1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Tingginya

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Tingginya tingkat polusi dan perubahan cuaca yang tidak menentu akhir-akhir
ini dapat menyebabkan daya tahan tubuh menurun. Daya tahan tubuh
berhubungan dengan kemampuan tubuh untuk menghindari penyakit, terutama
penyakit infeksi. Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya alam.
Dewasa ini, penggunaan bahan alami yang berasal dari tumbuhan cenderung
semakin diminati dengan konsep back to nature (Block & Mead, 2004).
Imunostimulan adalah bahan yang dapat meningkatkan kerja komponenkomponen sistem imun (Baratawidjaja & Rengganis, 2010). Bahan tersebut
mampu memodulasi sistem imunitas manusia dengan berperan memperbaiki
ketidakseimbangan sistem imun (Ediati, 2012). Sistem imun terdiri atas imunitas
nonspesifik dan spesifik. Kedua sistem imun bekerja sama dalam pertahanan
keseimbangan badan. Penyembuhan infeksi akan lebih cepat bila fungsi sistem
imun tubuh ditingkatkan. Berbagai bahan asal tanaman dapat memacu fungsi
berbagai komponen sistem imun nonspesifik (makrofag, sel NK) dan sistem imun
spesifik (proliferasi sel T, sel B yang memproduksi antibodi) serta produksi
sitokin sehingga dapat digunakan dalam klinik sebagai adjuvan (meningkatkan
sistem imun namun bersifat non imunogenik) untuk penyembuhan berbagai
penyakit infeksi (Baratawidjaja & Rengganis, 2010; Anderson, 1999).
Kombinasi obat merupakan salah satu cara pengobatan yang efektif (Hafid et
al., 2011). Kombinasi efek kandungan aktif dalam campuran bahan dapat melalui
1
2
efek sinergisme dan komplementer. Efek sinergisme yaitu saling mendukung
menuju satu indikasi dengan mekanisme yang sama, sedangkan efek
komplementer yaitu saling mendukung menuju satu indikasi dengan mekanisme
berbeda.
Makrofag sebagai sel fagosit dapat membunuh kuman dengan berbagai cara
seperti peningkatan aktivitas enzim lisosomal, produksi sitokin, pelepasan nitric
oxide,
interleukin,
Tumor
Necrosis
Factor-α
(TNF-α)
sehingga
dapat
meningkatkan aktivitas dari makrofag (Ediati, 2012).
Senyawa yang mempunyai bioaktifitas sebagai agen imunostimulan adalah
golongan senyawa polisakarida, terpenoids, alkaloid dan polifenol (Wagner, 1985).
Kombinasi ekstrak etanol herba sambiloto (Andrographis paniculata) dan daun
mangga (Mangifera indica L.) memiliki efek sinergisme sebagai imunostimulan.
Sambiloto dengan senyawa aktif andrographolide (diterpen lakton), sedangkan
mangga dengan zat aktif manginferin (xanton). Kedua kombinasi ekstrak tersebut
ternyata memiliki efek sinergisme meningkatkan aktivitas fagositosis makrofag
dengan parameter kapasitas fagositosis dibandingkan dengan ekstrak tunggal
(Pradana, 2012). Beberapa obat yang ada dipasaran saat ini pun merupakan
kombinasi dari satu atau lebih ekstrak bahan alam, sebagai contoh Stimuno®,
Fituno®, Primunox®, dan Tribost®.
Meniran merupakan salah satu tanaman yang telah banyak dilaporkan
memiliki efek imunostimulan. Ekstrak air meniran mampu meningkatkan
proliferasi dari sel B dan sel T limfosit, pelepasan sitokin spesifik seperti TNF-α,
IFN-γ dan IL-4. Selain itu, meniran juga mampu memacu aktifitas fagositosis
3
makrofag, aktivitas enzim lisosomal, serta pelepasan nitric oxide oleh makrofag
(Nworu, et al., 2010). Kandungan utama dari meniran yang memiliki efek
imunomodulator adalah golongan alkaloid, lignan, dan flavonoid (Chavali, et al.,
2001; Gupta & Ahmed, 1984; Nara et al., 1977; Wagner, 1985).
