BAB III Metodologi

3. METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2008 sampai bulan
Januari 2009 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratourium
Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen
Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, dan Pusat Studi
Biofarmaka Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada persiapan sampel antara lain cool box, pisau,
talenan, timbangan digital, dan kertas label. Alat-alat untuk ekstraksi sampel
antara lain timbangan digital, gelas ukur, labu erlenmeyer, sudip kaca, kertas
label, corong kaca, nilon mess, pipet tetes, kertas saring whatman, aluminium foil,
dan kapas steril. Alat-alat untuk evaporasi ekstrak antara lain vacuum rotary
evaporator, dan botol steril. Alat-alat untuk uji aktivitas antibakteri antara lain
tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes, pipet volumetrik, bulp, autoklaf,
jarum ose, bunsen, inkubator, vorteks, cawan petri, dan paper disc.
Bahan
yang
digunakan
sebagai
sampel
adalah
kerang
hijau
(Perna viridis). Bahan yang dibutuhkan selama transportasi sampel dari tempat
pelelangan ikan hingga laboratorium adalah es curai dan air.
Bahan untuk
ekstraksi antara lain pelarut teknis (n-heksana, etil asetat dan metanol). Bahan
untuk analisis fitokimia antara lain kloroform, metanol, kloroform-amoniak,
H2SO4 2M, ragen Degendorf, reagen Mayer, reagen Wagner, NaOH 10%, H2SO4
pekat, etanol, eter, pereaksi Lieberman Buchard, aquades, FeCl3 1%. Sedangkan
bahan untuk uji aktivitas antibakteri adalah kloramfenikol sebagai antibakteri
standar, bakteri uji (Escherichia coli dan Staphylococcus aureus), media NB
(Nutrient Broth), media Mueller Hinton Agar (MHA), korek api, spiritus, dan
alkohol 70%.
3.3. Metode Kerja
Penelitian ini terdiri dari dua tahap, tahap satu yaitu analisis proksimat
(analisis kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan karbohidrat),
ekstraksi senyawa bioaktif dan uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kasar kerang
hijau, sedangkan tahap dua, yaitu analisis fitokimia.
3.3.1. Penelitian tahap satu
3.3.1.1.Analisis proksimat
Analisis proksimat ini dilakukan untuk mengetahui kandungan gizi dari
kerang hijau. Pengujian yang dilakukan antara lain adalah analisis kadar air, kadar
abu, kadar lemak, kadar protein dan kadar karbohidrat (by difference)
a. Analisis kadar air (AOAC 1995)
Cawan kosong yang digunakan dikeringkan dalam oven selama 15 menit
atau sampai diperoleh berat tetap, kemudian didinginkan dalam desikator
selama 30 menit dan ditimbang. Sampel kira-kira sebanyak 5 gram ditimbang
dan diletakkan dalam cawan kemudian dipanaskan dalam oven selama 24 jam
pada suhu 105 0C. Cawan kemudian didinginkan dalam dasikator dan setelah
dingin ditimbang kembali. Persentase kadar air dapat dihitung dengan rumus
sebagai berikut:
% Kadar air 
B1 - B2
 100%
B
Keterangan : B = Berat sampel (gram)
B1 = Berat (sampel + cawan) sebelum dikeringkan
B2 = Berat (sampel + cawan) setelah dikeringkan
b. Analisis kadar abu (AOAC 1995)
Pengukuran kadar abu ditentukan dengan alat tanur. Cawan porselin
dipanaskan dalam desikator dan ditimbang.
Sebanyak 5 gram sampel
dimasukkan dalam cawan porselin lalu dibakar sampai tidak berasap lagi lalu
diabukan dalam tanur suhu 600 0C sampai berwarna putih (semua sampel
menjadi abu) dan berat konstan. Hasil pembakaran tersebut kemudian
didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Perhitungan kadar abu adalah
sebagai berikut:
% Kadar abu 
Berat abu (g)
 100%
Berat sampel (g)
c. Analisis kadar protein (AOAC 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram lalu dimasukkan ke dalam labu
kjeldal. Setelah itu ditambahkan 10 ml H2SO4 dan pelet kjeldal kemudian
sampel didihkan dalam ruang asam sampai cairan jernih. Larutan jernih ini
lalu dipindahkan ke dalam labu ukur 100 ml. Labu kjeldal dibilas dengan
aquades (1-2 ml) kemudian air bilasan dimasukkan ke dalam labu ukur,
kemudian diencerkan dengan aquades hingga 100 ml.
