stem cell dan perannya di masa depan

Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
1
All images in this document is removed due to copyright restriction
TERAPI GEN PADA MANUSIA
dr. Ahmad Aulia Jusuf, AHK, PhD
Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
2009
PENDAHULUAN
Hingga kini kira-kira ada 5000 penyakit bawaan pada manusia yang telah diketahui.1
Akan tetapi dari semua penyakit bawaan tersebut hanya sedikit sekali yang dapat diobati. Pada
penyakit bawaan ini didapatkan adanya defisiensi produk gen tertentu. Kekurangan produk gen
tertentu tersebut umumnya tidak dapat digantikan dengan material yang sama yang berasal dari
luar tubuh. Hanya sedikit yang dapat digantikan dengan material dari luar tubuh, misalnya
pemberian insulin pada penderita diabetes.
Defisiensi ensim1 yang disebabkan oleh adanya defek pada gen umumnya tidak dapat
digantikan dengan ensim dari luar tubuh karena (1) ensim merupakan senyawaan kimia yang
tidak stabil dan mudah rusak; (2) tidak dapat dimasukkan kedalam tubuh ke lokasi kerjanya
dalam bentuk aktif; (3) membran sel bersifat impermeabel terhadap molekul-molekul besar
termasuk ensim.
Pengobatan penyakit herediter umumnya terbatas hanya pada penyakit herediter yang
menyebabkan hilang atau kurangnya metabolit tertentu yang mempunyai molekul yang kecil
yang didistribusikan kejaringan tubuh tertentu melalui sirkulasi darah. Disamping itu pengobatan
penyakit herediter yang menyebabkan terjadinya defek pada ensim juga dilakukan dengan
mengontrol makanan.
Salah satu metoda pengobatan untuk mengatasi penyakit herediter adalah menggunakan
terapi gen (gene therapy).1,2,3,4 Persetujuan prosedur terapi gen masih sangat sulit dan berliku
serta kontroversial.
Aspek biologi terapi gen pada manusia sangat kompleks dan masih
membutuhkan banyak teknik yang hingga kini masih terus dikembangkan.2,3
DEFINISI
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
2
Terapi gen (Gene therapy)1,2,34 adalah suatu proses terapi untuk mengobati penyakit
tententu dengan cara menginsersikan gen yang telah diperbaiki atau gen tertentu kedalam genom
sel-sel atau jaringan individu untuk menggantikan gen yang abnormal yang menyebabkan
terjadinya penyakit tersebut.
PRINSIP TERAPI GEN2,3,4
Ada beberapa prinsip yang digunakan untuk menggantikan atau memperbaiki gen yang rusak
1. Insersi gen yang normal pada lokasi yang tidak spesifik di dalam genom untuk
menggantikan gen yang tidak berfungsi. Prinsip ini merupakan pendekatan umum yang
paling sering digunakan.
2. Gen yang tidak normal dihilangkan dari genom individu dan digantikan oleh gen yang
normal menggunakan cara homologous recombination.
3. Gen yang tidak normal dapat diperbaiki melalui cara selective reverse mutation.
4. Mengubah regulasi (pengaturan) gen tertentu.
JENIS TERAPI GEN
Terapi gen1,2,4 dibedakan atas 2 jenis yaitu
1.
Terapi gen sel somatik (somatic-cell gene therapy) atau gene therapy non hereditable.1,2,4
Pada terapi gen sel somatik, gen yang normal atau telah dimodifikasi ditransfer ke dalam
sel-sel somatik pasien. Terapi gen ini hanya dapat mengatasi penyakit atau kelainan pada
pasien yang bersangkutan. Gen yang telah diperbaiki atau dimodifikasi ini tidak dapat
diturunkan kepada generasi selanjutnya, karena gen yang telah diperbaiki ini hanya ada
pada sel-sel somatik saja dan tidak ada pada sel-sel germinal.
Terapi gen somatik (somatic cell gene therapy) mirp dengan transplantasi sel, jaringan
atau organ. Pada transplantasi organ ketubuh resipien, organ yang ditransplantasikan itu
mengandung gen-gen yang berbeda dengan pasien. Pada terapi gen ini beberapa sel
pasien diambil, diperbaiki diperbaiki gennya dan kemudian dikembalikan ke pasiennya.
Hal ini menyebabkan
terapi gen sel somatik tidak serumit dan tidak seberbahaya
transplantasi organ.
2.
