resazurin si indikator aktivitas sel - Biotrends

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
RESAZURIN SI INDIKATOR AKTIVITAS SEL
Gita Syahputra
Laboratorium Rekayasa Genetika Terapan dan Desain Protein
Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI
E-mail : [email protected]
P
engujian Aktivitas dan
Perbanyakan Sel
Penggunaan metode untuk
mengetahui aktivitas sel dan
perbanyakan sel telah dilakukan
sebelumnya dengan menggunkan
beberapa metode yaitu, uji
aktivitas sel, menggunakan
senyawa analog nukleotida, dan
penggunaan garam tetrazolium
sebagai indikator metabolisme. Uji
aktivitas sel biasanya digunakan
untuk mengetahui efek suatu
senyawa pada sel secara in vitro,
misalnya dalam pengujian
senyawa obat pada suatu bakteri
patogen. Uji aktivitas sel dapat
diketahui hasilnya secara
kuantifikasi dengan menghitung
konsentrasi ATP interseluar yang
terbentuk dalanm suatu sel. Tidak
hanya ATP, biomarker lain seperti
konsentrasi NADH juga dapat
digunakan LDH Penggunaan uji ini
diperlukan keterampilan personel
yang baik dan menggunakan alat
dan bahan yang tidak murah.
(Rampersad, 2012)
Metode penggunaan senyawa
analog nukleotida misalnya
menggunakan penanda berupa
3
senyawa analog [ H]-thymidine
atau 5-bromo-2’-deoxyuridine
[BrdU] disisipkan kedalam DNA
sel dan mengalami replikasi pada
sel secara normal. Jumlah
nukleotida kemudian diukur
berdasarkan: 1. Jumlah DNA yang
berpenanda dalam populasi sel, 2.
Jumlah penanda inti dengan
mikroskop. Tingkat pertumbuhan
sel sebanding dengan jumlah
penanda (senyawa analog).
Penggunaan metode ini
menggunakan radioisotope
sehingga memerlukan
penanganan sampel seperti
persiapan, penyimpanan, dan
pembuangan yang membutuhkan
perlakuan khusus (Stoddartdkk.,
2011)
Penggunaan garam tetrazolium
kerap digunakan sebagai indikator
metabolisme suatu sel
dikarenakan metode ini tidak
menggunakan biaya yang cukup
banyak. Garam yang digunakan
dalam uji ini adalah 3-(4,5dimethyethiazol-2-yl)-2, 5diphenyltetrazolium bromide
(MTT), sodium 3′-[1-phenylamino)carbonyl]-3,4-tetrazolium]-bis(4methoxy-6-nitrobenzene) sulfonic
acid hydrate (XTT), and 4-[3-(4iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H5-tetrazolio]-1,3-benzene
disulfonate, water-soluble
tetrazolium salt (WST-1). Salah
satu garam yang biasanya
digunakan dalam pengujian
aktivitas sel adalah garam MTT.
Prinsip penggunaan garam MTT
adalah pengukuran perbanyakan
sel secara kolorimetri dengan
melihat perubahan garam
tertrazolium menjadi formazan
dalam mitokondria yang aktif pada
sel hidup. Penggunaan garam –
garam tersebut harus disesuaikan
dengan objek sel yang akan dilihat
aktivitasnya, Misalnya untuk
metode MTT, metode ini tidak
dapat diaplikasikan pada sampel
yang berwarna karena sampel
juga akan menyerap sinar UV
sehingga menimbulkan nilai yang
tidak valid (Mosmanndkk., 1983)
Resazurin danAplikasinya
Resazurin (C12H7NO4) memiliki
nama IUPAC (7-hydroxy-10oxidophenoxazin-10-ium-3-one)
dengan bobot molekul 229,18828
g/mol. Resazurin merupakan
26
senyawa aktif dari Alamar Blue
yang diketahui merupakan
indikator reaksi reduksi oksidasi
(redoks) yang digunakan untuk
menilai fungsi metabolism sel
sejak lama (Rampersad, 2012).
Resazurin juga dikenal sebagai
diazol-resorcinol, azoresorcin,
resazoin, resazurine, yang larut
dalam air, tidak beracun, dan
mudah masuk kedalam membran
sel.
Resazurin telah dimanfaatkan
dalam banyak penelitian dan telah
dilaporkan pada beberapa terbitan
tulisan ilmiah Hasil penelusuran
literatur melalui PubMed
ditemukan lebih dari 200 terbitan
mengenai aplikasi Alamar Blue
pada penelitian kanker,
sedangkan 1000 terbitan tulisan
ilmiah pada pencarian, seleksi,
dan pengembangan obat.
