DOC

Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
MOLECULAR DOCKING, SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK
SENYAWA 1-(3-KLOROBENZOIL)-1,3-DIMETILUREA
Dian Agung Pangaribowo
Fakultas Farmasi Universitas Jember
Email: [email protected]
Abstract
A novel 1-(3-chlorobenzoyl)-1,3-dimethylurea has been designed, synthesized,
structurally determined, and the in vitro cytotoxic activity was evaluated. Docking simulation
was performed to the position of this compound into the Checkpoint kinase 1 (Chk1) active
site to determine the probable binding model. Synthesis of 1-(3-chlorobenzoyl)-1,3dimethylurea was completed by acylation reaction between 1,3-dimethylurea and 3chlorobenzoyl chloride. The purity of synthesized product was determined by Thin Layer
Chromatography and melting point measurement. Structure identification was performed by
UV and FTIR spectrophotometer, NMR spectrometer. Antiproliferative assay result
demonstrated that this compound possessed good cytotoxic activity against HeLa cells, which
is comparable to the positive control. This compound with potent cytotoxic activity might be a
potential anticancer agent.
Keywords: 1-(3-chlorobenzoyl)-1,3-dimethylurea, molecular docking, cytotoxic activity
perkiraan
Pendahuluan
Kanker
merupakan
kasus
kematian
sejumlah
permasalahan
577.190 (Cancer Facts and Figures, 2012).
kesehatan masyarakat yang utama di
Beberapa penelitian telah dilakukan
Indonesia dan
negara lain di dunia.
pada
turunan
urea
sebagai
senyawa
Sebagai negara berkembang, prevalensi
antineoplastik. Song (2009) mensintesis 14
penyakit tumor/kanker di Indonesia adalah
senyawa baru turunan fenilurea. Diantara
4,3
senyawa analog tersebut, senyawa dengan
per
1.000
penduduk.
Kanker
merupakan penyebab kematian nomor 7
gugus
(5,7%)
tuberkulosis,
menunjukkan aktivitas terhadap delapan
hipertensi, cedera, perinatal, dan Diabetes
jenis sel tumor dengan nilai IC50 berkisar
Mellitus (Riskesdas, 2007). Diperkirakan
antara 0,38 sampai 4,07 µM. Saeed (2010)
pada tahun 2012 terdapat 1.638.910 kasus
melakukan sintesis turunan tiourea yang
kanker baru di Amerika Serikat, dengan
berikatan dengan gugus benzotiazol. Uji
setelah
strok,
aktivitas
bromoasetil
antikanker
pada
posisi
turunan
N’
tiourea
519
Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
tersebut dilakukan dengan menggunakan
modifikasi
struktur
1-(benzoiloksi)urea
sel HeLa dan MCF-7. Dari penelitian
dan mencari hubungan kuantitatif struktur
didapatkan nilai IC50 senyawa turunan
aktivitas sitotoksiknya secara in vitro
tiourea dengan menggunakan sel MCF-7
terhadap sel HeLa. Struktur senyawa
berkisar antara 18,10-45,72 µM, dan pada
turunan urea dan tiourea tersebut dapat
sel HeLa nilai IC50 berkisar antara 38,85-
dilihat pada gambar 1.
75,13 µM. Hardjono (2012) melakukan
(a)
(b)
(d)
(c)
(e)
Gambar 1. Struktur senyawa (a) urea, (b) hidroksiurea, (c) tiourea
(d) 1-(benzoiloksi)urea, (e) fenilurea
Rancangan sintesis dalam penelitian
Data Bank. Penentuan aktivitas antikanker
ini adalah melakukan reaksi asilasi salah
turunan 1-(3-klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
satu gugus amina pada 1,3-dimetilurea
dilakukan secara in vitro dengan metode
dengan
dalam
MTT menggunakan sel HeLa, sesuai
pelarut tetrahidrofuran, dalam suasana
dengan uji aktivitas antikanker turunan
basa dengan trietilamin. Prosedur sintesis
urea
senyawa turunan urea ini mengacu pada
Penelitian
reaksi
mendapatkan senyawa 1-(3-klorobenzoil)-
3-klorobenzoil
klorida
Schotten-Baumann
yang
telah
dimodifikasi (Clayden, 2001).