Apriyanto (2011) menyebutkan bahwa pemberian ekstrak etanol daun sirih
merah pada tikus dapat menaikkan indeks fagositosis makrofag secara in vivo.
Penelitian Paula (2012) melaporkan bahwa senyawa golongan neolignan daun
sirih merah mempunyai efek imunostimulan secara in vitro terhadap aktivitas
fagositosis makrofag. Daun sirih merah mengandung alkaloid, senyawa fenolat,
flavonoid, isoflavonoid, dan triterpen. Golongan senyawa tersebut sudah diketahui
bermanfaat sebagai antikanker dan imunomodulator (Parmer et al., 1997,
Groteword, 2006).
Berdasarkan penelitian Sriyanti (2012), ekstrak etanol umbi keladi tikus
mampu meningkatkan kemampuan fagositosis makrofag pada tikus terinduksi
cyclophosphamide. Titania (2012) melaporkan ekstrak etanolik umbi keladi tikus
mampu memperbaiki sistem imun akibat terinduksi cyclophosphamide dengan
parameter peningkatan presentase sel T CD8+. Keladi tikus mengandung
metabolit sekunder alkoloid, flavonoid, dan steroid dengan kandungan utamanya
adalah alkoloid dan flavonoid (Mankaran, 2013).
Pemejanan tunggal dari ekstrak herba meniran, daun sirih merah, dan umbi
keladi tikus secara ilmiah dapat berefek imunomodulator. Kandungan senyawa
yang berbeda-beda dan mekanisme aktivasi makrofag yang berbeda dari masingmasing ekstrak ternyata mampu meningkatkan fagositosis makrofag. Kombinasi
4
ketiganya penting untuk diketahui efek sinergisme melalui mekanisme yang sama
yaitu peningkatan aktivitas fagositosis makrofag.
B. Rumusan Masalah
Apakah kombinasi ekstrak etanol herba meniran (Phyllanthus niruri L.), daun
sirih merah (Piper crocatum Ruiz. & Pav.), dan umbi keladi tikus (Typhonium
flagelliforme (Lodd.) Blume) konsentrasi 1 µg/ml, 10 µg/ml, dan 100 µg/ml
dengan kombinasi 1 (EEM 28,6%, ESM 14,3%, EKT 57,1%), kombinasi 2 (EEM
30,8%, ESM 7,7%, EKT 61,5%) kombinasi 3 (EEM 18,2%, ESM 9,1%, EKT
72,7%) dan kombinasi 4 (EEM 30%, ESM 30%, EKT 40%) dapat meningkatkan
aktivitas fagositosis makrofag mencit jantan Balb/c secara in vitro?
C. Tujuan Penelitian
Sebagai data ilmiah yang dapat digunakan sebagai pengembangan obat alami
khususnya obat imunomodulator yang terdiri dari herba meniran (P. niruri), daun
sirih merah (P. crocatum), dan umbi keladi tikus (T. flagelliforme) dan secara
khusus mengevaluasi kombinasi ekstrak tersebut secara in vitro terhadap
peningkatan aktivitas fagositosis makrofag mencit jantan Balb/c.
5
D. Tinjauan Pustaka
1. Sistem Imun
Istilah Imun berasal dari bahasa Latin Immunis yang berarti bebas dari pajak
atau bebas dari beban. Immunitas adalah resistensi terhadap penyakit terutama
infeksi. Gabungan sel, molekul, dan jaringan yang berperan dalam resistensi
terhadap infeksi disebut sistem imun. Reaksi yang dikoordinasi sel-sel, molekulmolekul, dan bahan lainnya terhadap mikroba disebut respon imun. Sistem imun
diperlukan tubuh untuk mempertahankan keutuhannya yang dapat ditimbulkan
berbagai bahan dalam lingkungan hidup seperti bakteri, virus, toksik, jamur, serta
jaringan asing. Sistem imun dapat dibagi menjadi sistem imun alamiah atau
nonspesifik/ natural/ innate/ native/ nonadaptif dan didapat atau spesifik/ adaptif/
acquired (Baratawidjaja & Rengganis, 2010).
