71 UJI EFEK SITOTOKSIK HASIL FRAKSINASI EKSTRAK ETANOL

ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
UJI EFEK SITOTOKSIK HASIL FRAKSINASI EKSTRAK ETANOL AKAR ASAM
KANDIS (Garcinia cowa Roxb.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D
DENGAN METODA MTT
Fajar Yonny Ilhami, Fatma Sri Wahyuni, Elidahanum Husni
Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang.
ABSTRAK
Uji efek sitotoksik hasil fraksinasi ekstrak etanol akar asam kandis (Garcinia cowa
Roxb.) telah dilakukan terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro. Potensi hasil
fraksinasi ekstrak etanol akar asam kandis ini diuji dengan metode MTT. Prinsip kerja metoda
MTT adalah dengan mengukur aktivitas dehidrogenase mitokondria pada sel-sel hidup yang
memiliki kemampuan untuk mengkonversi MTT menjadi formazan. Pengujian ekstrak
fraksinasi dilakukan dari konsentrasi 0.1, 1, 10, dan 100 µg/mL. Dari pengujian yang
dilakukan diperoleh nilai IC50 ekstrak fraksi etil asetat akar asam kandis terhadap sel kanker
payudara T47D sebesar 0,52 ± 3,55 µg/mL dan fraksi air sebesar 81,44 ± 7,99 µg/mL. Hasil
analisis statistik menunjukkan bahwa fraksi etil asetat akar asam kandis (Garcinia cowa
Roxb.) mampu menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D secara signifikan pada
konsentrasi 100 µg/mL (p=0,004).
Kata kunci: Kanker payudara, Akar Asam Kandis (Garcinia cowa Roxb.), MTT.
PENDAHULUAN
Kanker pada dasarnya adalah suatu
penyakit yang ditandai dengan suatu
pergeseran pada mekanisme kontrol sel yang
mengatur proliferasi dan diferensiasi
sehingga mengakibatkan pertumbuhan sel
menjadi abnormal (Katzung, 1997). Kanker
merupakan masalah kesehatan dari banyak
negara di dunia dan termasuk penyakit yang
menjadi perhatian serius pada bidang
kedokteran. Hal ini disebabkan oleh jumlah
pasien yang terus meningkat dari tahun ke
tahun dan belum ditemukan cara yang efektif
untuk pengobatannya (Sajuthi, 2001). Di
Indonesia, kanker payudara menempati
urutan kedua setelah kanker leher rahim
(Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002).
Kanker payudara menempati urutan pertama
penyakit keganasan pada pasien rawat inap
wanita di rumah sakit (DKRI, 2009).
Pengobatan kanker payudara dengan
cara kemoterapi merupakan terapi pilihan,
akan tetapi pengobatan kanker menggunakan
agen kemoterapi cenderung menimbulkan
resistensi sel kanker yang mengakibatkan
sebagian besar kegagalan pengobatan kanker
(Staerk et al., 2002). Disamping itu, obat
antikanker yang ideal seharusnya dapat
membunuh sel kanker tanpa membahayakan
jaringan sehat. Namun sampai sekarang
belum ditemukan obat yang memenuhi
kriteria demikian. Obat antikanker yang telah
digunakan umumnya bersifat tidak selektif,
karena selain memiliki khasiat sebagai
antikanker obat tersebut juga bersifat
merusak sel-sel yang normal (Anonim,
2003). Obat antikanker yang ideal
seharusnya dapat mematikan sel kanker
tanpa membahayakan jaringan sehat.
Namun, sampai sekarang belum ditemukan
obat yang memenuhi kriteria demikian.
Karenanya, usaha penelitian terus dilakukan
untuk menemukan obat kanker yang ideal.
Salah satu sumber obat-obatan kemoterapi
yang potensial yaitu tumbuh-tumbuhan
sehingga sampai saat ini pencarian obatobatan kemoterapi dari tumbuh-tumbuhan
terus dilakukan (Sukardiman, Ekasari,
Hapsari, 2006).
Tumbuhan dari genus Guttiferae
(Garcinia) akhir-akhir ini banyak diteliti
71
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
ekstrak etanol akar asam kandis telah
mendapatkan nilai IC50 sebesar 6.06 µg/ml.
