Berdasarkan Analisis RAPD (Random Amplified

II. BAHAN DAN METODE
2.1
Materi Ikan Uji
Ikan yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas 3 populasi yang
dikoleksi dari Sumatra (Jambi), Jawa Barat (Tasikmalaya) yang berasal dari
lingkungan budidaya, dan Kalimantan Selatan yang berasal dari alam, masingmasing sebanyak 10 ekor.
2.2
Ekstraksi DNA
Setiap sampel ikan diambil sirip ekor dan ditimbang sebanyak 5-10 mg
dibilas 2 kali dengan menggunakan akuades, lalu dikeringkan dengan tissue dan
dimasukan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml, kemudian dilisis dengan
menambahkan urea sebanyak 500 µl dan protein kinase (K) 10 µl. Setelah itu
dikocok menggunakan alat vortex dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
atau sampai sirip hancur. Selanjutnya ditambahkan larutan phenol:chloroform:
isoamilalkohol (PCL) dengan perbandingan 25:24:1 sebanyak 1000 µl dan
disentrifuse dengan menggunakan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan lalu dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan etanol 90%
sebanyak 1000 µl dan Na asetat sebanyak 10 µl lalu di sentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pellet dikering
anginkan sampai etanol menguap. DNA dilarutkan dengan menambahkan
rehydration solution sebanyak 100 µl. DNA yang belum akan digunakan dalam
jangka waktu lama disimpan pada suhu 2-8°C.
2. 3
Amplifikasi DNA dengan teknik PCR
Tiga jenis primer yang digunakan adalah OPA2, OPC2, OPC5 (Tabel 1)
Tabel 1. Deskripsi sekuen primer RAPD pada amplifikasi DNA ikan sepat
Primer
OPA 2
OPC 2
OPC 5
Sekuen Nukleotida (5’Æ3’)
TGCCGAGCTG
GTGAGGCGTC
GATGACCGCC
5 Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode PCR. Komposisi bahan
yang digunakan adalah 1 unit dry taq produk Promega, 2 µl DNA genom hasil
ekstraksi, 2 µl primer, 21 µl air akuades sehingga total sebanyak 2 µl. Selanjutnya
disenrtifugasi terlebih dahulu sampai tidak terdapat gelembung. Setelah itu
dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan 35 siklus. Secara umum proses PCR
terdiri dari 3 tahap yaitu denaturasi (penguraian utas ganda DNA), penempelan
primer (annealing) dan pemanjangan utas DNA (elongasi). Predenaturasi
dilakukan pada suhu 94°C selama 2 menit untuk memastikan kesempurnaan
denaturasi, sedangkan denaturasi dilakukan pada suhu 94°C selama 1 menit,
annealing pada suhu 36°C selama 1 menit dan elongasi pada suhu 72°C selama 2
menit. Elongasi akhir dilakukan pada suhu 72°C selama 7 menit untuk
meyakinkan proses elongasi berjalan sempurna, dan proses penstabilan pada suhu
4ºC selama 3 menit. Proses PCR ini berlangsung selama 30 siklus.
2.4
Elektroforesis
Agar yang digunakan adalah gel agarose 2% ditimbang sebanyak 0.8 mg
dan ditambahkan TBE buffer sebanyak 40 ml, kemudian dipanaskan dan
sekaligus diaduk di atas hot plate pada suhu 150°C sampai larutan tersebut
bewarna bening, kemudian ditambahkan ethidium bromide 10 µl. Setelah
mendidih, kemudian dituang ke dalam cetakan agar dan dibentuk sumur gel
dengan menggunakan sisir gel. Gel dibiarkan membeku dan sisir diambil dengan
hati-hati. Gel kemudian ditempatkan pada alat/ tangki elektroforesis dengan posisi
lubang berada pada kutub negatif.
Untuk mengetahui keberhasilan amplifikasi primer yang dicobakan,
campuran 9 µl hasil PCR dengan 2 µl loading die dielektroforesis pada gel
agarose 2% (w/v) dalam larutan TBE dan tegangan 100 volt selama 30 menit
untuk mengukur laju migrasi DNA. Gel direndam agar pita DNAnya dapat terlihat
pada cahaya ultraviolet untuk keperluan dokumentasi menggunakan kamera. Gene
Ruler 100bp DNA Loader digunakan sebagai standar untuk menentukan ukuran
fragmen hasil amplifikasi. Untuk keperluan dokumentasi gambar difoto dengan
menggunakan kamera pollaroid. Gene Ruler 100bp DNA Loader digunakan
sebagai standar untuk menentukan ukuran fragmen hasil amplifikasi.