proses
docking
penelitian
ini
1,3-dimetilurea
Uji in silico dilakukan dengan
melakukan
pada
molekul
sebelumnya.
bertujuan
dengan
untuk
aktivitas
antikanker yang lebih besar dibandingkan
kontrol positif, yaitu hidroksiurea.
kandidat obat terhadap reseptor melalui
simulasi
senyawa
komputer.
Docking
molekul
1-(3-klorobenzoil)-1,3-
Metodologi
Bahan baku sintesis: 1,3-Dimetilurea p.s
dimetilurea dilakukan terhadap reseptor
(Merck),
3-Klorobenzoilklorida
p.s
Chk1 yang dapat diunduh dari Protein
(Aldrich), Tetrahidrofuran p.a (Merck),
520
Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
Etanol
p.a
(Merck),
Trietilamin
p.a
reseptor dilihat melalui ikatan Hidrogen
(Merck)
ligan reseptor dan nilai Rerank Score.
Bahan uji sitotoksik: Reagen MTT [3-
Metode sintesis
(4,5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-difenil
Pada labu alas bulat 250 ml,
tetrazolium bromida]; Fetal Bovine Serum
dicampur 0,08 mol 1,3-dimetilurea dengan
(FBS); penisilin; streptomisin; Kultur sel
50 ml tetrahidrofuran dan 0,08 mol
kanker HeLa; DMSO (dimetil sulfoksida);
trietilamin.
PBS (phosphoric buffer solution); SDS
klorobenzoil klorida 0,04 mol dalam 15 ml
(sodium dodesil sulfat).
tetrahidrofuran sedikit demi sedikit sampai
Alat
habis. Kemudian campuran direfluks di
Tambahkan
larutan
3-
Uji kemurnian senyawa hasil sintesis
atas penangas air selama 4 jam. Jika reaksi
menggunakan melt-temp electrothermal
dianggap telah selesai, campuran dicuci
dan plat KLT GF254. Identifikasi gugus
dengan 100 ml air sebanyak dua kali,
kromofor menggunakan Spektrofotometer
kemudian
UV HP 8452A Diode Array pada kisaran
Buchner. Proses rekristalisasi dilakukan
panjang gelombang, λ= 200-400 nm
dengan menggunakan etanol panas. Kristal
dengan konsentrasi 10 ppm dalam pelarut
yang terbentuk disaring dengan corong
etanol.
fungsi
Buchner, dicuci dengan etanol 10 ml
FT-IR
sebanyak dua kali. Kristal dikeringkan
PERKIN ELMER Spectrum One. Sampel
dalam oven pada suhu 60ºC (Hardjono,
padatan
2012).
Analisis
menggunakan
yang
gugus
Spektrofotometer
digerus
bersama
KBr
kemudian dibentuk menjadi cakram tipis
dan serapannya diukur pada daerah infra
merah. Konfirmasi struktur lebih lanjut
ditentukan dengan
1
H-NMR dan
13
C-
NMR.
dengan
corong
Metode uji sitotoksik secara in vitro
Kultur sel HeLa sejumlah 7 x 103
sel/well
diinokulasikan
ke
dalam
microplate 96 well plate dan diinkubasi
dalam
inkubator
dilakukan
CO2.
