Uploaded by User52928

Teknik, metode, aplikasi bioteknologi kesehatan mordern

advertisement
T E K N I K , M E TO D E ,
APLIKASI
B I OT E K N O LO G I
K E S E H ATA N
MORDERN
By :Yeni Dina Puspasari
METODE TRANSFER ASAM NUKLEAT
SEBAGAI DASAR TERAPI GEN
Hardiany, N.S. 2016. Metode Transfer
Asam Nukleat Sebagai Dasar Terapi Gen.
eJKI. 4(3): 204-210.
PENDAHULUAN
• Terapi gen yaitu menggunakan gen sebagai obat yang dasarnya memperbaiki kerusakan gen tersebut
melalui: insersi/memasukkan gen yang normal di lokasi gen dalam genom yang nonspesifik untuk
mengganti gen yang nonfungsional, menukar gen abnormal dengan gen rekombinan homolog yang
normal, memperbaiki gen abnormal melalui mutasi reverse selektif, mengubah regulasi pengaktifan
dari gen tertentu.
• Terapi gen mempunyai potensi terapi untuk penyakit yang diturunkan secara resesif seperti cystic
fibrosis, hemofilia, muscular dystrophy, sickle cell anemia serta penyakit yang didapat seperti kanker dan
infeksi virus tertentu.
• Pada terapi gen, pengiriman gen dapat dilakukan dengan pemindahan asam nukleat menggunakan
metode transfeksi non viral (memindahkan asam nukleat menggunakan cara fisika dan kimiawi) dan
viral/transduksi (memindahkan asam nukleat menggunakan virus, virus pertama yang digunakan
sebagi vektor pada terapi gen adalah retrovirus.).
BERBAGAI METODE TRANSFEKSI
(PEMINDAHAN ASAM NUKLEAT)
Tranfeksi menggunakan reagen kimia
Tranfeksi dengan lipid kationik
Tranfeksi dengan metode fisik
Transfeksi dengan virus (transduksi)
TRANSFEKSI MENGGUNAKAN
REAGEN KIMIA
• Reagen kimia yang pertama kali digunakan untuk transfer asam
nukleat ke dalam kultur sel mamalia yaitu (diethylaminoethyl)
DEAEdextran.
• Muatan positif berlebihan yang ditimbulkan oleh polimer
DEAEdextran dalam kompleks polimer DNA menyebabkan
kompleks tersebut dapat mendekati membran sel yang
bermuatan negatif.
• Kationik polimer sintetik lain yang telah digunakan untuk
pemindahan DNA ke dalam sel adalah polybrene,
polyethyleneimine dan dendrimers.
• Transfeksi dengan dapat menggunakan metode kalsium fosfat.
Kalsium fosfat memberikan perlindungan terhadap serangan
nuklease serum dan intraseluler namun, ko-presipitasi kalsium
fosfat memiliki variabilitas dan tidak cocok untuk transfeksi in
vivo pada hewan
Kalsium Fosfat
• Teknik pengiriman asam nukleat dengan liposom
dapat digunakan untuk transfer DNA in vivo dan
RNA baik pada hewan maupun manusia. Lipid
kationik sering dicampur dengan lipid bermuatan
netral seperti L-dioleolyl fosfatidiletanolamin (DOPE)
yang dapat memperkuat kemampuan transfer gen
lipid kationik.
• Bagian kationik molekul lipid bergabung dengan
muatan negatif asam nukleat, sehingga menghasilkan
kompleks asam nukleat-liposom yang kompak sebagai
akibat interaksi elektrostatis antara muatan negatif
asam nukleat dan muatan positif dari lipid sintesis.
• Sel yang ditransfeksi dengan teknik liposom dapat
digunakan untuk mempelajari ekspresi sementara
maupun transfeksi jangka panjang yang bergantung
pada integrasi DNA ke dalam kromosom atau
episomal.
TRANSFEKSI DENGAN
LIPID KATIONIK
•
•
•
Metode fisik yang digunakan yaitu
mikroinjeksi. Metode mikroinjeksi telah
digunakan untuk mengirim DNA ke dalam
stem sel embrionik yang digunakan untuk
menghasilkan organisme transgenik dan
untuk memasukkan RNA antisense ke
dalam C.
Selain itu terdapat teknik elektroporasi,
mekanismenya yaitu menggunakan
gelombang listrik untuk mengganggu
membran sel dan membentuk lubang
sementara yang menyebabkan masuknya
asam nukleat ke dalam sel.
Metode fisik lainnya untuk transfer gen
adalah pengiriman partikel biolistik yang
dikenal juga sebagai particle bombardment
yang mengandalkan pengiriman asam
nukleat dengan kecepatan tinggi pada