Terapi gen sel germinal (Germ line /hereditable gene therapy)1,2,4
Pada terapi gen sel germinal, gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal akan
diperbaiki dengan cara menginsersikan dan mengintegrasikan gen yang normal atau gen
yang telah dimodifikasi kedalam genom sel-sel germinal. Gen yang telah diinsersikan ini
kemudian akan diturunkan ke generasi berikutnya. Terapi gen sel germinal sangat
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
3
bermanfaat untuk mengatasi penyakit-penyakit genetik dan penyakit-penyakit yang
bersifat herediter. Akan tetapi terapi gen sel germinal hingga kini masih sulit dilakukan
karena alasan tehnis dan etik. Bila gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal ini
diperbaiki dan diturunkan berarti kita telah mengubah genetik seseorang. Hal inilah yang
menjadi kendala untuk melakukan terapi gen sel germinal
METODA TERAPI GEN1,2,4
Metoda terapi gen dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok besar yaitu
1. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen normal kedalam sel-sel sasaran pada pasien
dengan menggunakan vektor biologi yaitu virus.
2. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen yang normal kedalam sel-sel sasaran pada
pasien dengan menggunakan cara non virus. Beberapa cara non virus yang dapat
digunakan adalah Naked DNA, Oligonucleotides, lipoplexes dan polyplexes, hibrid
methods, dendrimers.
Transfer gen menggunakan vektor biologis 1,2,3,4
Vektor biologi yang digunakan untuk membawa gen yang telah diperbaiki adalah virus yang
susunan genetiknya telah diubah sehingga dapat membawa gen manusia yang normal. Virus-virus
ini akan membawa gen yang telah diperbaiki kedalam sel-sel sasaran pada tubuh manusia dengan
cara tertentu dan kemudian berintegrasi pada genom tertentu.4 Untuk mencapai tujuan ini gengen pada virus yang dapat menyebabkan penyakit harus dihilangkan dan diganti dengan gen-gen
yang telah diperbaiki. Sebagai contoh virus A diketahui dapat berreplikasi atau memperbanyak
diri dengan cara menginsersikan gen-gen nya kedalam genom sel-sel host. Virus ini mempunyai
2 jenis gene yaitu gen A dan gene B. Gen A adalah gen yang mengkode protein yang berguna
untuk menginsersikan gen-gen nya kedalam genom sel host (inang). Sebaliknya gen B adalah gen
yang menyebabkan timbulnya penyakit pada host. Gen C adalah gen yang telah diperbaiki dan
akan menggantikan gen B. Dengan dilakukannya reengineering sedemikian rupa sehingga gen C
dapat menggantiksn gen B. Dengan demikian gen A tetap dipertahankan untuk menjalankan
fungsinya.
Adenovirus merupakan virus generasi pertama yang digunakan dalam terapi gen dan
sangat efektif sebagai vektor pembawa transgen.2,4 Virus lain yang dapat digunakan dalam terapi
gen adalah retrovirus, adeno-associated viruses, virus herpes simplex dan lain-lainnya termasuk
virus penyebab HIV.2,4 2 jenis virus yang banyak digunakan sebagai vektor adalah
A. Retrovirus.1,2,3,5,7
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
4
Materi genetik pada virus ini adalah dalam bentuk RNA, sebaliknya materi genetik pada selsel tubuh sasaran adalah dalam bentuk DNA. Ketika retrovirus menginfeksi sel sasaran
(host), selain memasukkan RNA-nya, ia juga akan memasukkan ensim reverse transcriptase
dan integrase kedalam sel sasaran tersebut. RNA ini kemudian akan diubah menjadi DNA
melalui proses reverse transcription menggunakan ensim reverse transcriptase. DNA
kemudian akan ditransfer kedalam inti sel sasaran dan kemudian akan berintegrasi pada
tempat tertentu di genom sel sasaran dengan bantuan ensim integrase. Setelah DNA yang
telah diperbaiki ini terintegrasi pada tempat tertentu di genom sel ssasaran maka dikatakan
bahwa genom sel-sel sasaran (host) ini telah dimodifikasi (Gb-1)
Salah satu masalah yang dapat terjadi pada terapi gen menggunakan retrovirus adalah ensim
integrase dapat menginsersikan materi genetik virus pada tempat yang kurang sesuai
misalnya pada bagian tengah gen-gen endogen pada host, sehingga gen endogen ini tidak
dapat berfungsi, dikenal sebagai insertional mutagenesis. Bila gen-gen virus ini berinsersi
pada gen pengatur fungsi gen lainnya, maka proses pembelahan sel dapat tidak terkendali dan
berubah menjadi sel kanker. Hal ini sekarang dapat diatasi dengan menggunakan ensim Zinc
finger nucleases.5 Keuntungan menggunakan retrovirus adalah transgen yang dimasukkan
bisa di transmisikan kesemua sel yang terinfeksi dan turunanannya, tetapi kerugiannya dapat
menyebabkan terjadinya mutasi genetik yang berbahaya selama tahap pengintegrasian.
