A. Sekuensing

Nama
NIM
Kelas
: Khanza Jasmine
: 125100601111015
:H
TUGAS DASAR BIOTENOLOGI
A. Sekuensing
1. Jelaskan pengertian DNA sekuensing!
DNA Sekuensing adalah metode pengurutan basa nukleotida pada (Adenin, Guanin,
Thimin, Sitosinin) pada molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA,
yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung
instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup.
2. Jelaskan pengertian hibridisasi!
Hibridisasi adalah sebuah proses mengawinkan suatu hewan atau tumbuhan dari
varietas yang berbeda, membentuk varietas baru yang memiliki sifat unggul.
Hibridisasi dilakukan untuk mendapatkan kombinasi genetik yang diinginkan melalui
persilangan dua induk yang berbeda genotipnya
3. Jelaskan prinsip kerja southern blot, northern blot dan western blot. Sebutkan
persamaan dan perbedaannya!
Southern Blot
Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran
pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang
direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan
buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas
peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, demikian
pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap
oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan
pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan
aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi
membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut.
Nothern Blot
Northern Blot merupakan tekniknya sama dengan Southern Blot, namun menggunakan
kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA.
Western Blot
Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan
yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut
berikatan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk
memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya.
Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau
PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang
spesifik kepada protein target.
Ketiga metode blotting sama-sama dilakukan dengan hibridisasi, namun terdapat
perbedaan diantara ketiganya, yaitu :
Molekul
Terdeteksi
Sistem
Pendeteksi
Gel
Elektrofere
sis
Gel
Pretreatme
nt
Metode
Blotting
Penanda
Southern
DNA
Northern
RNA
Western
Protein
(Deoxyribonucl
eic acid)
Autoradiograph
y
Chemiluminesc
ent
Colorimetric
(Ribonucleic
acid)
Autoradiograph
y
Chemiluminesc
ent Colorimetric
Chemiluminesc
ent
Colorimetric
Gel
Agarose
Formaldehy
de Gel
Agarose
Tidak
Ada
Gel
Polyacrylamide
Transfer
Capillary
Transfer
Capillary
DNA
Radioactive
atau
nonradioactiv
e
cDNA, cRNA
Radioactive
atau
nonradioactive
Transfer
Electric
Antibodi
Primer
Denaturasi,
Netralisasi
dan
Depurinasi
Tidak
Ada
B. PCR
1. Apa kepanjangan PCR, jelaskan pengertiannya?
Polymerase Chain Reaction merupakan suatu sintesis dan perbanyakan DNA yang
dilakukan secara in vitro. PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi (perbanyakan)
segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. PCR
memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung
reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). PCR melibatkan banyak
siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan
(denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA
target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh
DNA polimerase.
2. Apa saja macam-macam PCR? apa perbedaannya?
Real Time PCR
Real-Time PCR (Quantitative Real time Polymerase Chain Reaction atau Q-PCR)
merupakan suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Digunakan
untuk memperbanyak juga menghitung jumlah target molekul DNA hasil perbanyakan.
Analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan
pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil perbanyakan dapat diamati pada
grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada
Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis,
sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr)
yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip
umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana yang diamplifikasi (diperbanyak)
berupa m-RNA. Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan DNA melainkan RNA.
Proses RT PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase, karena hanya enzim jenis ini
yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan RNA karena polimerase DNA hanya
dapat mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. Pertama-tama RNA diubah dulu
menjadi DNA dengan menggunkan enzime reverse transcriptase yang disebut dengan
komplemen DNA (cDNA) . dalam hal ini disintesis cDNA dari perpasangan anatar
gugus basa U dan A serta G dan C. Dari cDNA inilah dilipat gandakan segemn DNA
yang mirip urutan basa nukleotidanya dengan RNA, hanya U diganti kembali ke T.
Tahap pertama terjadi proses anneling untuk memasangkan primer untuk
memperpanjang segmen cDNA. Setelah terbentuk segmen cDNA ini, baru kemudian
masuk kepada proses PCR biasa. RT-PCR peting digunakan sebagai alat diagnostik
untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus, sebagai informasi untuk studi
epidemiologi.
Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan
bantuan enzim DNA
polymerase
dengan
dua
pasang
primer untuk
memperbanyak fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang
salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua
kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang
sangat spesifik dalam melakukan perbanyakan. Pada nested PCR digunakan 2 pasang
primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena
itu hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan
dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama
daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan
pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi. Mekanisme kerja dari nested PCR sendiri yakni
pada Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase
penempelan. Fase Penempelan, sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal
DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah
produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut dijalankan
pada proses PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested primer) akan
mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama
dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah
sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama.
Multiplex-PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari
lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak
waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus
dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon.
Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang
berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .
PCR-ELISA
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang
meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah
pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan
metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode
ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR. ELISA PCR
berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang
diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama
bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCRELISA adalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan
polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi sequen,
yaitu sequen yang bervariasi antar primer.
3. Jelaskan prinsip kerja real time PCR!
Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter
fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR
dalam reaksi. Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama
fase eksponensial dapat dipantau. Makin tinggi tingkat ekspresi gen target maka deteksi
emisi fluoresen makin cepat terjadi. Untuk mendeteksi ada tidaknya ekspresi gen
partenokarpi pada tanaman tomat transgenik, telah dilakukan pengujian menggunakan
mesin Real-Time PCR.
4. Jelaskan prinsip kerja reverse transkriptase PCR!
Pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA
(complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse
Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro
menggunakan template RNA. pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase,
primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR
adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA,
maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA
yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3′, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer
spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.
RT-PCR meliputi tiga tahap utama:
-
-
-
Tahap pertama adalah reverse transcription (RT) atau transkripsi balik dimana RNA
ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan
primer. Tahapan RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung yang
sama dengan PCR (one-step PCR) atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR)
menggunakan suhu berkisar 40°C sampai 50°C, tergantung pada karakteristik
reverse transcriptase yang digunakan.
Tahap berikutnya adalah denaturasi dsDNA at 95°C, pada tahap ini dua untai DNA
akan terpisah dan primer dapat mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya
diturunkan kemudian yang selanjutnya akan dimulai rantai reaksi baru.
Tahap akhir adalah Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya
perpanjangan DNA menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase
yang termostabil, biasanya pada suhu 72°C, yang merupakan suhu optimal untuk
aktivitas enzim polymerase.
5. Jelaskan prinsip kerja ELISA!