penambahan
Hari
kedua
sampel
yang
dilarutkan dalam pelarut DMSO (dimetil
Metode molecular docking
Molecular docking senyawa 1-(3klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
disaring
sulfoksida). Sampel dengan konsentrasi
dilakukan
beragam diencerkan dengan penambahan
dengan menggunakan program Molegro
PBS (phosphoric buffer solution) dengan
Virtual Docker (MVD). Ligan di docking
pH (7,30–7,65) ditambahkan ke dalam sel
pada sisi aktif reseptor Checkpoint kinase
dalam
1 (2YWP.pdb). Model pengikatan ligan
disimpan kembali dalam inkubator CO2.
microplate
lalu
dikocok
dan
521
Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
Setelah 48 jam, ke dalam sel ditambahkan
Hasil dan Pembahasan
reagen MTT dan diinkubasi selama 4 jam
1. Sintesis senyawa 1-(3-klorobenzoil)-
untuk selanjutnya ditambahkan SDS dan
dikocok
dengan
baik.
dilanjutkan
kembali
Perubahan
warna
Inkubasi
sintesis
senyawa
1-(3-
klorobenzoil)-1,3-dimetilurea dapat dilihat
kuning
pada Gambar 2. Dari reaksi tersebut
dalam
dihasilkan rendemen sebesar 49,7%. Uji
mitokondria sel yang masih hidup dapat
kemurnian produk hasil sintesis dengan
dikuantifikasi pada panjang gelombang
melt-temp electrothemal didapatkan jarak
λ=550 nm dengan Microplate reader. Nilai
lebur kurang dari 2ºC yaitu sebesar 51 -
IC50 dilihat dari grafik hubungan antara
52ºC. Uji kemurnian dengan metode KLT
konsentrasi senyawa bahan uji (μg/mL)
menggunakan tiga komposisi eluen dengan
dengan intensitas larutan dari viabilitas sel
polaritas yang berbeda dihasilkan noda
(Gil, 1999).
tunggal.
dari
formazan
24
Skema
jam.
menjadi
selama
sel
1,3-dimetilurea
MTT
ungu
di
+
Gambar 2. Skema sintesis senyawa 1-(3-klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
Konfirmasi
struktur
klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
1-(3-
C=O; 1531 cm-1 menunjukkan adanya –
dengan
C=C- aromatis. Terbentuknya dua pita
serapan
terbentuk dua puncak pada λmaks 204 nm
menunjukkan
dan 222 nm. Absorbansi pada λ 222 nm
sintesis terbentuk, karena senyawa asal
dikarenakan
rangkap
hanya memiliki satu gugus karbonil –C=O.
terkonjugasi dari cincin aromatis. Pada
Dari spektrum 1H-NMR terlihat dua
spektrum IR terlihat adanya pita serapan
puncak singlet pada 2,89 ppm dan 3,14
pada 3320 cm-1 yang menunjukkan adanya
ppm yang berasal dari atom H dua gugus
gugus –NH; 1700 cm-1 dan 1646 cm-1
metil. Puncak pada 7,22 – 7,46 berasal dari
menunjukkan adanya dua gugus karbonil –
atom H cincin aromatis, dan puncak pada
adanya
ikatan
gugus
bahwa
karbonil
–C=O
menggunakan spektrum UV terlihat bahwa
senyawa
hasil
522
Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
8,92 ppm berasal dari atom H gugus –NH.
Dari spektrum
13
C-NMR dapat dilihat dua
difeniltetrazolium bromida) oleh sistem
reduktase.
Suksinat
tetrazolium
yang
puncak pada pergeseran kimia 27,18 ppm
termasuk dalam rantai respirasi dalam
dan 35,72 ppm yang berasal dari dua atom
mitokondria sel-sel yang hidup membentuk
C
kristal formazan berwarna ungu dan tidak
gugus
metil.
Cincin
aromatis
memberikan enam puncak yaitu pada
larut
124,62 ppm; 127,89 ppm; 130,15 ppm;
(bersifat detergenik) akan melarutkan kristal
130,89 ppm; 134,92 ppm dan 137,78 ppm.
