T E K N I K , M E TO D E , APLIKASI B I OT E K N O LO G I K E S E H ATA N MORDERN By :Yeni Dina Puspasari METODE TRANSFER ASAM NUKLEAT SEBAGAI DASAR TERAPI GEN Hardiany, N.S. 2016. Metode Transfer Asam Nukleat Sebagai Dasar Terapi Gen. eJKI. 4(3): 204-210. PENDAHULUAN • Terapi gen yaitu menggunakan gen sebagai obat yang dasarnya memperbaiki kerusakan gen tersebut melalui: insersi/memasukkan gen yang normal di lokasi gen dalam genom yang nonspesifik untuk mengganti gen yang nonfungsional, menukar gen abnormal dengan gen rekombinan homolog yang normal, memperbaiki gen abnormal melalui mutasi reverse selektif, mengubah regulasi pengaktifan dari gen tertentu. • Terapi gen mempunyai potensi terapi untuk penyakit yang diturunkan secara resesif seperti cystic fibrosis, hemofilia, muscular dystrophy, sickle cell anemia serta penyakit yang didapat seperti kanker dan infeksi virus tertentu. • Pada terapi gen, pengiriman gen dapat dilakukan dengan pemindahan asam nukleat menggunakan metode transfeksi non viral (memindahkan asam nukleat menggunakan cara fisika dan kimiawi) dan viral/transduksi (memindahkan asam nukleat menggunakan virus, virus pertama yang digunakan sebagi vektor pada terapi gen adalah retrovirus.). BERBAGAI METODE TRANSFEKSI (PEMINDAHAN ASAM NUKLEAT) Tranfeksi menggunakan reagen kimia Tranfeksi dengan lipid kationik Tranfeksi dengan metode fisik Transfeksi dengan virus (transduksi) TRANSFEKSI MENGGUNAKAN REAGEN KIMIA • Reagen kimia yang pertama kali digunakan untuk transfer asam nukleat ke dalam kultur sel mamalia yaitu (diethylaminoethyl) DEAEdextran. • Muatan positif berlebihan yang ditimbulkan oleh polimer DEAEdextran dalam kompleks polimer DNA menyebabkan kompleks tersebut dapat mendekati membran sel yang bermuatan negatif. • Kationik polimer sintetik lain yang telah digunakan untuk pemindahan DNA ke dalam sel adalah polybrene, polyethyleneimine dan dendrimers. • Transfeksi dengan dapat menggunakan metode kalsium fosfat. Kalsium fosfat memberikan perlindungan terhadap serangan nuklease serum dan intraseluler namun, ko-presipitasi kalsium fosfat memiliki variabilitas dan tidak cocok untuk transfeksi in vivo pada hewan Kalsium Fosfat • Teknik pengiriman asam nukleat dengan liposom dapat digunakan untuk transfer DNA in vivo dan RNA baik pada hewan maupun manusia. Lipid kationik sering dicampur dengan lipid bermuatan netral seperti L-dioleolyl fosfatidiletanolamin (DOPE) yang dapat memperkuat kemampuan transfer gen lipid kationik. • Bagian kationik molekul lipid bergabung dengan muatan negatif asam nukleat, sehingga menghasilkan kompleks asam nukleat-liposom yang kompak sebagai akibat interaksi elektrostatis antara muatan negatif asam nukleat dan muatan positif dari lipid sintesis. • Sel yang ditransfeksi dengan teknik liposom dapat digunakan untuk mempelajari ekspresi sementara maupun transfeksi jangka panjang yang bergantung pada integrasi DNA ke dalam kromosom atau episomal. TRANSFEKSI DENGAN LIPID KATIONIK • • • Metode fisik yang digunakan yaitu mikroinjeksi. Metode mikroinjeksi telah digunakan untuk mengirim DNA ke dalam stem sel embrionik yang digunakan untuk menghasilkan organisme transgenik dan untuk memasukkan RNA antisense ke dalam C. Selain itu terdapat teknik elektroporasi, mekanismenya yaitu menggunakan gelombang listrik untuk mengganggu membran sel dan membentuk lubang sementara yang menyebabkan masuknya asam nukleat ke dalam sel. Metode fisik lainnya untuk transfer gen adalah pengiriman partikel biolistik yang dikenal juga sebagai particle bombardment yang mengandalkan pengiriman asam nukleat dengan kecepatan tinggi pada mikroproyektil