Pengaruh Induksi DMBA - Fakultas Kedokteran Hewan

Pengaruh Induksi DMBA (Dimetylbenz (α) Antrasen) Multiple Low Dose (MLD) Pada Mamae Tikus
(Rattus norvegicus) Terhadap Kadar VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
The Effect of DMBA (Dimetylbenz (α) Antrasen) Multiple Low Dose (MLD) Induction at Rat’s (Rattus
norvegicus) Mammae on VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) Level
Putri Astikasanti, Dyah Ayu Oktavianie A.P, Anna Roosdiana
Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan,
Universitas Brawijaya
[email protected]
ABSTRAK
Kanker mammae merupakan kasus kanker yang banyak terjadi pada hewan betina. Kanker mammae
dapat disebabkan karena mutasi gen yang disebabkan zat karsinogenetik. Pembuatan hewan model kanker
mammae dapat menggunakan zat karsinogenik 7,12 dimetylbenz (α) antrasen (DMBA), karena DMBA dapat
menyebabkan kerusakan DNA yang ditandai dengan kesalahan pengkodean gen-gen pengatur pertumbuhan.
Gen pengatur pertumbuhan yang rusak menyebabkan pertumbuhan yang tidak terkontrol pada sel-sel dalam
tubuh termasuk sel endotel sebagai tempat produksi VEGF yang berperan pada proses angiogenesis. Penelitian
ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh induksi DMBA terhadap kadar VEGF tikus (Rattus norvegicus).
Hewan model yang dipakai pada penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley betina
umur 10-12 minggu yang dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif atau tidak diinduksi
DMBA, dan kelompok tikus yang diinduksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan induksi estrogen dengan
dosis 20000 IU/KgBB. Induksi DMBA dilakukan setiap 48 jam sekali selama 10x dan pemberian estrogen 2
kali dalam satu minggu. Pengukuran kadar VEGF dalam darah dilakukan sebelum dan sesudah tikus diinduksi
DMBA dengan metode ELISA. Analisa data yang digunakan adalah uji T tidak berpasangan. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa induksi DMBA memberikan pengaruh terhadap peningkatan kadar VEGF sebesar 19x
(276.589±16.434) dengan α=0,05. Kesimpulan dari penelitian ini adalah induksi DMBA dapat meningkatkan
kadar VEGF tikus.
Kata kunci : Kanker mamme, Rattus norvegicus, 7,12 dimetylbenz (α) antrasen (DMBA), VEGF
ABSTRACT
Mammary cancer is cancer that occurs in female animal. Mammary cancer can be caused by gene
mutations which caused by carcinogenic substance. Mammary cancer in animal model can made using
carcinogenic substances dimetylbenz 7.12 (α) antrasen (DMBA) which can caused DNA damage that is
characterized by error encoding regulating growth genes. Growth factor genes which demage can cause
uncontrollable growth of cell in the body, including endothelial cells as production place of VEGF has a
function on the angiogenesis process.This study was conducted to determine the effect of DMBA induction on
the levels of VEGF on the rat (Rattus norvegicus). Animal models used 10-12 weeks old of female rat (Rattus
norvegicus) Sprague Dawley strain which were divided into 2 groups: group 1 was a negative control or not
induced by DMBA, and the second group was DMBA-induced rat at a dose of 10 mg / kg BW and estrogen
induction of 20000 IU / Kg BW. DMBA induction was given 10x every 48 hours and estrogen was given 2
times a week. The levels of VEGF in the blood before and after DMBA induced was measured by ELISA
method. Analysis of the data used unpaired t test. The results showed that the induction of DMBA could
increased levels of VEGF at 19x (276.58± 16.43)) with α = 0.05. The conclusion of this study was DMBA
induction can increase the levels of VEGF in rat.
Keyword: 7.12 dimetylbenz (α) antrasen (DMBA), Mammary Cancer, Rattus norvegicus, VEGF
PENDAHULUAN
Kanker mammae merupakan kanker yang
banyak terjadi pada wanita di seluruh dunia
dengan angka kejadian yang terus meningkat.
Kasus kanker mammae di Indonesia
menempati urutan pertama sebesar 16,85%
atau kejadian sebanyak 8.227 kasus
(Ranasasmita, 2008; Retnani, 2011).