Gene Therapy
Gambar-1 Pada terapi gen retrovirus digunakan untuk menggantikan gen yang rusak pada selsel
yang tidak sehat dengan gen baru yang normal. Peneliti menginsersikan gen yang
baik
kedalam RNA retrovirus. Virus ini kemudian dicampur dengan sel-sel host yang
rusak
yang telah diambil dari pasien dan dikultur di laboratorium. Retrovirus kemudian
akan
menginfeksikan gen-gennya kedalam DNA sel-sel yang tidak sehat Sel-sel host yang
mengandung gen-gen yang baru ini kemudian akan dinjeksikan kembali kedalam
pasien
(diunduh dari encarta.msn.com/media_461561269/gene_therapy.html)
B. Adenovirus1,2,3,5,7
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
5
(diunduh dari www.acceleratingfuture.com/michael/blog/?p=455)
Gambar-2 Terapi gen dengan menggunakan adenovirus sebagai vektor
Ketika virus adenovirus meninginfeksi sebuah sel inang, molekul DNA virus tersebut
akan dimasukkan kedalam sel inang tersebut. Materi genetik adenovirus tidak bersatu dengan
materi genetik sel inang. Molekul DNA virus terletak bebas dalam inti sel dan proses
transkripsinya berlangsung secara sendiri. Molekul DNA virus tidak ikut berreplikasi ketika sel
mengalami pembelahan sehingga sel-sel inang hasil pembelahan tidak mengandung DNA virus.
Akibatnya pada terapi gen menggunakan vektor adenovirus membutuhkan pemasukkan kembali
gen-gen yang sudah dimodifikasi ke dalam populasi sel yang baru. Sebaliknya keadaan ini akan
mencegah terjadinya kanker. Gendicine adalah adenovirus yang telah mengandung gen p53 yang
digunakan pada terapi gen untuk mengobati penyakit kanker pada kepala dan leher. Gendicine
sudah diizinkan oleh FDA China untuk digunakan pada manusia pada tahun 2003, sementara itu
FDA Amerika Serikat telah menyetujui advexin, suatu vektor yang serupa dengan Gendicine
untuk digunakan di Amerika serikat pada tahun 2008.
Transfer gen menggunakan cara non virus2,3,4
Disamping menggunakan cara tranfer gen yang diperantarai oleh virus (virus-mediated
gene-delivery systems, ada beberapa metoda lain tanpa menggunakan virus. Metoda non virus ini
mempunyai keuntungan yaitu dapat diproduksi dalam jumlah besar dan immunogenisitas pada sl
inang yang rendah. Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah
1. Naked DNA
Metoda ini merupakan metoda transfeksi non virus yang sangat sederhana. Penelitian
klinik dengan cara menyuntikan naked DNA secara intramuskular menunjukkan sebagian
hasil yang sukses dan sebagian lagi mengalami kegagalan. Ekspresi gen pada metoda
transfeksi ini sangat rendah dibandingkan dengan cara transfeksi lainnya.
2. Oligonukleotida
Oligonukleotida sintetik digunakan untuk menginaktifkan gen-gen yang terlibat dalam
proses penyakit. Beberapa metoda yang dapat digunakan antara lain adalah
a. Menggunakan antisense yang spesifik untuk gen sasasaran yang akan
mengganggu proses transkripsi gen sasaran yang rusak.
b. Menggunakan oligonukleotida rantai ganda (double strand oligonucleotide) yang
akan mengikat faktor-faktor transkripsi yang diperlukan untuk regulasi promoter
gen sasaran.
