ikatan komplek antara sgRNA dengan pro
protein Cas9 yang
mengandung aktivitas DNA endonuclease. 3) Ikatan komplek tersebut akan menyebabkan
dsDNA target terputus. 4) Situs yang terputus tersebut akan diperbaiki oleh lewat jalur
perbaikan DNA non--homologous
homologous end joining (NHEJ), proses ini bisa menye
menyebabkan insersi
atau penghapusan dari nukleotida yang menyebabkan rusaknya fungsi gen. Diambil dari
http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=100247
http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=100247.
32
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
ditemukan dan diberi namaCluster
Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats-associated
protein-9 nuclease (CRISPR-Cas 9).
Modul teknologi genome editing
ini disebut-disebut sebagai era
penemuan baru dan terbesar
dalam dunia biologi molekuler
(Gambar 1). Lalu, sebenarnya apa
pemberi jarak DNA(DNAspacer)
dan pengulangan frasa sekuen
yang sama (palindromic
sequence).Karena proses
pengulangan singkat sekuen basa
DNA tersebut maka disebut
dengan istilah CRISPR.
Ternyata,pola yang sama hampir
dimiliki di 40% bakteria dan 90%
serangan beberapa virus
Bakteriofage yang berdampak
pada kerusakan dari produk
makanan yang dihasilkan sehingga
menurunkan baik kuantitas dan
kualitas produk makanan yang
dihasilkan. Karena itulah para ahli
berusaha mengatasi hal tersebut.
Mereka akhirnya menemukan
Gambar 3. Organisme hasil genome editing dengan menggunakan teknik CRISPR.Kanan: Embrio zebrafish
yang memiliki kelebihan jaringan ventral berlebih; kiri: lalat buah yang memiliki mata berwarna
hitam dengan mengedit gen yang bertanggung jawab terhadap pigmen warna mata pada lalat
buah. Diambil dari Pennisi (2013).
itu CRISPR-Cas9, bagaimana cara
kerjanya dan mengapa teknik ini
menjadi buah bibir? Jawabannya
dimulai dari penelitian pada tahun
2007 mengenai kekebalan
imunitas yang terjadi pada
bakteri.
di mikroba dengan lokasi yang
berbeda.Pada mulanya para ahli
menduga bahwa sekuen yang
aneh itu hanyalah sampah, tetapi
pada tahun 2005,tiga grupahli
bioinformatika melaporkan
adanya kesesuaian DNAbakteri
dengan DNA pada sekuens virus
Fage yang mengindikasikan
adanya kemungkinan cara kerja
CRISPR dalam mekanisme
imunitas mikroba (Pennisi, 2013).
Dan ini menjadi petunjuk yang
menarik dalam perkembangan
CRISPR selanjutnya.
cara bagaimana mendorong agar
bakteri ini melawan serangan dari
virus Fage tersebut. Mirip dengan
prinsip vaksinasi, jadi bakteri
tersebut diekspose dengan virus
tersebut agar melawan serangan
virus. Menariknya bakteri tersebut
mampu menciptakan kekebalan
Asal Penemuan CRISPR
imun sistem yang
memungkinkannya untuk resisten
Sebenarnya ide pertama dari
pada serangan virus yang kedua
teknik CRISPR ini bermula pada
dan seterusnya. Sistem
tahun 1987, ketika sebuah tim
pertahanan yang ditunjukkan oleh
peneliti mengamati fenomena
bakteri S. thermophilus tersebut
proses pengulangan sekuens yang
menjadi sangat penting tidak
aneh pada salah satu ujung dari
hanya bagi para ahli makanan dan
gen bakteri. Satu dekade
Pada tahun 2007, para peneliti
mikrobiologi tapi para ahli biologi
kemudian para ahli mikroba
dari Danisco, yang bergerak dalam molekuler lainnya untuk meneliti
menemukan pola yang sama di
industri komposisi makanan yang lebih lanjut. Akhirnya, Danisco dan
genom mikroba dimana sekuen
dimiliki oleh DuPont, melakukan
timberhasil merubah S.
dari DNA ternyata diikuti oleh
penelitian mengenai bakteri
thermophilus yang resisten
sekuen yang polanya hampir mirip Streptococcus thermophilusyang
terhadap serangan Fage dengan
seperti pelengkapdari sekuen
sangat penting dalam industri
menambah atau menghapus
sebelumnya. Pola sekuen tersebut pembuatan yoghurt dan keju.
spacer DNA yang bersesuaian
adalah 30 basa nukleotida yang
Bakteri ini ternyata menjadi
dengan Fage. Pada saat itu para
acak yang disebut sebagai
bersifat lemah karena adanya
ahli tersebut masih belum
33
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
memikirkan bahwa teknologi
tersebut adalah cara kerja CRISPR
dan potensi CRISPR sebagai
teknologi genom editingdalam
skala yang lebih besar.