mikroproyektil terhadap sel resepien
melalui penetrasi membran.
TRANSFEKSI METODE
FISIK
TRANSFEKSI DENGAN
VIRUS (TRANSDUKSI)
• Pada metode ini terjadi integrasi virus
dengan DNA genom host sehingga
dihasilkan ekspresi gen yang stabil.
Transduksi memiliki kelemahan dalam
imunogenitas dan sitotoksisitas.
Pengiriman virus sebagi vektor dapat
menyebabkan reaksi inflamasi pada sel
dan dapat menyebabkan mutasi.
• Integrasi virus ke dalam genom host
secara acak mungkin dapat merusak
tumor suppressor gen, mengaktifkan
onkogen atau mengganggu gen yang
penting.
• Beberapa virus yang digunakan sebagi
vektor pada terapi gen adalah
retrovirus, adenovirus, AAV, dan HSV.
DIAGNOSIS MOLEKULER VIRUS DENGUE
Nugraheni, E dan Ike Sulistyowati.
2016. Diagnosisi Molekuler Virus
Dengue. JK Unila. 1(2): 385-392
PENDAHULUAN
• Dengue merupakan suatu penyakit (virus) yang ditransmisikan oleh nyamuk yang hidup
didaerah tropis dan subtropis yang dapat menyebabkan demam dengue.
• Demam berdarah dengue dapat berbahaya bagi penderita. Hal tersebut karena dengue dapat
menyebabkan dua tipe infeksi yaitu primer (demam dengue yang akan hilang setelah 7 hari
akibat respon imun kompleks) dan sekunder (DBD/menyebabkan sindrom syok dengue).
• Untuk mencegah atau mengurangi kematian akibat virus dengue yang menyebabkan DBD
dilakukan diagnosis lebih awal dengan menggunakan beberapa metode diagnostik molekuler.
• Terdapat motede diagnosis virus dengue terbaru yaitu pemeriksaan molekular berbasis
genomic virus RNA dengan menggunakan Reverse Transcription PCR (RT PCR), metode
modikasi RTPCR, real time PCR dan metode amplifikasi isothermal
RT-PCR ( REVERSE TRANSKRIPTASE POLYMERASE CHAIN
REACTION )
• Mulai dikembangkan pada tahun 1990an,
pemeriksaan ini lebih sensitif dibandingkan dengan
jenis pemeriksaan lainnya.
• Pemeriksaan ini tergantung pada target genome
yang digunakan oleh primer, sehingga produk
amplifikasinya dapat terdeteksi.
• Pemeriksaan ini memiliki 3 langkah dasar yaitu :
ekstraksi asam nukleat, purifikasi dan amplifikasi
asam nukelat. Setelah itu dilakukan deteksi dan
karakterisasi produk amplifikasi. RT-PCR terbagi
atas one step and two step RT-PCR.
Tahapan RT-PCR yaitu :
• Manajemen sampel (virus yang akan langsung
diperiksa disimpan pada suhu 4°C atau -8°C untuk
pemeriksaan < 24 jam, apabila > 24 jam dilakukan
penyimpanan sampel -70°C),
• Ekstrasi RNA (RNA diekstrasi dan disimpan pada
suhu 70°C),
• RT PCR (mengubah RNA menjadi cDNA
menggunakan enzim reverse transkriptase,
kemudian denaturasi (suhu 94°C selama 15 menit),
annealing (suhu 58°C 1 menit), dan elongasi (58°C
selama 1 menit),
• Deteksi dan karakterisasi (hasil amplifikasi
dilakukan elektroforesis pada gel agarose 2%
dengan menggunakan ethidium bromida dan
diperiksa di UV transluminator untuk dibandingkan
dengan marker).
REAL TIME PCR
• Real time PCR merupakan langkah
pemeriksaan yang menggunakan sistem
kuantitatif RNA virus dengan menggunakan
primer pasangannya dan probe yang spesifik
pada setiap serotipe dengue virus,
menggunakan probe fuorosense sehingga
tidak membutuhkan elektroforesis.
• Metode ini sama dengan RT PCR namun yang
membedakannya disini adalah menggunakan
primer pasangannya dan probe yang spesifik
pada setiap serotipe dengue virus dan
menggunakan probe fuorosense sehingga
tidak membutuhkan elektroforesis lagi.
• Real-time RT-PCR merupakan metode ini lebih
spesifik dan tidak terjadi reaksi silang antara
sesama flavivirus ataupun dengan alfaviridae.
PRODUKSI DAN APLIKASI VAKSIN DNA
STREPTOCOCCUS INIAE UNTUK MENINGKATKAN
IMUNITAS NILA ( OREOCHROMIS NILOTICUS )
Sutanti, Novi Megawati, Sugiyo H. Pranoto & Ratu
Siti Alia. 2016. Produksi dan Aplikasi Vaksin DNA
Streptococcus iniae untuk Meningkatkan Imunitas
Nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Perikanan
Universitas Gadjah Mada. 18(2): 61-66.
PENDAHULUAN
• Vaksin DNA merupakan vaksin yang diperoleh dari sekuen DNA suatu organisme dengan
menggunakan metode tertentu.
• Vaksin DNA mempunyai keunggulan dibanding vaksin konvensional yaitu dapat merangsang respon
imun humoral dan selular (cell mediated) melalui inokulasi DNA yang mengandung sekuen plasmid
DNA yang bersifat imunogenik.
• Salah satu potensi pengembangan vaksin DNA bakteri pada bidang perikanan yang dapat
diproduksi melalui teknologi DNA rekombinan adalah vaksin DNA golongan Streptococcus, yaitu
Streptococcus iniae.
• Penyakit streptococcosis merupakan penyakit berspektrum luas karena dapat menyerang lebih dari
30 spesies ikan air tawar seperti ikan nila dan gurame maupun pada ikan air laut seperti ikan
kakap serta ikan kerapu.
• Penelitian ini bertujuan untuk produksi dan aplikasi vaksin DNA Streptococcus iniae untuk
meningkatkan imunitas ikan nila.
TAHAP PRODUKSI VAKSIN
Isolasi plasmid dilakukan menggunakan plasmid mini extraction kit (GeneAid) dengan tahapan
sebagai berikut:
• Kultur bakteri pada media LB umur 16 - 18 jam sebanyak 1,5 mL disentrifugasi pada 12.000
rpm, 4 oC, 2 menit. Sebanyak 250 µL buffer RP ditambahkan pada pelet bakteri kemudian
dihomogenkan.
• Buffer LN sebanyak 250 µL ditambahkan dan tabung mikro dibolak-balik 3 - 4x. Buffer NP
sebanyak 350 µL ditambahkan dan tabung mikro dibolak-balik 3 - 4x kembali.
• Kemudian dilakukan sentrifugasi 13.000 rpm, 4 oC, 10 menit.
• Supernatan difiltrasi menggunakan binding column, dilakukan pencucian menggunakan 500 µL
DP buffer dan sentrifugasi 13.000 rpm, 4 oC, 1 menit.
• Penambahan 700 µL buffer WP ke dalam kolom, sentrifugasi dan supernatan dibuang.
• Sentrifugasi kembali untuk menghilangkan sisa buffer WP dan kolom dipindahkan ke tabung
mikro yang baru.
• Sebanyak 50 µL buffer EP ditambahkan untuk mengelusi plasmid DNA.
• Plasmid DNA divisualisasi menggunakan agarose gel 0,8%. Konsentrasi DNA diukur
menggunakan mesin Nanodrop.
• Hasil isolasi plasmid kemudian diverifikasi dengan metode PCR.
Metode PCR (Polimerase Chain Reaction) menggunakan primer spesifik Fstrep
untuk primer forward dan Rstrep untuk primer reverse dengan target
berukuran 1713 bp. Komposisi PCR adalah 1µL DNA genom bakteri, 1x buffer
taq, 2mM dNTP mix, 20 pmol primer forward, 20 pmol primer reverse, 2U
enzim dream taq polimerase (Fermentas), dan ddH2O dengan volume reaksi
10 µl.
• PCR dilakukan pada kondisi pra PCR 95°C 5 menit
• Denaturasi 95°C 30 detik
• Penempelan primer pada 42,5°C, 30 detik
• Pemanjangan 72°C, 1 menit, dengan 30 siklus
• Pasca PCR pada 72°C 5 menit, diikuti dengan 15°C selama 10 menit.
KOMPARASI ANTARA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DAN
LOOPMEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (L AMP) DAL AM
DIAGNOSIS MOLEKULER
Feranisa, A. 2016. Komparasi
Antara Polymerase Chain
Reaction (PCR) Dan
Loopmediated Isothermal
Amplification (Lamp) Dalam
Diagnosis Molekuler. ODONTO
Dental Jurnal. 3(2): 154-151.
PENDAHULUAN
• Diagnosis molekuler merupakan metode diagnosis yang bertujuan untuk memahami
mekanisme molekuler suatu penyakit pada setiap individu pasien.
• Pengobatan akan lebih tepat sasaran jika mengacu pada diagnosis molekuler.
• Beberapa metode yang digunakan dalam diagnosis molekuler yaitu PCR dan LAMP.
• Peranan diagnostik molekuler dalam personalized medicine mencakup aspekaspek berikut ini :
1.
Deteksi dini dan pemilihan metode pengobatan yang aman dan efektif berdasarkan
diagnosik molekuler
2.
Integrasi antara diagnostik molekuler dengan terapi
3.
Pemantauan terapi serta penentuan prognosi
PCR (POLYMERASE
CHAIN REACTION)
Proses dalam PCR :