terhadap sel resepien melalui penetrasi membran. TRANSFEKSI METODE FISIK TRANSFEKSI DENGAN VIRUS (TRANSDUKSI) • Pada metode ini terjadi integrasi virus dengan DNA genom host sehingga dihasilkan ekspresi gen yang stabil. Transduksi memiliki kelemahan dalam imunogenitas dan sitotoksisitas. Pengiriman virus sebagi vektor dapat menyebabkan reaksi inflamasi pada sel dan dapat menyebabkan mutasi. • Integrasi virus ke dalam genom host secara acak mungkin dapat merusak tumor suppressor gen, mengaktifkan onkogen atau mengganggu gen yang penting. • Beberapa virus yang digunakan sebagi vektor pada terapi gen adalah retrovirus, adenovirus, AAV, dan HSV. DIAGNOSIS MOLEKULER VIRUS DENGUE Nugraheni, E dan Ike Sulistyowati. 2016. Diagnosisi Molekuler Virus Dengue. JK Unila. 1(2): 385-392 PENDAHULUAN • Dengue merupakan suatu penyakit (virus) yang ditransmisikan oleh nyamuk yang hidup didaerah tropis dan subtropis yang dapat menyebabkan demam dengue. • Demam berdarah dengue dapat berbahaya bagi penderita. Hal tersebut karena dengue dapat menyebabkan dua tipe infeksi yaitu primer (demam dengue yang akan hilang setelah 7 hari akibat respon imun kompleks) dan sekunder (DBD/menyebabkan sindrom syok dengue). • Untuk mencegah atau mengurangi kematian akibat virus dengue yang menyebabkan DBD dilakukan diagnosis lebih awal dengan menggunakan beberapa metode diagnostik molekuler. • Terdapat motede diagnosis virus dengue terbaru yaitu pemeriksaan molekular berbasis genomic virus RNA dengan menggunakan Reverse Transcription PCR (RT PCR), metode modikasi RTPCR, real time PCR dan metode amplifikasi isothermal RT-PCR ( REVERSE TRANSKRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION ) • Mulai dikembangkan pada tahun 1990an, pemeriksaan ini lebih sensitif dibandingkan dengan jenis pemeriksaan lainnya. • Pemeriksaan ini tergantung pada target genome yang digunakan oleh primer, sehingga produk amplifikasinya dapat terdeteksi. • Pemeriksaan ini memiliki 3 langkah dasar yaitu : ekstraksi asam nukleat, purifikasi dan amplifikasi asam nukelat. Setelah itu dilakukan deteksi dan karakterisasi produk amplifikasi. RT-PCR terbagi atas one step and two step RT-PCR. Tahapan RT-PCR yaitu : • Manajemen sampel (virus yang akan langsung diperiksa disimpan pada suhu 4°C atau -8°C untuk pemeriksaan < 24 jam, apabila > 24 jam dilakukan penyimpanan sampel -70°C), • Ekstrasi RNA (RNA diekstrasi dan disimpan pada suhu 70°C), • RT PCR (mengubah RNA menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transkriptase, kemudian denaturasi (suhu 94°C selama 15 menit), annealing (suhu 58°C 1 menit), dan elongasi (58°C selama 1 menit), • Deteksi dan karakterisasi (hasil amplifikasi dilakukan elektroforesis pada gel agarose 2% dengan menggunakan ethidium bromida dan diperiksa di UV transluminator untuk dibandingkan dengan marker). REAL TIME PCR • Real time PCR merupakan langkah pemeriksaan yang menggunakan sistem kuantitatif RNA virus dengan menggunakan primer pasangannya dan probe yang spesifik pada setiap serotipe dengue virus, menggunakan probe fuorosense sehingga tidak membutuhkan elektroforesis. • Metode ini sama dengan RT PCR namun yang membedakannya disini adalah menggunakan primer pasangannya dan probe yang spesifik pada setiap serotipe dengue virus dan menggunakan probe fuorosense sehingga tidak membutuhkan elektroforesis lagi. • Real-time RT-PCR merupakan metode ini lebih spesifik dan tidak terjadi reaksi silang antara sesama flavivirus ataupun dengan alfaviridae. PRODUKSI DAN APLIKASI VAKSIN DNA STREPTOCOCCUS INIAE UNTUK MENINGKATKAN IMUNITAS NILA ( OREOCHROMIS NILOTICUS ) Sutanti, Novi