PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA S2 HERBAL 2012 PROGRAM

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA S2 HERBAL
2012
PROGRAM PASCASARJANA
Fakultas Farmasi
Universitas Indonesia
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
PENENTUAN AKTIVITAS ALANIN AMINOTRANSFERASE
(ALT /SGPT)
Hati adalah kelenjar terbesar dalam tubuh, dengan berat sekitar 1000-1500 gram atau 2% berat
badan orang dewasa normal. Hati terletak di bawah diafragma kanan yang dilindungi oleh tulang iga
kanan. Hati normal kenyal dengan permukaan yang licin.
Transaminase adalah kelompok enzim transferase yang mengkatalisis pemindahan gugus amino
dari suatu asam α-amino ke asam α-keto. Enzim ini berperan dalam pembentukan dan pemecahan asam
amino.
Terdapat dua enzim transaminase yang penting secara klinis:
1. Aspartat Aminotransferase (AST), atau dikenal dengan nama lain Glutamat Oksaloasetat
Transaminase (GOT). Fungsinya adalah mengkatalisis reaksi pemindahan gugus amin dari
asam amino aspartat ke asam α-ketoglutarat, yang akhirnya membentuk asam oksaloasetat
dan asam glutamat.
2. Alanin Aminotransferase (ALT), atau dikenal dengan dengan nama lain Glutamat Piruvat
Transaminase (GPT). Fungsinya adalah mengkatalisis reaksi pemindahan gugus amin dari
asam amino alanin ke asam α-ketoglutarat, yang akhirnya membentuk asam piruvat dan
asam glutamat.
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
ALT terdapat di hati, ginjal, otot rangka, dan jantung. Aktivitas ALT tertinggi ditemukan pada hati,
sehingga kenaikan kadar enzim ini di dalam plasma/serum dapat digunakan sebagai diagnosis adanya
kerusakan parenkim hati. Nilai normal ALT pada manusia dewasa adalah 7-55 Unit/L.
Prinsip Pengukuran ALT
ALT mengkatalisis proses pemindahan gugus amin dari dl-alanin ke asam α-ketoglutarat sehingga
menghasilkan asam piruvat dan asam glutamat. Piruvat yang terbentuk direaksikan dengan 2,4dinitrofenilhidrazin menghasilkan fenilhidrazon yang berwarna merah coklat dalam larutan alkalis.
Intensitas warna yang terbentuk kemudian ditentukan menggunakan spektrofotometer single beam pada
panjang gelombang (λ) 505 nm.
I. Pembuatan larutan pereaksi
Pembuatan dapar fosfat 0,1 M pH 7,4

Pembuatan larutan dinatrium hidrogenfosfat 0,1 M
Dinatrium hidrogenfosfat ditimbanng seksama sebanyak 13,4 g, kemudian dilarutkan dalam 50
mll akuades

Pembuatan larutan kalium dihidrogenfosfat 0,1 M
Kalium dihifrogenfosfat ditimbang seksama sebanyak 1,36 g, kemudian dilarutkan dalam 100 ml
akuades.

Larutan dinatrium hidrogenfosfat 0,1 M diambil sebanyak 420 ml, kemudian ditambahkan
dengan larutan kalium dihidrogen fosfat 0,1 M sebanyak 80 ml, dicampur dan diaduk hingga
homogeny. pH-nya disesuaikan dengan penambahan asam klorida atau natrium hidroksida hingga
didapat pH 7,4 pada pembacaan menggunakan pH meter.
Pembuatan larutan standar piruvat 0,002 M (larutan standar)
Natrium piruvat ditimbang seksama sebanyak lebih kurang 22,0 mg, kemudian dilarutkan dalam
dapar fosfat hingga 100 ml.
Pembuatan dapar substrat
Asam α-ketoglutarat ditimbang seksama sebanyak lebih kurang 29,2 mg, kemudian ditambahkan
dengan dl-alanin yang telah ditimbang dengan seksama sebanyak 1,78 g. Keduanya kemudian dilarutkan
dengan bantuan natrium hidroksida 1 N yang telah disesuaikan pHnya sebesar 7,4 dan dicukupkan hingga
volume 100 ml dengan dapar fosfat.
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
Pembuatan reagen 2,4-dinitrofenilhidrazin
Zat warna 2,4-dinitrofenilhidrazin ditimbang seksama sebanyak lebih kurang 19,8 mg, kemudian
dilarutkan dengan asam klorida 1 N hingga volumenya tepat 100 ml.
II. Pembuatan Kurva Kalibrasi ALT
1. Campurkan 0,0 ml; 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml larutan standar dengan larutan dapar
substrat hingga tepat 1,0 ml.
2. Tambahkan 0,5 ml reagen warna ke dalam tiap tabung reaksi. Homogenkan dengan vortex,
kemudian diamkan pada suhu kamar selama 20 menit.
3. Tambahkan 5,0 ml NaOH 0,4 N. Homogenkan dengan vortex, kemudian diamkan pada suhu
kamar selama 30 menit.
4. Ukur serapannya menggunakan spektrofotometer single beam pada λ 505 nm.
III. Pengukuran Sampel
1. Campurkan 0,1 ml serum/plasma dengan larutan dapar substrat hingga tepat 1,0 ml.
2. Tambahkan 0,5 ml reagen warna ke dalam tiap tabung reaksi. Homogenkan dengan vortex,
kemudian diamkan pada suhu kamar selama 20 menit.
3. Tambahkan 5,0 ml NaOH 0,4 N. Homogenkan dengan vortex, kemudian diamkan pada suhu
kamar selama 30 menit.
4. Ukur serapannya menggunakan spektrofotometer single beam pada λ 505 nm.
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
PENGUKURAN MDA SERUM
Prinsip Pengukuran MDA
Penetapan MDA dengan metode uji asam tiobarbiturat (TBA) dapat diukur secara
spektrofotometrik berdasarkan prinsip bahwa asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami
proses peroksidasi menjadi peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi
malondialdehid (MDA). MDA bila direaksikan dengan asam tiobarbituburat (thiobarbituric acid, TBA),
akan membentuk senyawa berwarna merah muda yang menyerap cahaya pada panjang gelombang 532
nm. Jumlah MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid.
I. Pembuatan Larutan Standar dan Pereaksi

