Peran dualisme dari mekanisme non

1
Peran dualisme dari mekanisme non-homologous end joining pathway
(NHEJ): penjaga keamanan DNA sekaligus pendorong mutasi pada
genome editing
Diantara banyak kerusakan DNA, kerusakan dua untai DNA atau yang disebut double-strand
breaks (DSBs) merupakan bentuk yang paling berbahaya. Untuk memperbaiki kerusakan
akibat kejadian DSBs, sel sendiri diketahui memiliki dua mekanisme yaitu homologous
recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ) dimana mekanisme NHEJ
merupakan yang paling dominan di dalam sel eukariotik. NHEJ memiliki peran dualisme
dalam menjaga keutuhan genom dari kerusakan permanen sekaligus merupakan mekanisme
pendorong mutagenesis dalam genome editing.
Gambar 1. Ilustrasi dua mekanisme reparasi DNA melalui non-homologous end joining
(NHEJ) dan homologous recombination (HR). Sumber:
https://www.thebestgene.com/CRISPRInfoPage.do
DNA sebagai materi yang membawa informasi genetik pada makhluk hidup tidak terkecuali
manusia memiliki ancaman kerusakan akibat paparan cekaman internal maupun eksternal
seperti sinar gamma, x-ray, ultraviolet, senyawa kimia berbahaya dan sebagainya. Diantara
banyak kerusakan DNA, kerusakan dua untai DNA atau yang disebut double-strand breaks
(DSBs) merupakan bentuk yang paling berbahaya. DSBs sendiri dapat terjadi selama proses
metabolisme normal dari sel atau diinduksi dari faktor eksternal seperti telah disebutkan
sebelumnya. Sesuai dengan namanya, DSBs dapat menyebabkan kerusakan permanen dari
DNA yang tentu dapat mengancam integritas genom dan pertahanan sel [1].
Untuk memperbaiki kerusakan akibat kejadian DSBs, sel sendiri diketahui memiliki dua
mekanisme yaitu homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ)
(Gambar 1). NHEJ merupakan mekanisme reparasi tanpa menggunakan template DNA seperti
pada HR. Mekanisme NHEJ dikatakan sebagai mekanisme “coba-coba” oleh sel dan
diprediksi dekat dengan mutasi tak terkendali dari DNA [2]. Meskipun demikian, kedua
mekanisme tersebut berfungsi mempertahankan integritas dan keutuhan genom di dalam sel
[1].
www.iribb.org | Januari 2017 | 5(1), 1-4
Riza Arief Putranto - Peneliti PPBBI
2
Gambar 2. Ilustrasi mekanisme c-NHEJ dan
b-NHEJ [5].
Diantara keduanya, mekanisme NHEJ
merupakan yang paling dominan dibanding
HR pada organisme eukariot dimana
reparasi yang dihasilkan mampu mengarah
pada terjadinya mutasi seperti delesi, insersi
dan subtitusi basa nukleotida pada daerah
DNA yang rusak [3, 4]. Hingga saat ini, dua
mekanisme NHEJ telah diidentifikasi yaitu
mekanisme klasik atau classical-NHEJ (cNHEJ) dan mekanisme backup-NHEJ (bNHEJ) atau yang sering disebut sebagai
mekanisme alternatif (a-NHEJ) atau
microhomology-mediated
end-joining
(MMEJ) [1, 5].
Secara singkat, perbedaan dari dua
mekanisme reparasi DNA melalui NHEJ
tersebut dapat dijelaskan sebagai berikut.
Mekanisme c-NHEJ telah digambarkan
sejak 2001 dimana c-NHEJ diinisiasi
dengan pengenalan dan penempelan protein
heterodimer KU yang terdiri dari subunit
KU70 dan KU80 pada daerah DSBs [6]. Setelah menempel pada utas DSB, protein KU
bertindak sebagai scaffold untuk merekrut faktor ligasi dan melekatkan bagian ujung patahan
(end-joining). Dikarenakan protein KU merupakan komponen kunci dari c-NHEJ, mekanisme
ini juga disebut sebagai KU-dependent NHEJ. Ketika protein KU absen di dalam sel, faktor
lain seperti protein poly ADP-ribose polymerase 1 (PARP1) masuk menggantikan peran KU.
Itulah sebabnya mekanisme ini disebut sebagai alternative-NHEJ karena tidak bergantung
pada protein KU. Meskipun demikian, mekanisme alternatif tersebut belum secara rinci dan
jelas diketahui [7].
Dengan menggunakan teknologi terkini, mekanisme DSBs dapat diinduksi secara artifisial
pada daerah spesifik di dalam genom. Induksi tersebut dilakukan dengan menggunakan
nuklease spesifik yang telah didesain dan dikenal seperti meganucleases, zinc-finger nucleases
(ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and sistem clustered
regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) [8, 9].
Nuklease-nuklease tersebut merupakan tool pada teknik genome editing yang saat ini sedang
naik daun dimana diantara keempatnya CRISPR/Cas9 merupakan teknik yang diklaim paling
mudah dan efektif [10].