Megawati, Sugiyo H. Pranoto & Ratu Siti Alia. 2016. Produksi dan Aplikasi Vaksin DNA Streptococcus iniae untuk Meningkatkan Imunitas Nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Perikanan Universitas Gadjah Mada. 18(2): 61-66. PENDAHULUAN • Vaksin DNA merupakan vaksin yang diperoleh dari sekuen DNA suatu organisme dengan menggunakan metode tertentu. • Vaksin DNA mempunyai keunggulan dibanding vaksin konvensional yaitu dapat merangsang respon imun humoral dan selular (cell mediated) melalui inokulasi DNA yang mengandung sekuen plasmid DNA yang bersifat imunogenik. • Salah satu potensi pengembangan vaksin DNA bakteri pada bidang perikanan yang dapat diproduksi melalui teknologi DNA rekombinan adalah vaksin DNA golongan Streptococcus, yaitu Streptococcus iniae. • Penyakit streptococcosis merupakan penyakit berspektrum luas karena dapat menyerang lebih dari 30 spesies ikan air tawar seperti ikan nila dan gurame maupun pada ikan air laut seperti ikan kakap serta ikan kerapu. • Penelitian ini bertujuan untuk produksi dan aplikasi vaksin DNA Streptococcus iniae untuk meningkatkan imunitas ikan nila. TAHAP PRODUKSI VAKSIN Isolasi plasmid dilakukan menggunakan plasmid mini extraction kit (GeneAid) dengan tahapan sebagai berikut: • Kultur bakteri pada media LB umur 16 - 18 jam sebanyak 1,5 mL disentrifugasi pada 12.000 rpm, 4 oC, 2 menit. Sebanyak 250 µL buffer RP ditambahkan pada pelet bakteri kemudian dihomogenkan. • Buffer LN sebanyak 250 µL ditambahkan dan tabung mikro dibolak-balik 3 - 4x. Buffer NP sebanyak 350 µL ditambahkan dan tabung mikro dibolak-balik 3 - 4x kembali. • Kemudian dilakukan sentrifugasi 13.000 rpm, 4 oC, 10 menit. • Supernatan difiltrasi menggunakan binding column, dilakukan pencucian menggunakan 500 µL DP buffer dan sentrifugasi 13.000 rpm, 4 oC, 1 menit. • Penambahan 700 µL buffer WP ke dalam kolom, sentrifugasi dan supernatan dibuang. • Sentrifugasi kembali untuk menghilangkan sisa buffer WP dan kolom dipindahkan ke tabung mikro yang baru. • Sebanyak 50 µL buffer EP ditambahkan untuk mengelusi plasmid DNA. • Plasmid DNA divisualisasi menggunakan agarose gel 0,8%. Konsentrasi DNA diukur menggunakan mesin Nanodrop. • Hasil isolasi plasmid kemudian diverifikasi dengan metode PCR. Metode PCR (Polimerase Chain Reaction) menggunakan primer spesifik Fstrep untuk primer forward dan Rstrep untuk primer reverse dengan target berukuran 1713 bp. Komposisi PCR adalah 1µL DNA genom bakteri, 1x buffer taq, 2mM dNTP mix, 20 pmol primer forward, 20 pmol primer reverse, 2U enzim dream taq polimerase (Fermentas), dan ddH2O dengan volume reaksi 10 µl. • PCR dilakukan pada kondisi pra PCR 95°C 5 menit • Denaturasi 95°C 30 detik • Penempelan primer pada 42,5°C, 30 detik • Pemanjangan 72°C, 1 menit, dengan 30 siklus • Pasca PCR pada 72°C 5 menit, diikuti dengan 15°C selama 10 menit. KOMPARASI ANTARA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DAN LOOPMEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (L AMP) DAL AM DIAGNOSIS MOLEKULER Feranisa, A. 2016. Komparasi Antara Polymerase Chain Reaction (PCR) Dan Loopmediated Isothermal Amplification (Lamp) Dalam Diagnosis Molekuler. ODONTO Dental Jurnal. 