Pembuatan larutan asam tiobarbiturat (TBA) 0,67%
Asam tiobarbiturat ditimbang seksama sebanyak 0,67 gram lalu dilarutkan dalam akuades hingga
mencapai volume 100 ml.

Pembuatan larutan Asam Trikloroasetat (TCA) 20%
Asam Trikloroasetat ditimbang seksama sebanyak 20,0 gram lalu dilarutkan dilarutkan dalam
akuades hingga mencapai volume 100 ml.

Pembuatan Larutan Standar Tetraetoksipropan (TEP) pengenceran 1/80000x
Larutan standar TEP murni dipipet sebanyak 2 µl lalu dilarutkan dalam 160 ml akuades.
II.
a.
Prosedur Pengukuran MDA Serum
Pembuatan Larutan Standar TEP
Larutan standar dibuat dengan 6 konsentrasi yaitu 0,1562; 0,3125; 0,625; 1,25; 25; dan 5,0 nmol/ml.
Larutan standar dengan berbagai konsentrasi ini dibuat dari larutan stok standar TEP berturut-turut
dipipetkan 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 dan 100 µL dimasukkan kedalam tabung reaksi, kedalam masingmasing larutan standar ditambahkan akuades hingga volume 1000 µL. Kemudian ditambahkan TCA 20%
sebanyak 500 µL. Disiapkan pula satu tabung sebagai blangko. Campuran larutan selanjutnya di vorteks
sampai larutan homogen, lalu ditambahkan 1000 µL larutan TBA 0,67%. Larutan kemudian dipanaskan
dalam penanggas air pada suhu
950 – 1000 C. Selanjutnya didinginkan dalam bejana berisi air es dan diukur serapannya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.
b.
Pembuatan Kurva Kaliberasi TEP
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
Cara membuat kurva standar adalah dengan mengukur terlebih dahulu serapan dari masingmasing larutan standar dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Selanjutnya
menghitung persamaan regresi Y= a+bx, dimana Y adalah nilai serapan (standar blangko) dan X adalah
konsentrasi standar. Proses pembuatan standar dapat dilihat pada Tabel 1.1.
c.
Prosedur Pengukuran Kadar MDA Serum
Dilakukan pengambilan sampel serum sebanyak 1000 µL, kemudian dimasukkan ke dalam
tabung reaksi dan ditambahkan 500 µL larutan TCA 20% dingin lalu divorteks selama 1 menit.
Selanjutnya larutan disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk
diambil kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain dan ditambahkan 1000 µL TBA 0,67%.
Selanjutnya tabung dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 95 - 100º C selama 10 menit. Setelah
itu tabung reaksi dikeluarkan dari penangas air dan didinginkan dalam bejana yang berisi air es. Hasil
reaksi diambil kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.
Proses Pengukuran Kadar MDA Serum dapat dilihat pada tabel 1.1.
Tabel 1.1. Proses pembuatan standar dan sampel
UJI
BLANGKO
STANDAR (µL)
(µL)
0,1562
0,3125
0,625
1,25
2,5
5,0
Akuades
(µL)
1000
996,875
993,75
987,5
975
950
900
Standar
(µL)
-
3,125
6,25
12,5
25
50
100
Sampel
(µL)
-
-
-
-
-
-
-
1000
500
500
500
500
500
500
500
TCA
500
20% (µL)
Vorteks
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
Sentrifus
3000 rpm,
10 menit,
supernatan
diambil
TBA
0.67%
(µL)
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
Diinkubasikan pada penangas air suhu 95 – 100 0C selama 10 menit, kemudian dinginkan
dalam bejana berisi air es dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 532 nm
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
PENETAPAN KADAR KREATININ URIN
I. Pembuatan Larutan Standar dan Pereaksi
 Pembuatan Larutan Pikrat Jenuh
Larutan asam pikrat jenuh dibuat dengan memasukkan asam pikrat, ke dalam 100 mL akuades
hingga terbentuk larutan jenuh. Kemudian disaring dan disimpan dalam botol cokelat.
 Pembuatan Larutan Natrium Hidroksida 1N
Larutan natrium hidroksida 1N dibuat dengan menimbang 4 g natrium hidroksida, kemudian
dilarutkan dalam akuades hingga volume 100 mL.
 Pembuatan Larutan Standar Kreatinin
Kreatinin standar ditimbang lebih kurang 100,0 mg lalu dilarutkan dalam asam klorida encer (20
mmol/liter) hingga tepat volume 50 mL di dalam labu ukur (2 mg/mL). Kemudian dilakukan
pengenceran hingga memperoleh konsentrasi 1 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,4 mg/mL dan 0,2 mg/mL.
II.
Prosedur Pengukuran Kreatinin Urin
Pengukuran dilakukan dengan memasukkan larutan asam pikrat jenuh, natrium hidroksida
1 N dan standar, sampel urin atau akuades ke dalam labu ukur 10 mL seperti tertera dalam tabel 1.2,
kemudian didiamkan selama 25 menit. Setelah itu, diencerkan dengan akuades hingga batas labu dan
dicampur hingga homogen. Serapan diukur pada panjang gelombang 540 nm.
Tabel 1.2 Pengukuran Kreatinin Urin
Dari
Larutan
Blanko
Standar (duplo)
Uji (duplo)
Akuades
100 µL
-
-
Standar
-
100 µL
-
Urin
-
-
100 µL
Larutan asam pikrat jenuh
2 mL
2 mL
2 mL
Natrium hidroksida 1N
400 µL
400 µL
400 µL
berbagai konsentrasi standar, dibuat kurva kalibrasi, kemudian serapan sampel diplotkan ke persamaan
kurva kalibrasi untuk memperoleh kadar kreatinin urin.
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal
PENETAPAN KADAR KREATININ SERUM
I. Pembuatan Larutan Standar dan Pereaksi
 Pembuatan Asam Pikrat Jenuh 1,3%
Asam pikrat ditimbang seksama sebanyak 1,3 gram lalu dilarutkan dalam akuades hingga mencapai
volume 100 ml.