Pengujian aktivitas sitotoksik fraksi
dari ekstrak etanol akar asam kandis ini,
dilakukan secara invitro dengan metoda
Microtetrazolium (MTT) terhadap sel kanker
payudara T47D yang didasari pada
perubahan larutan reagen MTT (3-(4,5dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide) yang berwarna kuning menjadi
kristal formazan yang bewarna ungu
(Mosmann, 1983). Hasil yang diamati pada
uji ini adalah perubahan warna yang
dihasilkan akibat terbentuknya kristal
formazan.
Penelitian
ini
diharapkan
memberikan hasil yang dapat membuktikan
dan melihat dari aktivitas sitotoksin masingmasing fraksi dan hal ini dapat menunjukkan
akar asam kandis (Garcinia cowa Roxb.)
mampudijadikan
sebagai
antikanker.
kandungan dan aktivitasnya. Genus ini
dilaporkan mengandung santon, benzofenon,
triterpen, biflavonoid, benzoquinon, senyawa
α-mangostin,
cowanin,
cowanol,
cowasanton,
rubrasanton,
β-mangostin,
tetrapreniltolouquinon,
dan
santon
terprenilasi (Rukachaisirikul et.al., 2008;
Wahyuni et.al., 2004; Kenji et.al., 2003;
Peres et.al., 2000; Sadaquat et.al., 2000).
Senyawa santon terutama dikenal dengan
potensinya sebagai antikanker (Jabit et.al.,
2009). Salah satu tanaman di genus ini yang
mulai banyak diteliti yaitu Garcinia cowa
Roxb. yang dikenal dengan nama daerah
asam kandis atau kandis.
Penelitian kali ini menggunakan
fraksinasi ekstrak etanol akar asam kandis.
Hasil penelitian terdahulu oleh Lenggo
(2009) tentang uji efek sitotoksik dari
METODA PENELITIAN
ultrapurifikasi, medium Roswell Park
Memorial Institute (RPMI) 1640, Fetal
Bovine
Serum
(FBS),
PenicillinStreptomycin, Trypsin-EDTA, Phosphate
buffer Saline (PBS), dan reagen 3-(4,5dimetilthiazol- 2- il)-2,5- difeniltetrazolium
bromida (reagen MTT).
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk
ekstraksi adalah erlenmeyer berbagai ukuran,
gelas ukur, corong, spatel, botol coklat, vial,
kertas saring, rotary evaporator, dan alat
destilasi.
Alat-alat yang digunakan untuk uji
aktivitas sitotoksik berupa sarung tangan
karet, botol semprot, labu Erlenmeyer, gelas
piala, flask T-25 (Iwaki®), botol Duran,
tabung Appendorf (Iwaki®), pipet mikro
(Ecopipette®), hemasitometer, timbangan
analitik, autoklaf (Hirayama®), lemari es
(Nasional®), inkubator 370C/5% CO2
(Thermo Scientific®), microbiological safety
cabinet air flow kelas II (Thermo
Scientific®), vortex (Etech®), penangas air
(Memert®), sentrifus (Thermo Scientific®),
tabung sentrifugal, mikroskop inverted
(Zeiss®),
plat
96
sumuran,
dan
TM
spektrofotometer microplate (xMark ).
Bahan
Bahan yang digunakan untuk
fraksinasi berupa ekstrak etanol akar asam
kandis, heksan, etil asetat, dan aquadest. Sel
kanker payudara manusia T47D, dimetil
sulfoksida (DMSO), etanol 70%, air
Fraksinasi Ekstrak Etanol Akar Asam
Kandis.
Ekstrak etanol akar asam kandis
difraksinasi dengan heksan dan air dalam
corong pisah, dikocok secukupnya. Setelah
itu dibiarkan sampai terbentuk 2 lapisan
yaitu lapisan heksan dan lapisan air.
Perlakuan ini dilakukan beberapa kali
pengulangan sampai lapisan heksan terlihat
jernih sehingga diperoleh fraksi heksan.