Kemudian ahli dari Jerman,
Doudna dan Emmanuelle
Charpentier (2007)meneliti lebih
jauh dari sistem CRISPR ini dengan
mengaitkannya dengan proteinprotein lain untuk mengetahui
bagaimanaS. thermophilus ini
menggunakan DNA spacers dalam
sistem pertahanan imun mereka.
Kedua ahli ini fokus menggunakan
sistem CRISPR ini dengan protein
yang disebut Cas9 untuk
menyederhanakan sistem CRISPR
dibandingkan dengan yang lain
(Pennisi, 2013). Lalu bagaimana,
cara kerja dari CRISPR-Cas9 ini
hingga mampu mengedit DNA dari
genom organisme?.
Cara kerja CRISPR/Cas9
Ada dua komponen utama dalam
sistem CRISPR-Cas9 yaitu protein
Cas dan single guide RNA (sgRNA).
Dalam sistem CRISPR-Cas tipe II,
Cas 9 ini merupakan protein
penting yang menjadi karakteristik
utama dan sistem ini yang paling
banyak digunakan dalam
penelitian. Hal ini karena CRISPRCas tipe II ini memiliki komponen
yang lebih sederhana yaitu 3
komponen (Cas9, crRNA dan
trRNA) yang lebih mudah
diadaptasi dibandingkan CRISPRCas tipe I, III dan IV. Cas 9
berfungsi sebagai enzim yang
memotong DNA target di sekuen
yang posisinya dekat dengan situs
protospacer adjacent motif (PAM).
Sekuen di situs PAM ini biasanya
ditandai dengan 3 basa nukleotida
(NGG, dengan N adalah basa
nukleotida yang bisa berupa A:
Adenin; T: Timin; C: Cytocine; G:
Guanin). Protein cas9 ini memiliki
Streptococcus
thermophilusyang sangat
penting dalam industri
pembuatan yoghurt dan keju.
Bakteri ini ternyata menjadi
bersifat lemah karena adanya
serangan beberapa virus
Bakteriofage yang berdampak
pada kerusakan dari produk
makanan yang dihasilkan
sehingga menurunkan baik
kuantitas dan kualitas produk
makanan yang dihasilkan.
bakteri ini melawan serangan
dari virus Fage tersebut
2 situs homolog yaitu RuvC dan
HNH, yang masing-masing
memotong satu dari untai ganda
DNA, yang menghasilkan
potongan tumpul (blunt cut) pada
sekuen DNA target. Selanjutnya,
sgRNA yang merupakan RNA
buatan gabungan dari dua noncoding RNA yaitu crRNA yang
berfungsi sebagai guide yang bisa
menyesuaikan dengan sekuen dari
DNA target dan tracrRNAyang
berfungsi sebagai scaffold. Sekuen
sgRNA ini digunakan untuk mentarget lokus genom
tanaman/hewan yang secara
34ector34us panjangnya 19-22bp,
dengan penambahan 3 bp sekuen
PAM (NGG). Cas9 dan sgRNA
dapat dikonstruk dalam satu
vektor atau bisa menggunakan
dua vektor yang terpisah dengan
34
mengkombinasikan dengan jenis
promotor dan sekuen dari enzim
restriksi lainnya tergantung dari
karakter genom yang ditargetkan.
Metode pengeditan dari CRISPR
ini, sama dengan dua teknologi
sebelumnya yaitu adanya
mekanisme reparasi akibat
terpotongnya sekuen DNA target.
Mekanisme reparasi tersebut bisa
terjadi secara alami yang
bergabung dengan Nonhomologous end joining (NHEJ)
maupun dengan menggunakan
cetakan eksternal yang diinginkan
seperti homology directed repair
(HDR). Dari mekanisme perbaikan
ini maka akan terjadi insersi basa
atau penghapusan nukleotida
baru yang menyebabkan
terjadinya disfungsi gen (Gambar
2).(Sprink et al., 2015).