Sampel yang telah diencerkan dengan aquades dipipet sebanyak 10 ml
dan dimasukkan dalam alat destilasi, kemudian ditambahkan sedikit demi
sedikit NaOH 40% sebanyak 10 ml. Ujung tabung kondensor alat destilasi
harus terendam dalam erlenmeyer yang berisi larutan asam borat (H3BO3) 4%.
Dilakukan pemanasan alat destilasi hingga larutan asam borat yang semula
berwarna merah muda menjadi berwarna kehijau-hijauan. Selang kondensor
kemudian dibilas dengan beberapa ml aquades untuk menghindari
kemungkinan adanya nitrogen yang menempel pada selang.
Setelah itu
Erlenmeyer berisi larutan asam borat (H3BO3) yang telah menangkap nitrogen
dari sampel, dititrasi dengan HCl 0,1 N hingga terjadi perubahan warna
menjadi merah muda. Titrasi juga dilakukan terhadap larutan blanko.
%N
(ml sampel - ml HCl blanko)  N HCl  14,007
 100%
Berat sampel
% Protein  % N  6,25
d. Analisis kadar lemak (AOAC 1995)
Metode yang digunakan dalam analisis lemak adalah metode ekstraksi
soxhlet. Sampel sebanyak 5 gram dibungkus dengan kertas saring, setelah itu
kertas saring yang berisi contoh tersebut dimasukkan dalam alat ekstraksi
soxhlet. Alat kondensor diletakkan diatasnya dan labu lemak diletakkan
dibawahnya. Pelarut hexana dimasukkan ke dalam labu lemak secukupnya.
Selanjutnya dilakukan refluks selama minimal 5 jam sampai pelarut yang
turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih.
Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi, dan pelarut ditampung
kembali. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi kemudian dipanaskan
di dalam oven pada suhu 105 0C hingga mencapai berat tetap dan setelah itu
didinginkan dalam desikator. Selanjutnya labu beserta lemak didalamnya
ditimbang dan berat lemak dapat diketahui.
% Kadar lemak 
Berat lemak (g)
 100%
Berat sampel (g)
e. Analisis kadar karbohidrat (AOAC 1995)
Analisis kadar karbohidrat dilakukan secara by different, yaitu dengan
menggunakan rumus:
Kadar karbohidra t  100% - K.lemak - K.protein - K.air - K.abu
3.3.1.2. Ekstraksi senyawa
Jamaluddin 2005)
bioaktif
(modifikasi
Quinn
1988
dalam
Tahapan proses ekstraksi kerang hijau meliputi penghancuran sampel,
maserasi, penyaringan dan evaporasi. Metode yang digunakan dalam pembuatan
ekstrak senyawa bioaktif dari kerang hijau (Perna viridis) adalah metode ekstraksi
bertingkat yang telah dimodifikasi. Sebelumnya kerang dipisahkan dari
cangkangnya, dicuci dan dicacah. Sampel yang telah dihancurkan kemudian
ditimbang sebanyak 200 gram dan dimasukkan dalam erlenmeyer kemudian
dimaserasi dengan pelarut sebanyak 400 ml (perbandingan 1:2 (w/v)). Pelarut
yang digunakan secara berturut-turut yaitu n-hexana (non polar), etil asetat
(semi polar) dan metanol (polar).
Pertama, sampel dimaserasi dengan n-hexana selama 24 jam pada suhu
ruang. Hasil maserasi disaring menggunakan nilon mess sebagai saringan kasar,
selanjutnya penyaringan dengan corong kaca dan kertas saring whatman untuk
memisahkan filtrat dengan residu I. Residu I kemudian dimaserasi dengan pelarut
etil asetat selama 24 jam, disaring sehingga diperoleh filtrat etil asetat dan residu
II.
Residu II selanjutnya dimaserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam,
disaring sehingga diperoleh filtrat metanol dan residu III.