Hasil fraksi heksan diuapkan dengan rotary
evaporator sehingga didapatkan ekstrak
kental dari fraksi tersebut. Lapisan air
kemudian difraksinasi dengan etil asetat
dilakukan beberapa kali pengulangan seperti
perlakuan diatas sehingga diperoleh fraksi air
dan fraksi etil asetat. Hasil fraksi etil asetat
diuapkan dengan rotary evaporator sehingga
didapatkan ekstrak kental. Kemudian fraksi
72
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
air di uapkan dengan rotary evaporator
sehingga di dapatkan ekstrak kental.
d. Penambahan Sel
Dibuat suspensi sel dalam medium
(jumlah dan volume terukur), campur
sempurna. Masukkan sebanyak 180 µl
suspensi ke dalam masing-masing sumur
kecuali sumur pada kolom pertama dan
terakhir. Kolom pertama dan terakhir
merupakan blanko yang hanya diisi medium,
sedangkan kolom kedua merupakan kontrol
yang diisi suspensi sel dalam medium.
Inkubasi pada suhu 370C, 5% CO2 selama 24
jam.
Kultur Sel
a. Persiapan Alat
Alat-alat yang digunakan untuk
pengujian harus dalam keadaan bersih dan
steril. Wadah plastik dipersiapkan hanya
untuk satu kali pemakaian, dan sterilitasnya
terjamin selama kemasan tidak rusak. Untuk
alat-alat berbahan gelas, wadah dicuci bersih
dan dikeringkan. Kemudian disterilkan
dengan autoklaf pada suhu 1210C tekanan 15
lbs
selama
15
menit.
Sedangkan
microbiological safety cabinet air flow kelas
II disterilkan dengan cara disemprot dengan
etanol 70% dan disinari lampu UV.
Pembuatan Larutan Uji
a. Larutan Stok
Ditimbang ekstrak sebanyak 100 mg.
Larutkan ekstrak dalam 1 ml pelarut yang
sesuai untuk mendapatkan konsentrasi
larutan 100 mg/ml. Ekstrak harus dapat larut
sempurna dalam pelarut yang digunakan.
b. Pengenceran Larutan Uji
Ke dalam 5 buah tabung appendorf
dipipet 90 µl medium. Kemudian dibuat
larutan induk dengan konsentrasi 10 mg/ml
dengan cara memipet 10 µl larutan larutan
stok kemudian dipindahkan ke dalam tabung
pertama,
aduk
sempurna.
Lakukan
pengenceran
bertingkat
dengan
cara
memindahkan 10 µl larutan uji dari tabung
pertama ke tabung kedua. Lakukan hal yang
sama untuk tabung selanjutnya sehingga
akan diperoleh larutan dengan konsentrasi
100, 10, 1 dan 0,1 µg/ml pada masingmasing sumur pada plat 96 sumuran.
b. Penyiapan Sel
Sel kanker payudara yang digunakan
yaitu sel T47D yang dikoleksi dari
Universitas Gajah Mada (UGM). Sel kanker
dikeluarkan dari freezer (-800C), dihangatkan
dalam penangas air pada suhu 370C selama
2-3 menit. Setelah mencair, sel dipindahkan
ke dalam flask yang telah berisi 10 ml media,
diinkubasi selama 3-4 jam pada suhu
370C/5% C02, kemudian diamati dibawah
mikroskop untuk melihat apakah sel melekat
di dasar flask. Medium pertumbuhan diganti
sekali dalam dua hari dan bila jumlah sel di
dalam flask mencapai 70-85%, lakukan subkultur sel.
c. Penghitungan Sel kanker
Medium
dibuang
kemudian
ditambahkan 2 ml trypsin-EDTA ke dalam
flask yang berisi kultur sel, kemudian
inkubasi 10 menit. Setelah sel memisah,
ditambahkan 3 ml medium RPMI. Ambil 10
µl suspensi sel, letakkan pada masingmasing
kotak
penghitungan
sel
hemasitometer. Lakukan penghitungan di
bawah mikroskop. Tentukan rata-rata jumlah
sel aktif yang ada untuk dapat membuat
suspensi 2000 sel dalam setiap sumur pada
plat 96 sumuran.
Uji Sitotoksik masing-masing fraksi (Uji
MTT)
a. Peletakan Larutan Uji
Plat uji yang berisi sel dan telah
diinkubasi selama 24 jam. Setiap bagian
dirancang untuk empat kali replikasi.