3(2): 154-151. PENDAHULUAN • Diagnosis molekuler merupakan metode diagnosis yang bertujuan untuk memahami mekanisme molekuler suatu penyakit pada setiap individu pasien. • Pengobatan akan lebih tepat sasaran jika mengacu pada diagnosis molekuler. • Beberapa metode yang digunakan dalam diagnosis molekuler yaitu PCR dan LAMP. • Peranan diagnostik molekuler dalam personalized medicine mencakup aspekaspek berikut ini : 1. Deteksi dini dan pemilihan metode pengobatan yang aman dan efektif berdasarkan diagnosik molekuler 2. Integrasi antara diagnostik molekuler dengan terapi 3. Pemantauan terapi serta penentuan prognosi PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Proses dalam PCR : • Teknik ini mampu melipatnggandakan untai DNA sampel sehingga dapat dianalisis dengan lebih jelas. • Kemudian, metode ini dikembangkan untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA Denaturasi Annealing Elongasi Elektroforesis LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) Mekanisme LAMP : • Metode amplifikasi asam nukleat berdasarkan pada prinsip aktivitas pemindahan untai asam nukleat yang mengamplifikasi beberapa salinan DNA target dengan spesifisitas, efisiensi, dan kecepatan tinggi dalam kondisi isotermal. • Reaksi siklus pada LAMP dapat menghasilkan akumulasi salinan DNA target sebanyak 109 hingga 1010 kali lipat dalam kurang dari satu jam. Produksi material awal Siklus amplifikasi Resiklus Enzim polimerase DNA pada LAMP menggunakan Bst polimerase. Enzim ini diproduksi dari bakteri Bacillus stearothermophilus. B. stearothermophilus merupakan bakteri thermofilik. Enzim Bst DNA polimerase dapat mencapai aktivitas optimal pada suhu 65ºC Berbeda dengan PCR, LAMP tidak harus menggunakan proses elektroforesis atau proses tertentu untuk mengamati reaksi positif hasil identifikasinya Dapat menggunakan : 1. Penambahan pewarna SYBR Green I ke dalam tabung reaksi LAMP 2. Penambahan warna dengan SYBR Green maupun picogreen dapat diamati menggunakan Real Time PCR atau alat fluorometer sejenis 3. Penambahan hydroxyl-napthol blue, sebagai chelating agent yang menghasilkan warna, diamati dengan spektrofotometer. PERFORMA TES CEPAT MOLEKULER DALAM DIAGNOSA TUBERKULOSIS DI BALAI BESAR KESEHATAN PARU MASYARAKAT MAKASSAR Naim, N., Novi U.D. 2018. Performa Tes Cepat Molekuler Dalam Diagnosa Tuberkulosis Di Balai Besar Kesehatan Paru Masyarakat Makassar. Jurnal Medis Analisis Kesehatan. 9(2): 113-122. PENDAHULUAN • Mycobacterium tuberculosis merupakan salah satu bakteri patogen penyebab penyakit tuberkulosis. • Tes cepat molekuler merupakan metode penemuan terbaru untuk diagnosis TB berdasarkan pemeriksaan molekuler yang menggunakan metode Real Time Polymerase Chain Reaction Assay (RT-PCR) semi kuantitatif yang menargetkan wilayah hotspot gen rpoB pada Mycobacterium tuberculosis. • Metode tes cepat molekuler terus dikembangkan dan akan dilakukan untuk diagnosis tuberkulosis dimasa yang akan datang. Semua penderita suspect TB-MDR dilakukan pemeriksaan MTB menggunakan metode tes cepat molekuler, metode BTA dekontaminasi, dan metode kultur dengan menggunakan media Lownstein Jensen sebagai Gold Standar. • Spesimen sputum yang sudah dikumpulkan dan dimasukkan kedalam wadah lalu dilakukan pemeriksaan BTA dekontaminasi metode kubica • Tes cepat molekuler dengan menambahkan buffer kemudian diinkubasi selama 15 menit lalu diambil dengan pipet khusus dan dimasukkan kedalam cartridge • Setelah itu dimasukkan kedalam alat GeneXpert MTB/RIF. • Sputum diproses dan diperiksa oleh GeneXpert MTB/RIF secara otomatis, hasilnya diperoleh setelah ± 2 jam. • Kemudian sisa sputum yang tidak digunakan di masukkan kedalam tabung falcon lalu ditambahkan dengan NaOH 4% dan PBS (Phospat Buffer Sulfat) lalu di sentrifugasi. • Dari hasil sentrifugasi, sputum diinokulasikan untuk penanaman pada media Loweinstein Jensen lalu diinkubasi pada suhu 37°C. • Hasil penanaman di media Loweinstein Jensen diperoleh setelah 6-8 minggu. • Kemudian dari hasil kultur yang positif dilakukan uji resistensi menggunakan metode gold standar proporsi