Aplikasi resazurin pertama kali
dilakukan pada tahun 1929 oleh
Pesch dan Simmert untuk
menduga kontaminasi bakteri dan
yeast pada susu. Penelitain
terbaru (Muliro dkk, 2013)
melaporkan pemanfaatan
resazurin pada pengujian susu
dengan prinsip reduksi resazurin.
Pada bidang kesehatan dalam
skala seluler (Ahmed et.al, 1994),
apoptosis, siklus selular dan
kontrol (Mizuno dkk, 2004) , uji
senyawa toksik pada medis dan
risiko pada lingkungan,
sitotoksisitas (Hamid dkk, 2004),
uji antimkiroba (Lozano-Chiu dkk,
1998), Pemanfaatan lainnya telah
digunakan untuk pengujian fungsi
mitokondria pada sel secara in
vitro (Zhang dkk, 2004). Penelitian
tersebut menitikberatkan pada
fungsi mitokondria pada sel dalam
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
hal kemampuannya dalam fungsi
respirasi, integrasi membran, dan
dalam aktivitas mitokondria pada
respirasi kompleks.
Resazurin memiliki warna biru
yang tidak berflourescent dan
dapat tereduksi menjadi warna
pink yang berfluorescent dalam
bentuk resorufiin. Perubahan
warna dari biru (resazurin) menjadi
warna pink (resorufin) merupakan
indikator terjadinya reduksi oleh
sel (Page ddk., 1993). Perubahan
warna pada resazurin dilakukan
oleh enzim – enzim dalam sel
pada bagian mitokondria dan
kandidat obat untuk menghambat
bakteri patogen, seperti
Mycobacterium spp,
Staphylococcus spp,
Enterococcus spp, Pseudomonas
spp (Yamaguchi dkk., 2002,
Zabranskydkk., 1995). Pada
Mycobacteriumspp, resazurin
dapat digunakan pada sistem
BACTEC (Yajkodkk., 1995).
Sebuah studi yang melaporkan
perbandingan tujuh pengujian dari
beragam senyawa kimia, yang
meliputi Nitrae Reductase Assay
(NRA), microscopic observation
drug susceptibility (MODS),
uji kimia, dan berguna untuk
menentukan kecepatan tumbuh
suatu sel (Rampersad, 2012).
Telah banyak metode pengujian
yang digunakan untuk mengetahui
aktivitas sel dan metabolisme,
seperti uji aktivitas sel,
menggunakan senyawa analog
nukleotida, dan penggunaan
garam tetrazolium. Metode –
metode tersebut memiliki
kelebihan dan kekurangan
tertentu, sehingga perlu dilakukan
penyempurnaan oleh metode lain.
Resazurin sebagai metode yang
terus dikembangan telah banyak
Gambar 1. Mekanisme reduksi Resazurin pada sel
sitoplasma, enzim tersebut adalah
dihydrolipoamine dehydrogenase
(EC 1.8.1.4) (Matsumoto dkk.,
1990)NAD(P)H: quinone
oxidoreductase (EC 1.6.99.2)
(Belinsky dkk., 1993), danflavin
reductase (EC 1.6.99.1)
(Chikubadkk., 1994).
Pemanfaatan resazurin untuk
menilai potensi obat juga telah
banya dilaporkan seperti pada
multi-drug screening dalam
pengujian senyawa antimikroba
terhadap yeast dan fungi patogen
(termasuk Aspergillus spp.,
Candida spp.) dengan metode
NCCLS (Reis dkk., 2004, McBride
dkk., 2005). Penggunaan
resazurin untuk screening
Mycobacterium Grwoth Indicator
Tube 960 (MGITTM 960),
Genotype MTBDRplus, Alamar
Blue, MTT dan uji resazurin untuk
deteksi kandidat-kandidat obat anti
M.tuberculosis strains Ugnda
(Bwangadkk., 2010). Hasil studi
tersebut menunjukkan bahwa
Resazurin dan MTT memiliki
sensitivitas dan selektifitas yang
baik dibanding metode lain.
Resazurin banyak digunakan
didalam laporan ilmiah terkait uji
aktivitas dan metabolisme sel,
dikarenakan alasan berikut: Nonradioaktif, mudah diguanakan,
murah, tidak diperlukan keahlian
khusus, pengujian dapat dilakukan
cepat pada sampel yang banyak,
tidak beracun, tidak mengganggu
27
menjawab kekurangan metode –
metode sebelumnya yang pernah
ada. Resazurin telah diaplikasin ke
banyak bidang ilmu sains dari
peternakan hingga kesehatan dan
banyak terdapat pada laporan
ilmiah baik nasional maupun
internasional.