Menurut Kelsey (1998), presentase kanker
pada anjing sebesar 51%, dimana 97% terjadi
pada anjing betina. Pada kucing kanker
mammae merupakan kasus yang banyak
terjadi setelah haemopoietic dan kanker kulit
dengan frekuensi kejadian yaitu 158470/100.000 hewan, dan 86% dari kejadian
kanker mammae adalah ganas (Todorova,
2006).
Kanker mammae dapat dipengaruhi oleh
usia, nutrisi, inbreeding, obesitas, vaksinasi
dan obat-obatan yang diberikan pada hewan
tersebut. Secara alami kanker mammae dapat
disebabkan oleh faktor genetika, hormon,
infeksi virus, sinar UV, karsinogenesis,
faktor lingkungan dan gaya hidup (Polton,
2009).
Penelitian dengan pembuatan hewan
model kanker mammae telah banyak
dilakukan menggunakan induksi bahan
karsinogen. Bahan karsinogen
yang
digunakan seperti 7,12 dimetylbenz (α)
antrasen (DMBA), benz[a]pyrene (BP), 4nitroquinoline-1-oxide, dan N-nitroso-Nmethylure. Hewan percobaan mengalami
kanker mammae melalui diinisiasi zat-zat
tersebut (Cordeiro and Kaliwal, 2011).
Senyawa DMBA merupakan zat yang sering
digunakan karena memiliki potensi yang
lebih tinggi dan lebih stabil sebagai zat
karsinogen untuk pembuatan hewan model
kanker. Konsentrasi pemberian induksi
DMBA dalam pembuatan hewan model
kanker pada penelitian Adventus (2013),
diberikan dengan dosis 10 mg/KgBB secara
oral setiap hari sekali selama 44 hari.
Penelitian yang dilakukan Cordeiro dan
Kaliwal (2011), induksi DMBA dilakukan
secara intra-mammary subcutaneous dengan
dosis 20 mg/KgBB satu minggu sekali
selama 4 minggu. Pemberian DMBA secara
oral untuk pembuatan hewan model kanker
mammae memiliki kekurangan yaitu
membutuhkan waktu yang lama untuk
pembentukan kanker pada hewan model,
oleh sebab itu penelitian ini menggunakan
cara injeksi intra mammary subcutan dengan
modifikasi dosis 10 mg/KgBB dengan
pemberian selang waktu 48 jam sekali
sebanyak 10 kali.
Senyawa DMBA yang diinduksikan akan
dimetabolisme di hati oleh sitokrom P450
CYP1A1 atau CYP1B1 dan microsomal
epoxides hydrolase (mEH) menjadi DMBA
3,4
diol-1,2
epoxida
(DMBA-DE)
membentuk DNA adduct (Akrom, 2012).
Metabolisme
DMBA
menyebabkan
kerusakan DNA yang berpengaruh pada gengen pengatur pertumbuhan sehingga akan
terjadi pertumbuhan yang tidak terkontrol.
Pertumbuhan yang berlebihan terjadi di
semua sel termasuk sel endotel dan
berpengaruh pada peningkatan produksi
VEGF
dan
terjadi
angiogenesis.
Angiogenesis
adalah
pembentukan
pembuluh darah baru yang berguna
mensuplai nutrisi dan oksigen ke sel kanker
sehingga dapat berkembang terus menerus
(Tammama, 2012). Berdasarkan latar
belakang tersebut penelitian ini dilakukan
untuk mengetahui pengaruh induksi DMBA
kadar Vaskular Endothelial Growth Factor
(VEGF) tikus (Rattus norvegicus) model
kanker mammae.
MATERI DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk penelitian ini
antara lain: kandang tikus, spuit 1 ml dan 3
ml, timbangan hewan, mortar, sentrifuge,
baker glass, object glass, cover glass, tabung
ukur, mikrotube, Skapel blade, timbangan
analitik, mikroskop.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah tikus putih (Rattus norvegicus) usia
10-12 minggu, dimetylbenz (α) antrasene
(DMBA), minyak biji bunga matahari, NS
(Normal saline), NaCl fisiologis, Xylol,
Etanol 100%, PFA 4%, Akuades, PBS pH
4,4, Hydrogen Peroksida, SA-HRP, DAB,
Mayer Hematoxyler, BSA 1%, entellan,
kloroform,), VEGF kit
Perlakuan Hewan Coba
Hewan coba dibagi dalam dua kelompok
yaitu kelompok kontrol dan kelompok
perlakuan. Kelompok control adalah tikus
sehat tanpa perlakuan sedangkan kelompok
perlakuan adalah tikus yang diberi induksi
DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan
estrogen 20.000 IU/kg BB. Penggunaan
hewan coba telah mendapat sertifikat laik
etik oleh Komisi Etik Penelitian Universitas
Brawijaya Nomor 189-KEP-UB.