6 2.5
Karakterisasi Morfometrik
Ikan sepat diambil secara acak sebanyak 10 ekor per masing- masing
populasi dan dipilih berdasarkan kelengkapan anggota tubuhnya. Metode
pengukuran morfometrik dengan menghubungkan jarak titik-titik tanda yang
dibuat pada kerangka tubuh (Gambar 1). Pemilihan titik tersebut berdasarkan
modifikasi teori Blezinsky and Doyle (1987). Pembuatan titik dilakukan dengan
cara ikan diletakkan di atas kertas folio yang berlapis plastik kemudian mulai
ditusuk tepat disisi titik-titik yang telah ditentukan. Karakterisasi morfometrik
dilakukan dengan membagi tubuh ikan menjadi 3 bagian besar yaitu kepala, ekor
dan badan. Sepuluh titik tersebut yaitu: mulut, punuk, awal sirip dorsal, akhir sirip
dorsal, awal sirip caudal, akhir sirip caudal, awal sirip anal, awal ventral, awal
pektoral, bawah mulut. Selanjutnya masing-masing jarak titik di seluruh badan
ikan tadi dihubungkan dan diukur dengan penggaris sehingga dari 10 titik
diperoleh 21 karakter yang dapat dilihat pada Gambar 1.
B1
B2
D5
A1
A2
A3 A6
A4 A5
C3
C2
B7
B4
B3
B6
B5
D4
D1
D2
D3
C1
Gambar 1. Titik-titik morfometrik pada ikan sepat
Keterangan gambar:
A1
: Jarak antara titik awal mulut dengan punuk
A2
: Jarak antara titik awal mulut dengan bawah mulut
A3
: Jarak antara punuk dengan bawah mulut
A4
: Jarak antara punuk dengan sirip ventral
A5
: Jarak antara punuk dengan sirip pektoral
A6
: Jarak antara punuk dengan awal sirip anal
B1
: Jarak antara punuk dengan awal sirip dorsal
B2
: Jarak antara awal sirip dorsal dengan akhir sirip dorsal
B3
: Jarak antara awal sirip dorsal dengan sirip pektoral
7 B4
B5
B6
B7
C1
C2
C3
D1
D2
D3
D4
D5
: Jarak antara sirip dorsal dengan awal sirip ventral
: Jarak antara akhir sirip dorsal dengan sirip ventral
: Jarak antara akhir sirip dorsal dengan sirip pektoral
: Jarak antara awal sirip dorsal dengan awal sirip anal
: Jarak antara awal sirip anal dengan sirip pektoral
: Jarak antara sirip pektoral dengan sirip ventral
: Jarak antara sirip ventral dengan bawah mulut
: Jarak antara akhir sirip dorsal dengan akhir sirip caudal
: Jarak antara awal sirip caudal dengan akhir sirip caudal
: Jarak antara akhir sirip caudal dengan awal sirip anal
: Jarak antara awal sirip anal dengan awal sirip caudal
: Jarak antara akhir sirip dorsal dengan awal sirip caudal
2.6
Analisis Data
Keragaman genetik dianalisis menggunakan program TFPGA (Tools for
Population Genetic Analysis) (Nei dan Tajima, 1981). Hubungan kekerabatan
interpopulasi dianalisis berdasarkan jarak genetik dengan program UPGMA
(Unweight Pair Methods Arithmetic) menurut Wright (1978) yang dimodifikasi
oleh Rogers (1972) dalam Arifin et al., (2007) dan disajikan dalam bentuk
dendrogram. Data seluruh karakter morfometrik dikonversi ke dalam rasio
karakter dibagi dengan panjang standar. Data rasio ukuran karakter dianalisis
menggunakan program SPSS 16,0. Analisis keragaman morfologis antar lokasi
dilakukan secara deskriptif dengan membandingkan koefisien keragaman (CV).
Untuk melihat penyebaran karakter dilakukan dengan analisis canonical dan untuk
melihat keeratan korelasi dan kemiripan dilakukan analisis sharing component.
8