Pembuatan Pikrat Alkalis
Di-kalium Hidrogen Fosfat ditimbang seksama sebanyak 218,0 mg dan dimasukkan kedalam labu
ukur 100 ml, lalu dilarutkan dengan akuades (± 5 mL), Sodium Hidroksida ditimbang seksama
sebanyak 600 mg kemudian dimasukkan kedalam larutan sebelumnya. Dilakukan penambahan
akuades (± 20 mL), labu digoyang hingga larut sempurna. Selanjutnya larutan asam pikrat jenuuh
dipipet sebanyak 12,5 mL lalu dimasukkan kedalam labu yang telah berisi campuran larutan DiKalium Hidrogen Fosfat dan Sodium Hidroksida, larutan digoyang hingga homogen. Selanjutnya
volume larutan dicukupkan dengan akuades, dikocok kembali hingga homogen dan dimasukkan
kedalam botol coklat dengan suhu penyimpanan 40C.
 Pembuatan Larutan Standar Kreatinin
Kreatinin standar ditimbang seksama ± 40,0 mg, lalu dilarutkan dalam asam klorida encer (20
mmol/liter) hingga tepat volume 100 mL (0,4 mg/mL atau 40 mg/dL) di dalam labu ukur.
Kemudian dilakukan pengenceran hingga diperoleh konsentrasi 4, 2, 1, 0,5 dan 0,25 mg/dL.
II. Prosedur Pengukuran Kreatinin Urin
Tabel 1.3 Pengukuran Kadar Kreatinin Serum
Sampel
Standar
Reagen
1000 μL
1000 μL
Standar
100 μL
-
-
100 μL
Kreatinin
Serum
Setelah tepat detik ke-20 (Ao) dibaca dan dicatat serapannya. Kemudian dilanjutkan pembacaan
serapan pada detik 80(At). Perubahan serapan (ΔA) diperoleh dari (At-Ao). Pengukuran serapan dilakukan
pada panjang gelombang 505 nm.
Penuntun Praktikum Biokimia S2 Herbal