Dua puncak pada pergeseran kimia 155,63
ppm dan 172,99 ppm berasal dari dua atom
air.
berwarna
Penambahan
ini
yang
reagen
stopper
kemudian
diukur
absorbansinya menggunakan ELISA reader.
Intensitas
warna
ungu
yang
terbentuk
proporsional dengan jumlah sel hidup.
C gugus karbonil –C=O.
Sehingga jika intensitas warna ungu semakin
2. Uji sitotoksik in vitro
besar, maka berarti jumlah sel hidup
Metode yang digunakan dalam uji
semakin banyak.
aktivitas sitotoksik adalah metode MTT.
Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya
reduksi garam kuning tetrazolium MTT (3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
Hasil uji sitotoksik senyawa 1-(3klorobenzoil)-1,3-dimetilurea dapat dilihat
pada tabel 1.
Tabel 1 Hasil uji sitotoksik senyawa 1-(3-klorobenzoil)-1,3-dimetilurea terhadap sel HeLa
No.
1.
1-(3-klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
223,87
2.
Hidroksiurea
479,02
Berdasarkan nilai IC50 pada tabel 1,
dapat
disimpulkan
senyawa
klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
aktivitas
IC50 (µg/ml)
Senyawa
sitotoksik
terhadap reseptor Chk1 menggunakan
1-(3-
program MVD. Dari proses docking ligan
memiliki
terhadap reseptor didapatkan data bahwa
yang lebih besar
gugus
amin
dari
senyawa
1-(3-
dibandingkan dengan obat kanker yang
klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
telah beredar yaitu hidroksiurea.
hidrogen dengan asam amino Cys 87.
3.
Molecular docking senyawa 1-(3-
Ikatan Hidrogen yang ditandai dengan
klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
garis
Proses
docking
senyawa
klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
1-(3-
putus-putus
dapat
berikatan
dilihat
pada
Gambar 3.
dilakukan
523
Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
Ikatan
hidrogen
Gambar 3. Ikatan hidrogen antara 1-(3-klorobenzoil)-1,3-dimetilurea dengan asam amino
Cys 87 reseptor 2YWP
Nilai Rerank Score dari senyawa 1-(3klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
64,1151
39,0396.
dan
hidroksiurea
Nilai
yaitu
-
sebesar
-
Rerank
Simpulan
Senyawa
1-(3-klorobenzoil)-1,3-
Score
dimetilurea dapat disintesis melalui reaksi
menggambarkan kestabilan ikatan ligan
asilasi antara 1,3-dimetilurea dan 3-
dan reseptor. Semakin kecil nilai Rerank
klorobenzoil
Score maka semakin stabil ikatan obat
rendemen sebesar 49,7%. Senyawa 1-(3-
reseptor. Dari data Rerank Score dapat
klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
disimpulkan bahwa ikatan antara senyawa
223,87
1-(3-klorobenzoil)-1,3-dimetilurea dengan
sitotoksik yang lebih besar dibandingkan
reseptor lebih stabil dibandingkan ikatan
dengan obat kanker yang telah beredar
hidroksiurea dengan reseptor. Sehingga,
yaitu hidroksiurea (IC50 = 479,02 µg/ml).
klorida,
µg/ml)
dan
memiliki
diperoleh
(IC50
=
aktivitas
dapat diprediksi bahwa senyawa 1-(3klorobenzoil)-1,3-dimetilurea
aktivitas
sitotoksik
yang
memiliki
lebih
Ucapan Terima Kasih
baik
Terima kasih untuk Laboratorium Kimia
dibandingkan hidroksiurea. Hasil prediksi
Medisinal Fakultas Farmasi Universitas
molecular docking ini sesuai dengan hasil
Airlangga yang memfasilitasi penelitian ini
uji sitotoksik senyawa yang dapat dilihat
dan Prof. Siswandono yang menyediakan
dari nilai IC50.
lisensi program MVD.