Gambar 1. Perbedaan fungsi sistem imun nonspesifik dan spesifik (Abbas and Lichman,
2005)
a. Sistem Imun Nonspesifik
Disebut nonspesifik karena tidak ditunjukkan terhadap mikroba tertentu, telah
ada dan siap berfungsi sejak lahir. Mekanismenya tidak menunjukkan spesifisitas
6
terhadap bahan asing dan mampu melindungi tubuh terhadap banyak patogen
potensial dan merupakan pertahanan terdepan dalam menghadapi serangan
berbagai mikroba dan dapat memberikan respons langsung (Baratawidjaja &
Rengganis, 2010). Sistem imun nonspesifik mencakup :
1) Pertahanan Fisik
Dalam sistem pertahanan fisik, kulit selapur lendir, silia, saluran nafas, batuk,
dan bersin merupakan garis pertahanan terdepan terhadap infeksi. Keratinosit dan
lapisan epidermis kulit sehat dan epitel mukosa yang utuh tidak dapat ditembus
kebanyakan mikroba.
2) Pertahanan biokimia
Lisozim dalam keringat, ludah, air mata, air susu ibu melindungi tubuh
terhadap kuman gram positif dengan cara menghancurkan lapisan peptidoglikan
dinding bakteri. Saliva mengandung enzim seperti laktooksidase yang merusak
dinding mikroba, dan antibodi serta komplemen yang dapat berfungsi yang dapat
berfungsi sebagai opsonin dalam sel mikroba. Asam hidroklorida dalam lambung,
enzim proteolitik, antibodi dan empedu dalam usus halus menciptakan lingkungan
asam yang mencegah infeksi mikroba.
3) Pertahanan humoral
Sistem imun nonspesifik menggunakan berbagai molekul larut. Molekul larut
tertentu diproduksi ditempat infeksi atau cidera dan berfungsi lokal. Molekul
tersebut antara lain adalah peptida anti mikroba, seperti defensin, katelisidin, dan
IFN dengan efek antiviral. Faktor larut lainnya diproduksi ditempat yang lebih
7
jauh dan dikerahkan di jaringan sasaran melalui sirkulasi seperti komplemen dan
PFA.
4) Pertahanan seluler
Yang berperan dalam pertahanan seluler adalah fagosit, sel NK, sel mast dan
eosinofil. Dapat ditemukan dalam dalam sirkulasi atau jaringan. Sel yang
ditemukan dalam sirkulasi adalah neutrofil, eosinofil, basofil, monosit, sel T, sel
B, sel NK, sel darah merah, dan trombosit. Contoh sel dalam jaringan adalah
eosinofil, sel mast, makrofag, sel T, sel plasma, dan sel NK. (Baratawidjaja &
Rengganis, 2010)
b. Sistem Imun Spesifik
Sistem imun spesifik mempunyai kemampuan untuk mengenal benda asing
bagi dirinya. Ada dua jenis mekanisme efektor yang menengahi respons imun
spesifik (1) mereka ditengahi oleh produk sel jaringan-jaringan limfoit yang
disebut sebagai antibodi (humoral immunity), fungsi utama antibodi ialah
pertahanan terhadap infeksi ekstraseluler, virus, bakteri serta menetralkan
toksinnya dan (2) mereka yang diperantarai oleh limfosit sendiri yang
tersentisisasi
yang
disebut
imunitas
seluler
(cell-mediated
immunity)
(Baratawidjaja & Rengganis, 2010).
2. Makrofag
Berbagai sel dalam tubuh dapat melakukan fagositosis, sel utama yang
berperan dalam pertahanan nonspesifik adalah sel mononuklear (monosit dan
makrofag) serta granulosit (Baratawidjaja & Rengganis, 2010).
Fagosit
8
mononuklear dihasilkan oleh sel induk (steam cell) di dalam sumsum tulang
kemudian
berdiferensiasi
menjadi
premonosit-monosit-makrofag.