Perhitungan Dosis DMBA dan Estrogen
Kelompok perlakuan diberikan DMBA
dengan dosis 10 mg/kg BB yang merupakan
modifikasi dari Cordeiro dan Kaliwal (2011).
Senyawa DMBA dilarutkan dalam minyak
biji bunga matahari dan NaCl fisiologis
dengan perbandingan 3:1 (Pugalendhi et al.,
2011). Dosis estrogen yang diberikan yaitu
20.000 IU/kg BB yang merupakan
modifikasi dari Naciff et al., (2002).
Pembuatan Hewan Model Kanker Mammae
Pembuatan hewan model kanker mammae
dengan memberikan induksi DMBA dan
estrogen. Induksi DMBA dengan dosis 10
mg/kg BB diberikan secara subcutan pada
organ target mammae. Induksi DMBA
dilakukan setiap 48 jam sekali sebanyak 10
kali. Induksi estrogen diberikan secara
intramuscular dengan dosis 20.000 IU/kg BB
sebanyak dua kali dalam seminggu dengan
interval waktu pemberian satu minggu dua
kali dengan selang waktu satu hari sebelum
induksi DMBA.
Pengamatan Tikus Pasca Induksi DMBA
Tikus yang sudah diinduksi DMBA
dilakukan pemeriksaan fisik dan dilakukan
penimbangan berat badan. Pemeriksaan fisik
dilakukan dengan cara palpasi pada daerah
mammae setiap satu minggu sekali sampai
minggu terakhir induksi. Palpasi dilakukan
untuk mengetahui perkembangan kanker
dengan terbentuknya nodul pada mammae
tikus.
Pengabilan Sampel Darah Hewan Coba
Tikus di restrain menggunakan kandang
jepit, ekor dibersihkan dengan kapas alkohol,
ujung ekor digunting sedikit, ekor diasukkan
microtube dan ditekan-tekan sampai keluar
darah, microtube dimiringkan dan setelah 3
jam disentrifuge. Ambil bagian serum
menggunakan mikropipet dan dipindahkan
ke mikrotube baru, diberi label dan disimpan
pada leari pendingin.
Pengukuran Kadar VEGF Dengan Uji ELISA
Pengukuran kadar VEGF menggunakan
uji ELISA dilakukan sesuai manual prosedur
pada kit VEGF oleh Quantikine, R&D
System Europe,Ltd.
Analisis Data
Data yang diperoleh adalah data
kuantitatif dari presentase area ekspresi
Interleukin-12 dianalisis secara statistik.
Hasil dan Pembahasan
Pembuatan hewan model kanker mammae
dengan menggunakan DMBA diketahui
keberhasilannya dengan mengamati adanya
nodul atau masa yang berbentuk melingkar
atau tidak beraturan pada kelenjar mammae.
Induksi DMBA dilakukan sebanyak 10 kali
dengan selang waktu 48 jam. Pengamatan
nodul dilakukan dengan palpasi pada daerah
mammae setiap 1 minggu sekali. Nodul
pertama kali muncul pada minggu ke 2,
dengan adanya benjolan pada daerah
mammae tikus kelompok perlakuan yang
ditandai dengan bentukan padat, keras dan
tidak dapat digerakan.
Terbentuknya nodul pada penelitian ini
digunakan sebagai penanda keberhasilan
awal pebentukan kanker mammae setelah
induksi DMBA. Nodul yang terbentuk
kemudian
dilakukan
pemeriksaan
histopatologi untuk memastikan bentukan
nodul disebabkan oleh sel kanker. Hasil dari
pemeriksaan histopatologi mammae pada
kelompok perlakuan menunjukkan adanya
proliferasi pada sel epitel pada duktus
mammae sampai menutup lumen.