524
Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
Daftar Pustaka
Medicinal
Abraham, D.J., 2003, Burger’s Medicinal
2321-2324
Chemistry
and
Drug
Discovery
Volume
5:
Chemotherapeutic
Chemistry Letters, 9:
Hardjono, S., 2012, Modifikasi Struktur 1(benzoiloksi)urea
Agents, 6th Ed., John Wiley &Sons,
Kuantitatif
Inc, Virginia, 2-46
sitotoksiknya,
Boriana, H., Ilieva, S., Cheshmedzhieva,
D., Galabov, B., 2005, Conformation
dan
Hubungan
Struktur
Aktivitas
Disertasi,
Pascasarjana Universitas Airlangga
Surabaya
of some biologically active aromatic
Huang, V., Lu, X., Jiang, Y., Wang, J.Y.J.,
ureas, Spectrochimica Acta Part A,
2009, Effect of hydroxyurea on the
61: 1321–1326
promoter
Cancer Facts & Figures, 2012, American
Cancer Society
occupancy
profiles
of
tumor suppressor p53 and p73, BMC
Biology, 7(35): 1-16
Clayden, Greeves, Warren & Wothers,
Li, G., Tao, Z.F., Tong, Y., Przytulinska,
2001, Organic Chemistry, Oxford
M.K., Kovar, P., Merta, P., Chen, Z.,
University Press, New York, 279-
Zhang, H., Sowin, T., Rosenberg,
303
S.H., Lin, N.H., 2007. Synthesis and
Fortin, S., Moreau, E., Lacroix, J., Côté,
in-vitro
biological
activity
of
M.F., Petitclerc, E., Gaudreault,
macrocyclic urea Chk1 inhibitors,
R.C.,
Bioorganic & Medicinal Chemistry
2010,
Synthesis,
antiproliferative activity evaluation
and structure activity relationships of
Letters, 17:6499–6504
Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S.,
novel aromatic urea and amide
Vyvyan,
analogues
Spectroscopy,
of
N-phenyl-N’-(2-
chloroethyl)ureas, European Journal
of Medicinal Chemistry, 45: 29282937
J.R.,
Introduction
4th
Ed.,
Cangage
Learning, California, 15-28
Riskesdas, 2007, Badan Penelitian dan
Pengembangan
Gil, M.J., Mafiti, M.A., Arteaga, C.,
to
Kesehatan
Kementrian Kesehatan RI
Migliaccio, M., Encfo, I., Gonz~ilez,
Saeed , S., Rashid, N., Jones, P.G., Ali,
A., Merino, V.M., 1999. Synthesis
M., Hussain, R., 2010. Synthesis,
and Cytotoxic Activity of N-(2-
characterization
and
pyridylsulfenyl)urea Derivatives, a
evaluation
some
New
derivatives
Class
of
Potential
Antineoplastic Agents, Bioorganic &
of
biological
thiourea
bearing benzothiazole
moiety as potential antimicrobial and
525
Media Farmasi Indonesia Vol 8 No 2
anticancer agents, European Journal
Song, D.Q., Wang, Y.M., Du, N.N., He,
of Medicinal Chemistry, 45:1323–
W.Y., Chen, K.L., Wang, G.F.,
1331
Yang, P., Wu, L.Z., Zhang, X.B.,
Song, D.Q., Du, N.N., Wang, Y.M., He,
Jiang, J.D., 2009. Synthesis and
W.Y., Jiang, E.Z., Cheng, S.X.,
activity evaluation of benzoylurea
Wang, Y.X., Li, Y.H., Wang,Y.P.,
derivatives
Li, X., Jiang, J.D., 2009. Synthesis
antiproliferative agents, Bioorganic
and activity evaluation of phenylurea
& Medicinal
derivatives
19:755–758
as
potent
antitumor
as
potential
Chemistry Letters.
agents, Bioorganic & Medicinal
Chemistry, 17:3873–3878
526