Monosit
berdiameter 10-15 µm. Kemudian bermigrasi dan menetap di jaringan, sel
monosit matang dan menjadi makrofag. Sel makrofag berdiferensiasi, membesar
jumlahnya dan organel-organel bertambah kompleks (Abbas and Lichtman,
2005). Ukuran makrofag bisa 5-10 kali lebih besar dibanding monosit
(Baratawidjaja & Rengganis, 2010). Makrofag sebagai sel fagosit mampu
membunuh kuman melalui dua mekanisme, yaitu :
a. Oxygen dependent mechanisms
Dimana terjadi peningkatan penggunaan oksigen yang menghasilkan ROIs
(reactive oxygen intermediates) yaitu suatu metabolit oksigen mikrobisidal yang
dilepas selama fagositosis. Ikatan mikroba dengan sel fagositosis terjadi fusi
dengan lisosom membentuk fagolisosom (Abbas & Lichtman, 2005). Dengan
terbentuknya fagolisosom, reseptor fagosit yang mengikat mikroba mengirimkan
sinyal yang mengaktifkan beberapa enzim dalam fagolisosom, salah satunya
oksidase fagosit terbentuk atas pengaruh mediator inflamasi LTB4, PAF dan TNF
atau produk bakteri seperti peptida N-formilmetionil (Baratawidjaja & Rengganis,
2010). Enzim tersebut mengubah oksigen menjadi superoxide anion, hydroxyl
radicals, single oxygen, myeloperoxidase, hydrogen peroxide (H2O2) yang dapat
berinteraksi sehingga menghasilkan metabolit oksigen yang toksik yang dapat
digunakan untuk membunuh kuman (Abbas & Lichtman, 2005).
9
b. Oxygen independent mechanism
Dengan peningkatan reactive oxygen intermediste (ROIs), makrofag
menghasilkan reactive nitrogen intermediates dengan bantuan enzyme seperti
hydrolitic enzyme, defensins (cationic protein), lysozyme, lactoferrin dan nitric
oxide synthase (iNOS). Nitric oxide synthase merupakan katalase dalam konversi
arginin menjadi NO yang bersifat bakterisidal. Dalam fagolisosom terjadi reaksi
fagosit oksidase antara nitrit oksida dengan hidrogen peroksida atau superoksida
yang menghasilkan radikal peroxy nitrit sangat reaktif dan bisa membunuh
mikroba (Abbas & Lichtman, 2005).
3. Fagositosis
Proses fagositosis terjadi melalui beberapa tingkat yaitu kemotaktis,
menangkap, memakan, fagositosis, memusnahkan, dan mencerna. Kemotaktis
adalah pergerakan fagosit ke tempat infeksi sebagai respons terhadap berbagai
faktor seperti produk bakteri dan faktor kimiawi yang dilepas pada aktivasi
komplemen. Antibodi seperti halnya dengan dengan komplemen (C3b) dapat
meningkatkan opsonisasi. Opsonin adalah molekul besar yang diikat dan dapat
dikenal oleh reseptor permukaan sel fagosit makrofag, sehingga meningkatkan
efisiensi fagositosis. Makrofag mengekspresikan banyak reseptor permukaan yang
dapat menelan mikroba. Bila sudah ditelan, membran menutup, partikel
digerakkan ke sitoplasma sel dan terbentuk vesikel intraseluler yang mengandung
bakteri atau bahan lain asal ekstraseluler yang disebut fagosom. Didalam sel
terdapat enzim lisosom yang diperlukan untuk memecah bahan yang ditelan,
10
bersatu dengan fagosom membentuk fagolisosom memungkinkan terjadinya
degradasi oleh ROS dan NO sehingga terjadi degradasi oleh makrofag
(Baratawidjaja & Rengganis, 2010).