Nuklease spesifik buatan tersebut menginduksi DSBs dengan cara memotong untai ganda
DNA pada sekuen target yang telah ditentukan sehingga sel akan memperbaiki potongan
tersebut dengan menggunakan mekanisme NHEJ. Tujuan dari nuklease ini adalah
menginduksi terjadinya mutasi berupa insersi, delesi atau subtitusi pada daerah target yang
umumnya adalah gen penyandi protein. Sistem nuklease-NHEJ tersebut akan mengakibatkan
tidak terekspresinya gen target atau dinamakan knock-out (KO) [10]. Jika sistem tersebut
www.iribb.org | Januari 2017 | 5(1), 1-4
Riza Arief Putranto - Peneliti PPBBI
3
menghasilkan mutasi yang “tepat” pada gen yang berperan dalam kerentanan terhadap
penyakit, maka mutan yang dihasilkan dapat menjadi galur baru yang lebih tahan penyakit.
Meskipun demikian, penerapan dari sistem nuklease-NHEJ tidak hanya pada gen KO namun
juga pada penambahan atau pemotongan sekuen dalam genom untuk menginduksi ekspresi
dari gen tersebut. Pada tingkat kromosom, sistem nuklease-NHEJ dapat digunakan untuk
restrukturisasi kromosom yang dapat memperbaiki sifat yang diinginkan [2]. Penelitian akan
sistem nuklease-NHEJ yang merupakan salah satu alur genome editing masih dipelajari hingga
hari ini.
Para peneliti terus memperbaiki teknologi nuklease yang digunakan untuk memicu mekanisme
NHEJ. Hal tersebut dilakukan karena mekanisme NHEJ dianggap rentan terhadap kesalahan
reparasi yang nantinya dapat menghasilkan mutan yang tidak diinginkan (undesirable
phenotype) [1]. Berbagai modifikasi pada teknik genome editing seperti penggunaan doublenickase, multiple single-guide RNA (sgRNA) hingga desain nuklease buatan baru telah
dilakukan [11-13]. Meningkatkan persentase kejadian mutasi pada mekanisme reparasi DNA
melalui NHEJ dan/atau HR merupakan tahapan yang tidak kalah penting selain studi
keakuratan dari teknologi nuklease seperti CRISPR/Cas9.
Pada akhirnya, mengendalikan mutasi pada organisme uji merupakan tugas berat dari para
peneliti. Hal tersebut dikarenakan tanpa kendali pada proses mutasi, organisme akhir yang
diperoleh di masa yang akan datang dapat mengalami perubahan kompleksitas genom,
perubahan ekspresi gen, bahkan perubahan sifat yang berpotensi dikategorikan sebagai
organisme berbahaya. Meskipun demikian, terlepas dari segala resiko yang ada dan dengan
kemajuan yang diperoleh pada saat ini berkat teknologi genome editing, bioteknologi tengah
memasuki era baru. Era tersebut adalah “non-transgenic but edited organisms”.
Referensi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Shen H, Strunks GD, Klemann BJPM, Hooykaas PJJ, de Pater S. CRISPR/Cas9-Induced
Double-Strand Break Repair in Arabidopsis Nonhomologous End-Joining Mutants. G3:
Genes|Genomes|Genetics. 2017;7(1):193-202.
Puchta H. Applying CRISPR/Cas for genome engineering in plants: the best is yet to
come. Current Opinion in Plant Biology. 2017;36:1-8.
Davis AJ, Chen DJ. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.
Translational cancer research. 2013;2(3):130-43.
Lieber MR. The Mechanism of Double-Strand DNA Break Repair by the Nonhomologous
DNA End Joining Pathway. Annual review of biochemistry. 2010;79:181-211.
Hustedt N, Durocher D. The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol.
2017;19(1):1-9.
Walker JR, Corpina RA, Goldberg J. Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and
its implications for double-strand break repair. Nature. 2001;412(6847):607-14.
Wang M, Wu W, Wu W, Rosidi B, Zhang L, Wang H, et al. PARP-1 and Ku compete for
repair of DNA double strand breaks by distinct NHEJ pathways. Nucleic Acids Research.
2006;34(21):6170-82.
Lee J-E, Ezura H. Genome-Editing Technologies and Their Use in Tomato. In: Ezura H,
Ariizumi T, Garcia-Mas J, Rose J, editors. Functional Genomics and Biotechnology in
www.iribb.org | Januari 2017 | 5(1), 1-4
Riza Arief Putranto - Peneliti PPBBI
4
9.
10.
11.
12.
13.
Solanaceae and Cucurbitaceae Crops. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg;
2016. p. 239-50.
Weeks DP, Spalding MH, Yang B. Use of designer nucleases for targeted gene and
genome editing in plants. Plant Biotechnology Journal. 2016;14(2):483-95..
Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using
the CRISPR-Cas9 system. Nat Protocols. 2013;8(11):2281-308.
Schiml S, Puchta H. Revolutionizing plant biology: multiple ways of genome engineering
by CRISPR/Cas. Plant Methods. 2016;12(1):1-9.
Lee J, Chung J-H, Kim HM, Kim D-W, Kim H. Designed nucleases for targeted genome
editing. Plant Biotechnology Journal. 2015:n/a-n/a.
Ran FA, Hsu PD, Lin C-Y, Gootenberg JS, Konermann S, Trevino A, et al. Double
nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell.
2013;154(6):1380-9.
www.iribb.org | Januari 2017 | 5(1), 1-4
Riza Arief Putranto - Peneliti PPBBI