Daftar Pustaka
Rampersad, S.N. Multiple
Applications of Alamar Blue
as an Indicator of Metabolic
Function and Celluar Health
in Cell Viability Bioassays. J.
Sensors. 2012. 12347-12360
Stoddart, M.J. Cell viability assays:
Introduction, mammalian cell
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
viability. Meth. Mol. Biol.
2011, 740, 1–6.
Clin. Microbiol. 2004, 42,
Page, A.B.; Page, A.M.; Noel, C. A
2247–2248.
new fluorimetric assay for
Mosmann, T. Rapid colorimetric
cytotoxicity measurements in McBride, J.; Ingram, P.R.;
assay for cellular growth and
vitro. Int. J. Oncol. 1993, 3,
Henriquez, F.L.; Roberts,
survival: Application to
473–476.
C.W. Development of
proliferation and cytotoxicity
colorimetric
assays. J. Immunol. Meth.
Matsumoto, K.; Yamada, Y.;
microtiter plate assay for
1983, 65, 55–63.
Takahashi, M.; Todoroki, T.;
assessment of antimicrobials
Mizoguchi, K.; Misaki, H.;
against Acanthamoeba. J.
Ahmed, S.A.; Gogal, R.M., Jr.;
Yuki, H. Fluorometric
Clin. Microbiol. 2005, 43,
Walsh, J.E. A new rapid and
determination of carnitine in
629–634.
simple non-radioactive assay
serum with immobilized
to monitor and determine the
carnitine dehydrogenase and Yamaguchi, H.; Uchida, K.; Nagino,
proliferation of lymphocytes:
diaphorase. J. Clin. Chem.
K.; Matsunaga, T. Usefulness
An alternative to [3H]
1990, 36, 2072–2076.
of a colorimetric method for
thymidine incorporation
testing antifungal drug
assay. J. Immunol. Meth.
Belinsky, M.; Jaiswal, A.K.
susceptibilities of Aspergillus
1994, 170, 211–224.
NAD(P)H: quinone
species to voriconazole. J.
oxidoreductase1DTInfect. Chemother. 2002, 8,
Mizuno, R.; Oya, M.; Shiomi, T.;
diaphorase expression in
374–377.
Marumo, K.; Murai, M.
normal and tumor tissues.
Inhibition of MKP-1
Cancer Metastasis Rev. 1993, Zabransky, R.J.; Dinuzzo, A.R.;
expression potentiates JNK
12, 103–117.
Woods, G.L. Detection of
related apoptosis in renal
vancomycin resistance in
cancer cells. J. Urol. 2004,
Chikuba, K.; Yubisui, T.; Shirabe, K.;
enterococci by the alamar mic
172, 723–727.
Takeshita, M. Cloning and
system. J. Clin.Microbiol.
nucleotide sequence of a
1995, 33, 791–793. 4
Hamid, R.; Rotshteyn, Y.; Rabadi,
cDNA of the human
L.; Parikh, R.; Bullock, P.
erythrocyte NADPH-flavin
Bwanga, F.; Joloba, M.L.; Haile, M.;
Comparison of Alamar Blue
reductase. Biochem. Biophys.
Hoffner, S. Evaluation of
and MTT assays for high
Res. Commun. 1994, 198,
seven tests for the rapid
through-put screening.
1170–1176.
detection of multidrugToxicol. In Vitro 2004, 18,
resistant tuberculosis in
703–710.
Moon, T.W.; Mommsen, T.P.
Uganda. Int. J. Tuberc. Lung
Biochemistry and molecular
Dis. 2010, 14, 890–895.
Muliro S.P; Shalo P.L; Kutima P.M.
biology of fishes. Environ.
Quality assessment of raw
Toxicol. 2005, 6, 51–56.
Yajko, D.M.; Madej, J.J.; Lancaster,
camel milk using dye
M.V.; Sanders, C.A.;
reduction tests. African
Reis, R.S.; Ivan, N., Jr.; Lourenço,
Cawthon, V.L.; Gee, B.;
Journal of Food Science and
S.L.S.; Fonseca, L.S.;
Babst, A.; Hadley, W.K.
Technology Vol. 4(5). 2013.
Lourenço, M.C.S. Comparison
Colorimetric method for
116-121
of flow cytometric and Alamar
determining MICs of
Blue tests with the
antimicrobial agents for
Zhang H.X; Du G.H; Zhang J,T.
proportional method for
Mycobacterium tuberculosis.
Assay of mitochondrial
testing susceptibility of
J. Clin. Microbiol. 1995, 33,
functions by resazurinin vitro.
Mycobacterium tuberculosis
2324–2327.
ActaPharmacologicaSinica
to rifampin and isoniazid. J.
25(3). 2004. 385-389
28