Hasil penelitian pembuatan hewan model
kanker mammae yang dilakukan Ranasmita
(2008) dengan pemberian induksi DMBA
sebanyak 11 kali secara oral dengan dosis
20mg/kg BB tikus sebanyak 2 kali seminggu
menunjukkan terbentuknya nodul pertama
kali setelah 24 hari dari induksi terakhir dan
terus berkembang sampai hari ke 89 setelah
induksi berakhir. Penelitian ini menunjukkan
nodul pertama kali muncul pada minggu ke 2
induksi dan semakin mengeras dan
membesar sampai induksi berakhir yaitu
minggu ke 5. Hal tersebut membuktikan
bahwa induksi DMBA secara Multiple Low
Dose (MLD) dengan dosis 10mg/kg BB
setiap 48 jam sekali sebanyak 10 kali induksi
mampu menginisisasi terbentuknya kanker
pada mammae tikus dengan lebih cepat
dibandingkan penelitian yang dilakukan oleh
Ranasmita (2008). Induksi DMBA secara
subkutan pada mammae tikus menyebabkan
DMBA langsung menuju ke target organnya
yaitu mammae.
Pengaruh DMBA Terhadap Kadar VEGF
Tikus Model Kanker Mamae
Kadar VEGF pada serum tikus model
kanker
mammae
dapat
diketahui
menggunakan metode ELISA. Nilai kadar
VEGF pada hewan model kontrol dan
perlakuan dapat diketahui dari pembacaan
ELISA reader. Nilai kadar VEGF dari
masing-masing pelakuan dihitung rataratanya
untuk
mengetahui
besarnya
peningkatan yang terjadi. Rata-rata kadar
VEGF pada kelompok perlakuan lebih besar
daripada
kelompok
kontrol
dimana
menunjukkan peningkatan sebesar 19x yang
tercantum pada Tabel 1.
Tabel 1 Tabel Peningkatan Kadar VEGF
Kelompok
Rata-rata
Kadar
VEGF ± SD
(%)
Kontrol
92.53 ± 7.48
Perlakuan
276.58 ±
16.43
Peningkatan
Kadar
VEGF
dibandingka
n kontrol
negatif
19x
Nilai kadar VEGF yang diperoleh
kemudian
dilakukan
analisa
hasil
berdasarkan uji T tidak berpasangan
menggunakan software SPSS. Faktor
pertumbuhan VEGF kelompok kontrol pada
Tabel 1 meiliki kadar yang
rendah
dikarenakan dalam keadaan normal VEGF
diekspresikan dalam kadar yang bervariasi
oleh berbagai jaringan. Saat kadar oksigen
normal ekspresi VEGF akan menurun dan
mengalami stabilisasi. Faktor pertumbuhan
VEGF sangat penting dalam proses
pertumbuhan dan perkembangan, seperti
embriogenesis,
penyembuhan
luka,
pembentukan jaringan vaskular dalam
reproduksi betina yaitu pembentukan Corpus
luteum dan regenerasi endometrium.
Embriogenesis
merupakan
proses
pembentukan embrio yang memerlukan
asupan nutrisi dan oksigen yang dimediasi
pembentukan pembuluh darah baru antara
induk dan anak. Angiogenesis terjadi di
tubuh yang sehat untuk penyembuhan luka
berguna memulihkan aliran darah ke sel-sel
setelah cidera (Frisca, 2009).
Faktor pertumbuhan VEGF pada
kelompok perlakuan memiliki kadar yang
tinggi dibandingkan pada kelompok kontrol.
Tingginya kadar VEGF pada tikus perlakuan
disebabkan akibat induksi DMBA akan
membuat
kerusakan pada DNA yang
mengkode pertumbuhan sehingga akan
terjadi pertumbuhan yang tidak terkontrol
pada sel termasuk sel endotel. Sel endotel
merupakan tempat diproduksinya VEGF
yang berperan pada proses angiogenesis.
Mekanisme angiogenesis yang terjadi
bertujuan untuk membantu pemberian nutrisi
dan oksigen pada sel kanker sehingga sel
kanker dapat berkembang. Pada penelitian ini
terbukti adanya kemungkinan terjadinya
kanker mammae oleh induksi DMBA dilihat
dari peningkatan kadar VEGF pada tikus
kelompok perlakuan sebanyak 19 kali
dibandingkan kelompok kontrol.
Tang (2006) mengungkapkan bahwa
regulasi dari VEGF dapat diekspresikan oleh
Extracellular matrix metalloproteinase
(MMP) inducer (EMMPRIN) melalui jalur
sinyal P13K-Akt. Ekspresi yang berlebih
EMMPRIN pada kanker mammae dapat
merangsang fosforilasi pada Akt dan MAPk.