Filtrat n-hexana, etil asetat dan metanol yang diperoleh disimpan dalam
refrigerator selanjutnya dievaporasi dengan menggunakan vacuum rotary
evaporator pada suhu 30 0C, sehingga diperoleh ekstrak kasar n-hexana, etil asetat
dan metanol.
Ekstrak yang diperoleh dimasukkan dalam botol steril untuk
mencegah kontaminasi kemudian disimpan dalam freezer. Tahapan proses
ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 8.
Kerang hijau
Pemisahan dari cangkang
Pencucian
Pencacahan
Penimbangan
maserasi dengan heksana (24 jam)
Penyaringan
Filtrat heksana
Residu I
Evaporasi
maserasi dengan etil asetat (24 jam)
Penyaringan
Crude extract
heksana
Filtrat heksana
Residu I
Evaporasi
maserasi dengan metanol (24 jam)
Crude extract etil
asetat
Penyaringan
Filtrat heksana
Residu III
Evaporasi
Crude extract
Metanol
Gambar 8. Tahapan proses ekstraksi (modifikasi Quinn 1988 diacu dalam
Jamaluddin 2005)
3.3.1.3.Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kasar kerang hijau (Perna viridis)
(modifikasi Noer & Nurhayati 2006)
Uji aktivitas antibakteri dilakukan terhadap ekstrak kerang hijau
(Perna viridis). Uji ini meliputi persiapan media cair, persiapan media padat dan
prosedur uji aktivitas antibakteri. Bakteri uji yang digunakan adalah Escherichia
coli dan Staphylococcus aureus. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan
metode difusi agar menggunakan kertas cakram (paper disc).
a) Persiapan media cair
Penyegaran bakteri uji, yaitu E. coli dan S. aureus dilakukan pada media
nutrient broth. Media nutrient broth dibuat dari 2,6 gram media NB bubuk
yang dilarutkan dalam aquades hingga volume 200 ml, selanjutnya dipanaskan
hingga mendidih. NB dipipet sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi dan
masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil.
Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0C
selama 15 menit. Setelah itu media didinginkan di tempat yang steril pada
suhu ruang.
b) Persiapan suspensi bakteri
Sebanyak 1 ose bakteri uji dimasukkan ke dalam media cair yang telah
dingin secara aseptik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18 jam.
c) Persiapan media padat
Media padat yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri
adalah media Mueller Hinton Agar (MHA). MHA dibuat dari 12,16 gram
media MHA bubuk yang dilarutkan dengan aquades hingga volume 320 ml,
selanjutnya dipanaskan hingga mendidih. Larutan dipipet 20 ml, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup
menggunakan kapas dan alumunium foil steril. Sebelum digunakan, media
disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit.
Media
didiamkan pada suhu ruang sampai agar membeku. Setelah membeku, media
disimpan dalam refrigerator.
d) Uji pendahuluan aktivitas antibakteri (modifikasi Noer & Nurhayati 2006)
Sebanyak 20 ml media MHA dalam keadaan cair, ditambah dengan
20 µl bakteri uji yang telah diukur Optical Density (OD) pada λ= 600 nm.
(OD masing-masing bakteri uji antara lain 0,788 untuk bakteri E.coli dan
0,723 untuk bakteri S. Aureus). Agar yang telah ditambah dengan bakteri uji
dihomogenkan dengan vorteks, kemudian segera dituangkan ke dalam cawan
petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar bakteri lebih
menyebar secara merata. Media agar tersebut didiamkan pada suhu ruang
selama 15 menit atau sampai agar membeku.
Ekstrak kerang hijau yang digunakan adalah ekstrak n-hexana, etil
asetat, dan metanol. Dalam penentuan aktivitas antibakteri pada berbagai
konsentrasi, setiap paper disc diberi ekstrak sebanyak 20 µl dengan
konsentrasi 5 % (5 mg ekstrak yang dilarutkan dalam 1 ml metanol). Setelah
seluruh pelarut ekstrak pada paper disc menguap, masing-masing paper disc
diletakkan dalam cawan petri yang telah berisi agar dan bakteri, kemudian
cawan petri disimpan dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu 37 0C
selama 18-20 jam. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dengan mengamati zona
hambatan yang terbentuk disekeliling paper disc.