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
6
3. Lipoplexes and polyplexes
Untuk meningkatkan kwalitas pengangkutan DNA yang baru ke dalam sel, DNA tersebut
harus dilindungi dari kerusakan dan pemasukkannya kedalam sel harus difasilitasi. Untuk
memfasilitasi pemasukan gen ke dalam sel dapat digunakan molekul lipid yang dikenal
sebagai lipoplexes dan polyplexes yang dirancang untuk melindungi DNA dari proses
degradasi selama proses transfeksi. Molekul lipid ini digunakan untuk membungkus
plasmid yang mengandung DNA dalam bentuk seperti micelle atau liposome. Lipoplexes
atau polyplexes yang telah mengandung DNA dikenal sebagai lipoplex. Lipoplex akan
berinteraksi dengan membran sel dan masuk kedalam secara endositosis. Endosome yang
mengandung lipoplex ini kemudian akan lisis dan transgen yang ada di dalamnya akan
dikeluarkan ke dalam sitoplasma sel untu kemudian akan masuk ke dalam inti sel
4. Metoda Hibrid (Hybrid method)
Untuk meningkatkan efisiensi trnasfer transgen dikembangkan metoda hibrid (campuran)
yaitu kombinasi liposome dengan virus influenza atau HIV yang diinaktifkan.
HAMBATAN DALAM TERAPI GEN5,7
Ada beberapa faktor yang menghambat efektivitas penggunaan terapi gen dalam mengatasi
penyakit-penyakit genetik yaitu
1. Masa hidup alami terapi gen yang pendek (Short-lived nature of gene therapy). Agar
terapi gen menjadi efektif , gen yang dimasukkan kedalam sel-sel target harus dapat
berfungsi dan sel-sel yang mengandung gen terapi ini harus dapat hidup lama dan stabil.
2. Respons Imunologik. Adanya stimulus tertentu yang merangsang timbulnya respons
imunologik yang dapat menurunkan efektivitas terapi gen tentu sangat merugikan. Lebih
jauh adanya respon imunologik ini juga akan menyulitkan pengulangan terapi gen pada
pasien.
3. Masalah dengan virus yang berfungsi sebagai vektor. Beberapa masalah yang harus
dipertimbangkan pada penggunaan virus sebagai kendaraan pembawa gen yang telah
diperbaiki adalah toksisitas, reaksi imunologik dan inflamasi, kontrol gen dan jaringan
sasaran. Ketakutan lainnya adalah kemungkinan pulihnya kembali kemampuan virus
untuk menyebabkan penyakit pada manusia
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
7
4. Kelainan gen yang multipel. Terapi gen sulit digunakan untuk mengobati penyakitpenyakit yang disebabkan oleh adanya kombinasi gen-gen yang mengalami kerusakan,
misalnya pada penyakit jantung, tekanan darah tinggi, Alzheimer, artritis dan diabetes.
5. Potensi untuk timbulnya tumor.
Bila DNA diintergrasikan pada tempat yang salah di dalam genom, misalnya pada daerah
tumor suppressor gene, hal ini dapat menyebabkan timbulnya tumor. Hal ini pernah
terjadi pada percobaan klinis pada pasien dengan X-linked severe combined
immunodeficiency (X-SCID) yang diterapi dengan sel punca darah (Hematopoietic stem
cells yang diinfeksi oleh retrovirus yang mengandung transgen. Tiga dari 20 pasien yang
diterapi dengan cara ini kemudian menderita leukemia.6
PRASYARAT TERAPI GEN1
Untuk melakukan terapi gen ada persyaratan yang harus dipenuhi yang dikembangkan
oleh National Institute of Health (NIH). Beberapa prasyarat yang harus dipenuhi agar prosedur
terapi gen dapat di izinkan adalah
1. Gen harus di klon dan diketahui karakteristiknya, sehingga harus tersedia dalam bentuk
murni.
2. Harus ada metoda efektif yang digunakan untuk memasukkan trasngen ke dalam jaringan
atau sel yang dituju
3. Resiko terapi gen harus dievaluasi secara berhati-hati dan dibuat seminimal mungkin
4. Penyakit tidak dapat diobati dengan cara lainnya.
5. Harus ada data penelitian pendahuluan dengan hewan model atau sel manusia dan
hasilnya menunjukkan bahwa usulan terapi gen tersebut adalah efektif.
CONTOH TERAPI GEN1
Terapi gen pada manusia pertama kali dilakukan tahun 1990 pada seorang anak
perempuan berusia 4 tahun yang menderita penyakit ”Adenosine deaminase-deficient severe
combined immunodeficiency disease (ADA-SCID). SCID merupakan penyakit autosomal yang
jarang terjadi yang mengenai system imun. Penderita penyakit ini tidak mempunyai sistem imun
sehingga infeksi yang ringan sekalipun dapat mengakibatkan gangguan yang serius dan sering
berakhir fatal. Beberapa penderita mengalami defisiensi ensim adenosine deaminase (ADA).