• Teknik ini mampu melipatnggandakan untai
DNA sampel sehingga dapat dianalisis
dengan lebih jelas.
• Kemudian, metode ini dikembangkan untuk
melipatgandakan dan melakukan kuantitasi
molekul mRNA
Denaturasi
Annealing
Elongasi
Elektroforesis
LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL
AMPLIFICATION)
Mekanisme LAMP :
• Metode amplifikasi asam nukleat
berdasarkan pada prinsip aktivitas
pemindahan untai asam nukleat yang
mengamplifikasi beberapa salinan DNA
target dengan spesifisitas, efisiensi, dan
kecepatan tinggi dalam kondisi isotermal.
• Reaksi siklus pada LAMP dapat
menghasilkan akumulasi salinan DNA target
sebanyak 109 hingga 1010 kali lipat dalam
kurang dari satu jam.
Produksi material awal
Siklus amplifikasi
Resiklus
Enzim polimerase DNA pada LAMP
menggunakan Bst polimerase. Enzim ini
diproduksi dari bakteri Bacillus
stearothermophilus. B. stearothermophilus
merupakan bakteri thermofilik. Enzim Bst
DNA polimerase dapat mencapai aktivitas
optimal pada suhu 65ºC
Berbeda dengan PCR, LAMP tidak harus menggunakan proses
elektroforesis atau proses tertentu untuk mengamati reaksi
positif hasil identifikasinya Dapat menggunakan :
1. Penambahan pewarna SYBR Green I ke dalam tabung reaksi
LAMP
2. Penambahan warna dengan SYBR Green maupun picogreen
dapat diamati menggunakan Real Time PCR atau alat
fluorometer sejenis
3. Penambahan hydroxyl-napthol blue, sebagai chelating agent
yang menghasilkan warna, diamati dengan spektrofotometer.
PERFORMA TES CEPAT MOLEKULER DALAM DIAGNOSA
TUBERKULOSIS DI BALAI BESAR KESEHATAN PARU
MASYARAKAT MAKASSAR
Naim, N., Novi U.D. 2018. Performa Tes
Cepat Molekuler Dalam Diagnosa
Tuberkulosis Di Balai Besar Kesehatan
Paru Masyarakat Makassar. Jurnal Medis
Analisis Kesehatan. 9(2): 113-122.
PENDAHULUAN
• Mycobacterium tuberculosis merupakan salah satu bakteri patogen penyebab penyakit
tuberkulosis.
• Tes cepat molekuler merupakan metode penemuan terbaru untuk diagnosis TB berdasarkan
pemeriksaan molekuler yang menggunakan metode Real Time Polymerase Chain Reaction
Assay (RT-PCR) semi kuantitatif yang menargetkan wilayah hotspot gen rpoB pada
Mycobacterium tuberculosis.
• Metode tes cepat molekuler terus dikembangkan dan akan dilakukan untuk diagnosis
tuberkulosis dimasa yang akan datang.
Semua penderita suspect TB-MDR dilakukan pemeriksaan MTB menggunakan metode tes cepat
molekuler, metode BTA dekontaminasi, dan metode kultur dengan menggunakan media Lownstein
Jensen sebagai Gold Standar.
• Spesimen sputum yang sudah dikumpulkan dan dimasukkan kedalam wadah lalu dilakukan
pemeriksaan BTA dekontaminasi metode kubica
• Tes cepat molekuler dengan menambahkan buffer kemudian diinkubasi selama 15 menit lalu
diambil dengan pipet khusus dan dimasukkan kedalam cartridge
• Setelah itu dimasukkan kedalam alat GeneXpert MTB/RIF.
• Sputum diproses dan diperiksa oleh GeneXpert MTB/RIF secara otomatis, hasilnya diperoleh
setelah ± 2 jam.
• Kemudian sisa sputum yang tidak digunakan di masukkan kedalam tabung falcon lalu
ditambahkan dengan NaOH 4% dan PBS (Phospat Buffer Sulfat) lalu di sentrifugasi.
• Dari hasil sentrifugasi, sputum diinokulasikan untuk penanaman pada media Loweinstein Jensen
lalu diinkubasi pada suhu 37°C.
• Hasil penanaman di media Loweinstein Jensen diperoleh setelah 6-8 minggu.
• Kemudian dari hasil kultur yang positif dilakukan uji resistensi menggunakan metode gold
standar proporsi
Download
Random flashcards
hardi

0 Cards oauth2_google_0810629b-edb6-401f-b28c-674c45d34d87

Rekening Agen Resmi De Nature Indonesia

9 Cards denaturerumahsehat

Nomor Rekening Asli Agen De Nature Indonesia

2 Cards denaturerumahsehat

Card

2 Cards

English Training Melbourne

2 Cards Einstein College of Australia

Create flashcards