Antibakteri dikatakan
positif apabila terbentuk zona hambatan berupa zona bening disekeliling
paper disc dan antibakteri negatif ditandai dengan tidak terbentuknya zona
bening. Metode uji penapisan awal senyawa antibakteri dapat dilihat pada
Gambar 9.
e) Prosedur pengujian aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak
(modifikasi Darusman et al. 1994)
Media MHA sebanyak 20 ml dalam keadaan cair ditambahkan dengan
20 µl bakteri uji yang telah diukur Optical Density (OD)nya pada λ= 600 nm,
(OD masing-masing bakteri uji antara lain 0,797 untuk bakteri E. coli dan
0,748 untuk bakteri S. Aureus) kemudian divorteks sebentar agar homogen
dan segera dituangkan ke dalam cawan petri steril lalu digoyangkan
membentuk angka 8 agar bakteri menyebar secara merata. Media tersebut
didiamkan pada suhu ruang selama beberapa saar agar membeku.
Ekstrak kerang hijau yang digunakan merupakan ekstrak yang memiliki
aktivitas paling baik pada pengujian awal. Dalam penetuan aktivitas
antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak, setiap paper disc diberi ekstrak
dengan konsentrasi 3,5 mg/ml, 5 mg/ml, 6,5 mg/ml, dan 8 mg/ml (modifikasi
Darusman et al. 1994) sebanyak 20 µl. Paper disc dibiarkan sampai
mengering atau pelarutnya menguap, kemudian masing-masing paper disc
diletakkan dalam cawan petri berisi agar dan bakteri yang telah membeku,
kemudian disimpan kedalam inkubator dalam keadaan terbalik selama 18-20
jam pada suhu 37
0
C. Metode uji aktivitas antibakteri pada berbagai
konsentrasi ekstrak dapat dilihat pada Gambar 10.
Kemudian dilakukan
pengamatan dan pengukuran zona bening yang terbentuk.
Bakteri uji
Penginokulasian bakteri 20 µl dalam 20 ml media MHA
Penghomogenan dengan vorteks
Penuangan agar ke dalam cawan petri steril
Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku
Pemberian 20 µl ekstrak pada paper disc dengan konsentrasi 5 mg/ml
Peletakkan paper disc ke dalam cawan yang telah berisi bakteri uji
Inkubasi pada suhu 37 0C selama 18-20 jam dalam posisi terbalik
Zona bening
Pengamatan dan pengukuran zona bening
Gambar
9.
Tahapan uji penapisan
Noer & Nurhayati 2006 )
awal
antibakteri
(modifikasi
Bakteri uji
Penginokulasian bakteri (20 µl) dalam 20 ml media agar
Penghomogenan dengan vorteks
Penuangan agar ke dalam cawan petri steril
Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku
Pemberian paper disc ekstrak 20 µl dengan konsentrasi, 3,5 mg/ml, 5 mg/ml,
6,5 mg/ml, 8 mg/ml
Peletakkan paper disc kedalam cawan yang telah berisi bakteri uji
Inkubasi pada suhu 37 0C selama 18-20 jam dalam posisi terbalik
Zona bening
Pengamatan dan pengukuran zona bening
Gambar 10. Tahapan uji aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak
(modifikasi Darusman et al 1994)
f) Pengukuran zona hambat
Aktivitas antibakteri dinyatakan positif apabila terbentuk zona hambat
berupa zona bening disekeliling paper disc dan aktivitas antibakteri
dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk zona bening.
hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Diameter zona
Zona hambat  A - B
Keterangan :
A = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm)
B = Diameter kertas cakram (mm)
3.3.1. Penelitian tahap dua
3.3.2.1. Analisis fitokimia
Identifikasi senyawa kimia yang berperan sebagai antibakteri dalam kerang
hijau (Perna viridis) dilakukan terhadap senyawa-senyawa sebagai berikut
(Harborne 1987):
a) Alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N
kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff,
Meyer dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila pereaksi Meyer terbentuk
endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan
endapan merah sampai jingga dengan pereaksi Dragendorff.
b) Steroid/Triterpenoid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi
yang kering. Ke dalamnya ditambahkan 10 tetes anhidrida asetat dan 3 tetes
asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali
kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif.
c) Fenol/Flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil
alkohol (campuran asam klorida 37 % dan etanol 95 % dengan volume sama)
dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah,
kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.