Peletakan larutan uji dimulai dari konsentrasi
paling rendah. Pindahkan 20 µl larutan uji ke
dalam masing-masing sumur uji. Ke dalam
sumur kontrol masukkan 20 µl media, dan
blanko hanya diisi dengan 200 µl media. Plat
kembali diinkubasi selama 24 jam dalam
inkubator 370C/ 5% CO2. Amati perubahan
yang terjadi pada sel selama masa inkubasi.
73
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
b. Peletakan Larutan MTT
Larutan MTT 5 mg/ml dipipet 50 µl
ke dalam masing-masing sumur. Kemudian
inkubasi selama 3-4 jam pada 370C, 5% CO2.
Setelah 3-4 jam, akan terlihat adanya
endapan ungu kristal formazan. Medium
yang mengandung reagen MTT dibuang
dengan cara dihisap dari setiap sumur,
sehingga yang tertinggal hanya endapan
ungu kristal formazan. Larutkan endapan
pada setiap sumur dengan 100 µl DMSO.
Ukur serapannya dengan spektrofotometer
micrroplate pada λ 550 nm.
Hubungan antara log konsentrasi
larutan uji dengan viabilitas sel dapat
ditampilkan dalam bentuk grafik. Dari grafik
tersebut dapat ditentukan harga IC50 dengan
persamaan regresi linier dengan syarat r
lebih besar dari r tabel, kemudian masukan y
= 50% pada persamaan regresi linier (Y=
AX+B) dan cari x nya kemudian dihitung,
antilog dari konsentrasi tersebut sehingga
diperoleh IC50 (konsentrasi yang dapat
menghambat 50% pertumbuhan sel) larutan
uji (CCRC, 2009).
Selanjutnya, data hubungan antara
konsentrasi sediaan uji dengan absorban
dianalisis secara statistik menggunakan
analisa varian (ANOVA) satu arah yang
dilanjutkan dengan uji wilayah berganda
Duncan (Duncan’s Multiple Range Test).
Analisis Data
Dengan menggunakan data absorban
yang diperoleh dari pengukuran, dapat
ditentukan persentase sel yang terhambat
dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
HASIL DAN DISKUSI
didapatkan dengan jumlahnya yaitu fraksi
heksan 0 gram, fraksi etil asetat 0,98 gram
dan fraksi air 4,14 gram.
Hasil
Dari 40,5 g sampel ekstrak kental etanol akar
asam
kandis , kemudian difraksinasi
berdasarkan tingkat kepolarannya sehingga
didapatkan 2 fraksi yang seharusnya 3 fraksi
Hasil perhitungan terhadap nilai % viabilitas
pada fraksi etil asetat dan fraksi air :
Tabel 1. Persen Viabilitas Sel yang Diuji dengan Fraksi Etil Asetat
% Viabilitas Sel
Konsentrasi
Pengulangan 1
Pengulangan 2
Pengulangan 3
100
2,09
4,36
23,88
10
16,93
53,60
46,90
1
61,42
67,18
84,56
0,1
57,35
78,76
52,79
Tabel 2. Persen Viabilitas Sel yang Diuji dengan Fraksi Air
% Viabilitas Sel
Konsentrasi
Pengulangan 1
Pengulangan 2
100
118,13
84,21
10
117,70
99,64
1
58,61
56,97
0,1
76,78
46,69
74
Pengulangan 3
90,43
115,65
57,75
76,14
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
IC50 (Inhibitory Concentrasion) rata-rata dari 3 pengulangan pada fraksi etil asetat adalah:
0,52 µg/ml dan pada fraksi air adalah : 81,14 µg/ml.
Grafik hubungan Konsentrasi fraksi etil asetat dengan
%viabilitas sel kanker payudara T47D
80
% viabilitas
70
60
50
40
rata-rata
pengulang
an
30
20
10
0
-20
0
20
40
60
80
100
120
konsentrasi µg/ml
Gambar 1.
Grafik hubungan antara konsentrasi dengan % viabilitas fraksi etil asetat akar
asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D. Konsentrasi hambat (IC50)
didapat dari grafik dengan persamaan regresi log konsentrasi vs % viabilitas sel.