Gambar 2. Fagositosis mikroba di dalam sel. (A) Mikroba berikatan dengan reseptor
fagositosis. (B) Membran sel fagosit membentuk fagosom. (C) Mikroba di dalam fagosom
dan berfusi dengan lisosom. (D) Mikroba dihancurkan oleh enzim lisosom , ROS, dan NO di
dalam fagolisosom (Abbas & Lichman, 2005)
Makrofag cocok untuk studi fagositosis karena makrofag dianggap sebagai
salah satu sel fagosit yang paling primitif dari sistem kekebalan tubuh nonspesifik
(Zelikoff et al., 1991 ; Silva et al., 2002 cit Jensch-Junior et al., 2006). Fagositosis
makrofag banyak digunakan sebagai parameter imunologi untuk mengevaluasi
kesehatan/fungsi kekebalan tubuh. Penilaian kemampuan/aktivitas fagositosis
dapat dihitung dengan mengukur kapasitas fagositosis dan indeks fagositosis.
Kapasitas fagositosis =
Indeks fagositosis
=
(Jensch-Junior et al., 2006)
11
4. Imunomodulator
Imunomodulator
bekerja
melalui
mekanisme
imunostimulasi
dan
imunosupresi. Imunostimulasi adalah cara memperbaiki fungsi sistem imun
dengan menggunakan imunostimulan yaitu bahan yang dapat meningkatkan
sistem imun. Imunostimulan dapat berupa imunostimulan biologis (limfokin,
interferon, antibodi monoklonal, Lymphokine-Aktivated Killer, bakteri, jamur)
maupun sintetik (levamisol, isoprinosin, hidroksiklorin, muramil dipeptida, dan
lain-lain) (Bratawidjaja & Rengganis, 2010). Imunosupresi adalah suatu tindakan
untuk menekan respon imun dengan imunosupresan yaitu kelompok obat yang
menekan satu atau lebih komponen dari sistem imun spesifik maupun nonspesifik
seperti mencegah penolakan transpalansi atau mengatasi penyakit autoimun.
Contoh obat imunosupresan adalah cyclosporine dengan aksi mengeblok sitokin
dari T sel (Abbas & Lichman, 2005).
5. Meniran
Gambar 3. Meniran yang digunakan dalam penelitian
Tumbuhan meniran terdapat di India, Cina, Malaysia, Filiphina, Dan
Australia. Tumbuh tersebar hampir di seluruh Indonesia pada ketinggian tempat
12
Antara 1 m sampai 1.000 m di atas permukaan laut. Tumbuh liar di tempat
terbuka, pada tanah gembur yang mengandung pasir, di ladang, di tepi sungai dan
pantai (Departemen Kesehatan RI, 1978).
Dari hasil beberapa penelitian menunjukkan bahwa meniran mengandung
senyawa aktif, yaitu golongan alkaloid seperti 4-metoksi-norsekurinin, 4-metoksisekurinin (Mulchandani & Hassarajani, 1985). Golongan flavonoid seperti
kuersetin, isoquersitrin, astragalin, rutin, kaemferol-1-4’-O-ramnosida; eridiktiol7-ramnosida,
nirurin
(5,6,7,4’-tetrahidroksi-8-(3-metilbut-2-enil)-flavonon-50-
rutinosida (Gupta & Ahmed, 1984; Nara et al., 1977). Golongan lignan seperti
filantin, hipofilantin, nirantin, nirtetralin, filtetralin, lintetralin, nirfilin dan
firnilurin (Ward et al., 1989, Singh et al., 1989). Konsumsi makanan yang
mengandung lignan dapat meningkatkan mediator sitokin seperti IL-12.
Interleukin 12 merupakan mediator utama dan awal pada respon imun nonspesifik untuk mikroba intraseluler (Gambar 4). Paparan terhadap mikroba
menyebabkan sel-sel imun seperti makrofag dan dendritik sel mengekspresikan
IL-12. Selanjutnya sitokin ini akan menginduksi aktivasi berbagai sel pada sistem
imun, sel TCD8+, natural killer, sel TCD4+ dan yang lainnya untuk menanggapi
mikroba bersangkutan. (Abbas & Lichman, 2012 cit Yuswanto, 2013; Chavali et
al., 2010). Senyawa yang mempunyai bioaktifitas sebagai agen imunostimulan
adalah golongan senyawa polisakarida, terpenoids, alkaloid dan polifenol (Wagner,
1985). Meniran mengandung metabolit sekunder flavonoid, alkaloid, dan lignan
sehingga berpotensi sebagai imunostimulan.