Jalur P13K-Akt akan menginduksi sinyal
angiogenic dan secara langsung menginduksi
angiogenesis tumor dengan mengatur
regulasi ekspresi VEGF pada sel endotel.
KESIMPULAN
Induksi 7,12 dimethylbenz [a] antrachen
(DMBA) dengan dosis 10 mg/kg BB pada
mammae tikus (Rattus norvegicus) dapat
meningkatkan kadar Vascular Endothelial
Growth Factor (VEGF) secara signifikan
hingga 19x dibandingkan kondisi normal.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
mengenai pengaruh induksi DMBA dalam
pembuatan hewan model kanker mammae
pada organ-organ lain dan perlu dilakukan
observasi lebih lanjut terkait dengan dampak
induksi DMBA dalam pembuatan hewan
model kanker pada hepar dapat menyebabkan
inflmasi sistemik.
DAFTAR PUSTAKA
Adventus, B., Tiny, E.H. 2013. Ekstrak
metanol Daun Kelor Menurunkan
Ekspresi BCL-2, TRAIL-R1, dan
Kadar Caspase-3 Jaringan Kolon Tikus
yang Diinduksi DMBA. Jurnal
Kedokteran Brawijaya, Vol.27, No.4.
Akrom. 2012. Mekanisme Kemopreventif
Ekstrak Heksan Biji Jinten Hitam
(Niggela sativa Lor) Pada Tikus
Sprague Dawley Diinduksi 7,12
Dimethylbenz (a) antrasene Kajian
Antioksidan dan Imunomodulator
[Disertasi].Fakultas
Kedokteran.Universitas Gajah Mada.
Arifah, A.N. 2014. Efek Fraksi Etil Asetat
Ekstrak Etanol Akar Pasak Bumi
(Eurycoma longifa,Jack) Terhadap
Aktivitas Fagositosis Makrofag Secara
In Vitro. Pharmaciana, Vol.4,No. 1,
2014:9-14.
Cordeiro M.C and Kaliwal B.B. 2011.
Antioxidant Activity of Bark Extract of
Bridelia Retusa Spreng on DMBA
Induced Mammary Carcinogenesis in
Female Sprague Dwley Rats. Journal
of Pharmacognosy. Vol. Dampa2,
Issue 1, 2011, pp-14-20.
Frisca, C.T., Sardjono, dan Ferry, S. 2009.
Angiogenesis : Patofisiologi dan
Aplikasi Klinis. JKM. Vol.8 No.2:174187.
Kelsey, JL., Antony S. Moore, and Lawrence
T. Glickman. 1998. Epidemiologic
Studies of Risk Factors for Cancer in
Pet Dogs. Epidemiologic reviews/ vol.
20, No. 2. Printed in U.S.A.
Polton, G. 2009. Mammary Tumours in
Dogs. Irish Veterinary Journal Vol. 62
No.1.
Ranasasmita, R. 2008. Aktifitas Antikanker
Ekstrak Etanol Daun Aglaia elliptica
Blume Pada Tikus Betina Yang
Diinduksi
7,12Dimetilbenz(@)Antrasena [SKRIPSI].
Program Studi Biokimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam. Institut Pertanian Bogor.
Retnani, V. 2011. Pengaruh Suplementasi
Ekstrak Daun Annova Muricarata
Terhadap Kejadian Displasia Epitel
Kelenjar Payudara Tikus Sprague
Dawley
yang
Diinduksi
7,12
Dimetilbenz(α)Antrasena.
Fakultas
Kedokteran. Universitas Diponegoro.
Sigma-Aldrich. 2007. 7,12-Dimethylbenz[α]
anthracene.
http://www.sigmaaldrich.com. [26
April 2007].
Tammama, T. 2012. Angiogenesis dan
Metastasis. Fakultas Kedokteran Gigi.
Universitas Padjadjaran. Bandung.
Tang, Y., Marian, T., Nakadaa,Patricia, R.,
Jenny, L., Francis, L.M.,Hillary, M.,
Mark, C., Linda, A.S., Peter, B., and Li
Yan. 2006. Regulation of Vascular
Endothelial Growth Factor Expression
by EMMPRIN via the P13K-Akt
signaling
Pathway.
American
Association for Cancer Research