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
Aplikasi CRISPR-Cas 9
jaringan daun. Sebagai contoh
pada tahun 2014, Shan dan
Sejak awal kemunculannya,
koleganya menemukan metode
teknologi CRISPR ini telah
untuk menciptakan mutasi pada
membawa angina segar dalam
padi dan gandum dengan
dunia genome editing. Aplikasinya menggunakan teknik CRISPR ini
yang sederhana dan relatif murah dengan menggunakan
telah banyak diterapkan di sel
transformasi dari protoplas
eukariotik, tikus, nematode dan
dengan masa regenerasi mutan
tanaman. Sebagai contoh nyata
yang relatif cepat selama 13-17
Pennisi (2013) melaporkan bahwa minggu. Menariknya, pada bulan
8 bulan sejak kemunculannya di
April 2015, para peneliti
tahun 2007, teknologi CRISPR ini
melaporkan bahwa mereka
mampu menciptakan varietas
berhasil mengedit embrio
baru dari lalat buah yang memiliki manusia dengan menggunakan
mata berwarna hitam dengan
teknik CRISPR ini. Meskipun hal ini
mengedit gen yang bertanggung
memunculkan perdebatan di
jawab terhadap pigmen warna
kalangan masyarakat dunia
mata pada lalat buah (Gambar 3). mengenai etis atau tidak etisnya
Dalam dunia industri dan
teknologi CRISPR ini digunakan
therapeutik, penggunaan CRISPR
untuk penelitian pada manusia
sangat gencar dilakukan, terbukti (Jiang et al., 2013; Ledford et al.,
dengan dana penelitian yang
2015). Dari beberapa contoh
dikeluarkan mencapai hamper 89 aplikasi dan trend dari
juta dollar pada tahun
penggunaan teknologi CRISPR
2013.Menariknya, publikasiyang cenderung meningkat dalam
publikasi ilmiah yang membahas
dunia penelitian baik biomedis
tentang aplikasi teknik CRISPR ini dan pertanian merupakan bukti
dalam dunia medis meningkat
nyata bahwa teknik ini merupakan
tajamsepertipenggunaan CRISPR- gebrakan baru dalam dunia
Cas 9 untuk terapi gen secara in
genome editing dan biologi
vivo(Ledford, 2015). Menariknya, molekuler yang tentu saja
publikasi-publikasi tersebut
menimbulkan status pro dan
tercatat sebagai terbesar kedua
kontra mengenai status produk
setelah teknologi induced
yang dihasilkannya di masa depan.
pluripotent stem sel (iPS) dan
diikuti oleh Zinc fingers dan Talens Status dan Masa Depan CRISPR(Ledford, 2015).
Cas 9
Penerapan teknologi CRISPR ini
juga menjadi buah bibir dalam
dunia pertanian. Setidaknya pada
tahun 2013, ada delapan publikasi
ilmiah yang menerapkan teknik ini
pada genom tanaman yaitu di
Arabidopsis, tembakau, padi,
gandum dan sorgum (Belhaj et al.,
2013). Teknik CRISPR ini diuji
dengan assay ekspresi sementara
dengan menggunakan
transformasi dari protoplas
tanaman serta agroinfiltrasi di
Mudah dan efisiennya
penggunaan teknologi CRISPR ini
bukan berarti tanpa hambatan.
Sejak kemunculannya, banyak
para peneliti yang
memperdebatkan tentang siapa
yang berhak mendapatkan paten
dari teknologi ini karena
banyaknya pengajuan klaim atas
teknologi ini.Selain itu para
peneliti internasional juga mulai
memperdebatkan mengenai
apakah produk yang dihasilkan
35
dengan teknologi CRISPR ini masih
tergolong sebagai GMO. Mereka
menilai bahwa teknologi genome
editing bukan termasuk dalam
kategori produk GMO, karena
tidak adanya DNA asing yang
dimasukkan dan tidak melibatkan
penggunaan bakteri
Agrobacterium yang bersifat
pathogen dalam perakitannya
(Puchta & Fauser , 2013; Araki &
Ishii, 2015). Dengan kata lain
teknik ini meniru proses alami dari
sel dan tidak menyebabkan
transformasi gen secara
keseluruhan yang merupakan isu
sensitif dari produk GMO. Karena
itulah, para peneliti-peneliti
internasional berdebat mengenai
terminologi GMO yang dirasa
regulasinya tidak lagi valid untuk
produk-produk hasil dari teknik
genome editing karena organisme
yang dihasilkan lebih disebut
sebagai Genetically edited
organism (GEO) (Qaim&
Zilberman, 2003). Menariknya,
baru baru ini US Department of
Agriculture (USDA) meloloskan
jamur hasil dari teknologi CRISPR
ini dari regulasi sebagai produk
GMO yang merupakan lampu
hijau dari produk hasil genome
editing(Waltz, 2016). Meskipun
begitu, kekhawatirankekhawatiran mengenai
modifikasi genom hasil dari teknik
genome editing ini, yang
dimungkinkan tidak bisa
dibedakan dengan mutasi alami
yang terjadi di alam dan hasil
pemuliaan konvensional seperti
pada tanaman atau mutagenesis
kimia atau fisik yang terjadi. Hal
ini menimbulkan kekhawatiran
adanya pencemaran plasma
nutfah dari alam dan
kekhawatiran akan kestabilan dari
gen yang diturunkan ke generasi
selanjutnya. Karena itulah regulasi
mengenai GEO ini menjadi topik
yang panas di kalangan pakar
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
peneliti internasional sampai saat
ini. Evaluasi mengenai produkproduk baru dan akhir yang
dihasilkan dari teknik genome
editing ini mungkin perlu menjadi
perhatian yang serius kedepannya
oleh para ahli, agar masyarakat
ter-edukasi dan mampu
menentukan pilihan dan sikap
yang benar terhadap produkproduk dari GMO/GEO ini. Namun
demikian, terlepas dari adanya
kontroversi terkait regulasi GMO
maupun GEO, teknologi CRISPRCas9 ini memberikan angin segar
bagi para peneliti, industri dan
masyarakat pada umumnya.