13
Gambar 4. Induksi IL-12 pada sel-sel imun (Abbas et al., 2012)
Penelitian yang dilakukan oleh Nworu et al (2010) mengatakan bahwa ekstrak
air meniran mampu meningkatkan proliferasi dari sel B dan sel T limfosit,
produksi IFN-γ dan IL-4. Selain itu, meniran juga mampu memacu aktifitas
fagositosis makrofag, aktivitas enzim lisosomal, dan pelepasan TNF-α, serta
memodulasi pelepasan nitric oxide, oleh makrofag.
6. Sirih Merah
Gambar 5. Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian
Tanaman sirih merah menyukai tempat teduh, berhawa sejuk dengan sinar
matahari 60-75%, dapat tumbuh subur dan bagus di daerah pegunungan. Bila
14
tumbuh pada daerah panas, sinar matahari langsung, batangnya cepat mengering.
Selain itu, warna merah daunnya akan pudar (Manoi, 2007 cit Juliantina, 2008).
Daun sirih merah mengandung alkaloid, senyawa fenolat, flavonoid,
isoflavonoid, dan triterpen. Golongan senyawa tersebut sudah diketahui
bermanfaat sebagai antikanker dan imunomodulator (Parmer et al., 1997;
Groteword, 2006). Secara ilmiah, pemberian ekstrak etanol daun sirih merah pada
tikus dapat menaikkan indeks fagositosis makrofag (Apriyanto, 2011). Senyawa
golongan neolignan dari fraksi tak larut n-heksan ekstrak etanol daun sirih merah
juga dapat meningkatkan indeks fagositosis makrofag. Isolasi yang dilakukan oleh
Paula (2012) mendapatkan senyawa golongan neolignan sebagai imunostimulan,
yaitu isolat 1 dan isolat 2 :
3'''
1'''
2'''
H3CO
3'
H3CO
3''
3
2
1
4
1''
4''
H3CO
2'
2''
6
1'
5''
O
5
OH
6''
OCH3
H3CO
Gambar 6. isolat 1 (2-allyl-4- (1'-hydroxy-1'(3" ,4" ,5"-trimethoxyphenyl) propan-2'-yl)-3,5dimethoxycyclohexa 3,5-dienone)
3'''
1'''
2'''
H3CO
H3CO
3'
3''
3
2
1
4
1''
4''
H3CO
2'
2''
O
5
6
1'
5''
O
6''
OCH3
H3CO
O
CH3
Gambar 7. isolat 2 (2-ally-4-(1'-acetyl-1'-(3" ,4" ,5"-trimethoxyphenyl) propan-2'-yl)-3,5dimethoxycyclohexa-3,5-dienone)
7. Keladi Tikus
Tumbuh berumpun di alam bebas pada tanah gembur, lembab dan teduh.
Waktu yang tepat untuk pengambilan umbi adalah akhir musim hujan sampai
pertengahan musim kemarau. Di pulau Jawa hampir ditemukan hampir di semua
15
tempat, dataran tinggi maupun dataran rendah. Banyak dijumpai di parit dan
sawah (Widyaningrum, 2011).
Ekstrak etanol umbi keladi tikus mampu meningkatkan kemampuan
fagositosis makrofag dan presentase sel T CD8+ pada tikus terinduksi
cyclophosphamide (Sriyanti, 2012; Titania 2012). Keladi tikus mengandung
metabolit sekunder alkoloid, flavonoid, dan steroid dengan kandungan utamanya
adalah alkoloid dan flavonoid (Mankaran, 2013). Kandungan golongan senyawa
flavonoid dan alkaloid bersifat imunostimulan (Wagner, 1985).
8. Ekstraksi dan Maserasi, dan Identifikasi Menggunakan Kromatografi
Lapis Tipis (KLT)
Ekstraksi atau penyarian adalah proses penarikan suatu zat dengan pelarut
sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Peristiwa
difusi lebih berpengaruh dibandingkan osmosis. Dalam penyarian, larutan harus
melewati lapisan batas antara butir serbuk dengan cairan penyari. Kecepatan
melintasi lapisan batas dipengaruhi oleh derajat perbedaan konsentrasi, tebal
lapisan batas, serta koefisien difusi. Ekstraksi dalam penelitian ini menggunakan
metode maserasi. Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi
dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan
penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang
mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan
konsentrasiantara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel, maka
16
larutan yang terpekat didesak keluar (Departemen Kesehatan Republik Indonesia,
1986).
Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling sering digunakan
dalam bidang kimia analisis. Penotolan sampel akan optimal apabila penotolan
dengan bercak sekecil dan sesempit mungkin karena apabila terlalu banyak akan
menurunkan resolusi. Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang
ditotolkan paling sedikit 0,5 µl. Jika lebih besar dari 2-10 µl maka penotolan harus
dilakukan secara bertahap dengan pengeringan antar totolan. Pengembangan
dilakukan pada bejana kromatografi yang sebelumnya sudah dijenuhi dengan uap
fase gerak. Fase gerak pada bejana ± 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak harus berada di
bawah lempeng totolan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak biasanya bejana
dilapisi kertas saring. Bila fase gerak sudah mencapai ujung kertas saring, maka
dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. Pengembangan menaik merupakan teknik
yang paling popular dibanding cara lain. Deteksi bercak dapat dilakukan dengan
cara fisika dan kimia. Dengan cara fisika yaitu pencacahan radioaktif dan
flouresensi sinar UV. Sedang untuk kimiawi dengan reagen kromogenik,
menyemprot dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat, memaparkan uap
dengan iodium, dan lain-lain tergantung senyawa yang akan dianalisis (Gandjar &
Rohman, 2007). Perbandingan jarak rambat suatu senyawa tertentu terhadap jarak
rambat fase gerak, diukur dari titik penotolan sampai titik yang memberikan
intensitas maksimum pada bercak, dinyatakan sebagai harga Rf senyawa tersebut
(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2009).
17
E. LANDASAN TEORI
Salah satu alternatif untuk mendapatkan terapi yang efektif adalah dengan
menggunakan kombinasi obat. Terapi kombinasi obat akan terjadi efek sinergis
obat dan peningkatan potensi dari satu atau lebih obat melalui mekanisme yang
kompleks dari sistem tubuh (Hafid et al., 2011).
Daun sirih merah mengandung alkaloid, senyawa fenolat, flavonoid,
isoflavonoid, triterpen, dan neolignan. Golongan senyawa tersebut sudah
diketahui bermanfaat sebagai antikanker dan imunomodulator (Parmer et al.,
1997; Groteword, 2006; Paula, 2012).
Meniran mampu memacu aktifitas fagositosis makrofag, aktivitas enzim
lisosomal, dan pelepasan TNF-α, serta memodulasi pelepasan nitric oxide oleh
makrofag (Nworu, et al., 2010). Meniran mengandung golongan senyawa
alkaloid, flavonoid, dan lignan yang berefek sebagai imunostimulan.
Berdasarkan penelitian Sriyanti (2012), ekstrak etanol umbi keladi tikus
mampu meningkatkan kemampuan fagositosis makrofag pada tikus terinduksi
cyclophosphamide. Kandungan utama pada keladi tikus adalah flavonoid dan
alkaloid (Mankaran, 2013)
Penelitian dari masing-masing tanaman di atas sudah banyak dilakukan dan
terbukti sebagai agen imunomodulator dengan berbagai kandungan yang berbeda
pada masing-masing ekstrak dalam mengaktifkan sistem imun. Secara umum
golongan senyawa yang memiliki efek imunostimulan adalah golongan flavonoid,
alkaloid dan lignan. Kombinasi ketiganya penting untuk diketahui efek sinergisme
18
dari kandungan metabolit sekunder yang berbeda tersebut melalui mekanisme
sistem imun yang sama yaitu peningkatan aktivitas fagositosis makrofag.
F. Hipotesis
Kombinasi ekstrak etanol herba meniran (P. niruri), daun sirih merah
(P..crocatum) dan umbi keladi tikus (T. flagelliforme) dapat meningkatkan
aktivitas makrofag mencit jantan Balb/c secara in vitro.