Gambar-3. Konstruksi gen untuk terapi gen penyakit ADA-SCID
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
8
Ketiadaan ensim ini menyebabkan kadar deoxyadenosine yang terfosforilasi meningkat mencapai
tingkat toksik dan terakumulasi dalam limfosit T yang pada akhirnya akan membunuh sel
limfosit. Limfosit T akan menstimulasi limfosit B yang akan berkembang menjadi sel plasma
yang menghasilkan antibodi.
Langkah-langkah terapi gen yang dilakukan terdiri atas (Gb-4)
1. pertama kali dirancang konstruksi gen dengan cara memasukkan gen ADA ke vektor
DNA dengan promotor yang kuat.
2. Vector yang mengandung gen ADA ini kemudian diintegrasikan ke dalam virus
retrovirus.
3. Sel darah putih diisolasi dari darah penderita
Gambar-4 Metoda Terapi Gen Pada Penyakit ADA SCID
4. Sel darah putih ini kemudian diinfeksi dengan virus yang mengandung gen ADA
5. Sel darah putih yang telah terinfeksi virus ini kemudian dikembang biakan didalam media
kultur dan di identifikasi sel-sel darah putih yang mengandung transgen.
6. Sel darah putih yang mengekspresikan gen ADA kemudian diinfuskan kedalam sirkulasi
sistemik
7. Sel-sel darah putih ini kemudian menghasilkan produk gen ADA yang akan memperbaiki
sistem imun penderita selama waktu tertentu dan terapi ini harus diulang kembali secara
periodik.
Untuk mengatasi keterbatasan lifespan sel darah putih yang pendek, dapat digunakan sel
punca (stem cells) sumsum tulang yang merupakan sel induk sel darah putih. Stem cells yang
telah dimodifikasi ini akan menghasilkan sel–sel limfosit T yang mengandung transgen ADA
secara terus menerus.
Contoh penggunaan adenovirus dalam terapi gen adalah terapi gen yang dipakai untuk
mengobati cystic fibrosis (CF). Pada terapi gen ini virus adenovirus yang membawa gen CF
diinhalasi oleh pasien, dengan harapan sel-sel paru akan terinfeksi dan mensintesa produk gen CF
untuk mengatasi simptom dan gejala penyakit. Akan tetapi kuatnya reaksi imunologik tubuh
menyebabkan terapi gen menjadi tidak efektif. Sel-sel yang terinfeksi virus dan mengandung
transgen akan mati dan tidak bisa memperbanyak diri sehingga mengakibatkan ekspresikan gen
akan menurun. Untuk ini transgen lebih baik bila dibawa oleh virus retrovirus.
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009
Ahmad Aulia Jusuf/Bagian Histologi FKUI
9
RUJUKAN
1. Snustad D. Peter and Simmons M.J. : Human gene therapy in Principles of genetics, 4 th
Ed, 2006: 499-503
2. Gene Therapy diunduh dari "http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_therapy"
3. ^Scott T., Gene Therapy Breakthrough, diunduh dari www.unitedspinal.org. February
26th, 2008
4. What is gene therapy diunduh dari www.ornl.gov/sci/techresources/Human.../genetherapy.shtml
5. Durai S, Mani M, Kandavelou K, Wu J, Porteus MH, Chandrasegaran S (2005). "Zinc
finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant
and mammalian cells". Nucleic Acids Res. 33 (18): 5978–90.
6. Woods NB, Bottero V, Schmidt M, von Kalle C, Verma IM (Apr 2006). "Gene
therapy: therapeutic gene causing lymphoma". Nature 440 (7088): 1123.
7. Gene therapy/RNA interferences, diunduh dari www.acceleratingfuture.com
8. Cavazzana-Calvo M, Thrasher A, Mavilio F (Feb 2004). "The future of gene
therapy". Nature 427 (6977): 779–81
9. Gardlík R, Pálffy R, Hodosy J, Lukács J, Turna J, Celec P (Apr 2005). "Vectors
and delivery systems in gene therapy". Med Sci Monit. 11 (4): RA110–21.
10. Salmons B, Günzburg WH (Apr 1993). "Targeting of retroviral vectors for gene
therapy". Hum Gene Ther. 4 (2): 129–41.
Terapi Gen pada Manusia/ 09 Nopember 2009