Karena pada akhirnya, inovasi dan
perkembangan bioteknologi
hewan dan tanaman yang dulu
sukar diprediksi akan tercerahkan
kedepannya, terutama dengan
maraknya isu-isu mengenai
pemanasan global dan climate
change yang sekarang banyak
diperbincangkan.
safety and regulation in the
Jiang, W, Bikard, D, Cox, D, Zhang,
EU. The Plant Journal 78, 742F, & Marraffini, LA. (2013):
752.
RNA-guided editing of
bacterial genomes using
Hefferon KL. (2012): Plant virus
CRISPR-Cas systems. Nature
expression vectors set the
biotechnology, 31(3), 233stage as production
239.
platforms for
biopharmaceutical proteins. Shan Q, Wang Y, Li J, Gao C.
Virology, 433(1), 1-6.
(2014): Genome editing in
rice and wheat using the
http://www.clontech.com/xxclt_i
CRISPR/Cas system. Nat
bcGetAttachment.jsp?cItemI
Protocols 9, 2395-2410.
d=100247.Mei 2013.
Sprink T, Metje J, Hartung F.
http://www.ecologise.in/2016/03
(2015): Plant genome editing
/13/crispr-is-coming-withby novel tools: TALEN and
big-implications-for-foodother sequence specific
farmers-consumers-andnucleases. Current Opinion in
nature/. 13 Maret 2016
Biotechnology 32, 47-53.
Ledford, H. (2015): CRISPR, the
Todaka D, Shinozaki K, &
disruptor. Nature, 522(7554),
Yamaguchi-Shinozaki K.
20-24.
(2015): Recent advances in
the dissection of droughtLedford, H. (2016): Riding the
stress regulatory networks
CRISPR Wave. Nature,
and strategies for
Daftar Pustaka
531(7593), 156-159.
development of droughttolerant transgenic rice
Araki M & Ishii T. (2015): Towards Lusser M, Parisi C, Plan D,
plants. Frontiers in plant
social acceptance of plant
Rodriguez-Cerezo E. (2012):
science, 6, 84.
breeding by genome editing.
Deployment of new
Trends in plant science, 20(3),
biotechnologies in plant
Schinkel H & Schillberg S. (2016):
145-149.
breeding. Nat Biotech 30,
Genome editing: intellectual
231-239.
property and product
Baulcombe D. (2004) : RNA
development in plant
silencing in plants.
Pennisi, E. (2013): The CRISPR
biotechnology. Plant cell
Nature431, 356-363.
craze. Science, 341(6148),
reports, 1-5.
833-836.
Belhaj K, Chaparro-Garcia A,
Waltz E. (2016): Gene-edited
Kamoun S, Nekrasov V.
Puchta H, Fauser F. (2013): Gene
CRISPR mushroom escapes
(2013): Plant genome editing
targeting in plants: 25 years
US regulation. Nature News,
made easy: targeted
later. The International
532, 293.
mutagenesis in model and
Journal of Developmental
crop plants using the
Biology 57, 629-637.
CRISPR/Cas system. Plant
Qaim, M, & Zilberman, D. (2003):
Methods 9, 39.
Yield effects of genetically
modified crops in developing
Hartung F, Schiemann J. (2014):
countries. Science, 299(5608),
Precise plant breeding using
900-902.
new genome editing
techniques: opportunities,
36