Data ditampilkan dalam rata-rata ± SD (n=3).
Grafik hubungan Konsentrasi fraksi air dengan
%viabilitas sel kanker payudara T47D
120
% Viabilitas
100
80
60
40
rata-rata
pengulangan
20
0
-20
0
20
40
60
80
100
120
konsentrasi µg/ml
Gambar 2.
Grafik hubungan antara konsentrasi dengan % viabilitas fraksi air akar asam
kandis terhadap sel kanker payudara T47D. Konsentrasi hambat (IC50) didapat
dari grafik dengan persamaan regresi log konsentrasi vs % viabilitas sel. Data
ditampilkan dalam rata-rata ± SD (n=3).
75
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
Dari hasil uji MTT diketahui bahwa
fraksi etil asetat akar asam kandis memiliki
nilai IC50 0,52 µg/ml sedangkan fraksi air
akar asam kandis juga memiliki nilai IC50
81,14 µg/ml. Nilai IC50 (konsentrasi yang
dapat menghambat 50% pertumbuhan sel)
didapatkan dengan menghitung persamaan
regresi linear (Y=A+Bx) dari grafik antara
log konsentrasi vs % viabilitas sel dimana
syarat r lebih besar dari r tabel dan nilai r2
dikatakan linear jika mendekati 1, kemudian
masukan y = 50% pada persamaan regresi
linier dan cari x nya kemudian dihitung,
antilog dari konsentrasi tersebut sehingga
diperoleh IC50 (CCRC, 2009).
Menurut The American National
Cancer Institute, suatu ekstrak dikatakan
memiliki aktivitas sitotoksik apabila nilai
IC50 < 20 µg/ml (Lee & Houghton, 2005).
Dengan demikian fraksi etil asetat akar asam
kandis dinyatakan memiliki aktivitas
sitotoksik terhadap sel kanker T47D. Nilai
0,52 merupakan angka hasil rata-rata dari
tiga kali pengulangan pengerjaan pada
masing-masing uji sitotoksik dengan
menggunakan fraksi etil asetat akar asam
kandis. Sedangkan pada fraksi air
didapatkan nilai IC50 sebesar 81,14.
Pembahasan
Pada penelitian ini, sampel yang
digunakan yaitu ekstrak etanol akar asam
kandis (Garcinia cowa Roxb.) yang telah
tersedia di Laboratorium Sentral Fakultas
Farmasi, Universitas Andalas, Padang
dengan jumlah sebanyak 40,5 gram.
Sebelumnya telah dilakukan penelitian
mengenai uji sitotoksik dari ekstrak etanol
akar asam kandis dengan nilai IC50 6,06
µg/ml (Lenggo, 2013). Dari pemeriksaan
metabolit yang telah dilakukan oleh peneliti
sebelumnya, diketahui bahwa akar asam
kandis mengandung senyawa fenolik.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
efek sitotoksik dari hasil fraksinasi ekstrak
etanol akar asam kandis secara in-vitro.
Keuntungan dari pengujian secara in-vitro ini
adalah senyawa yang digunakan untuk
pengujian ini relatif sedikit, kemudian waktu
yang diperlukan lebih singkat dan dapat
memberikan informasi mengenai efeknya
secara langsung terhadap sel manusia yang
telah di kultur. Uji in-vitro ini dilakukan
terhadap sel kanker payudara manusia dan
sel kanker payudara yang digunakan pada
penelitian ini yaitu sel T47D.
KESIMPULAN
untuk dikembangkan sebagai sumber baru
dalam mengembangkan obat kanker.
Saran
Disarankan
kepada
peneliti
selanjutnya agar dapat melakukan isolasi
terhadap fraksi etil asetat akar asam kandis
(Garcinia cowa Roxb.) untuk menyelidiki
senyawa aktif antikanker yang murni pada
fraksi tersebut yang bersifat sitotoksik dan
juga untuk melakukan perubahan dalam
variasi waktu inkubasi.
Kesimpulan
Dari hasil penelitian, dapat diambil
kesimpulan bahwa fraksi etil asetat memiliki
efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara
T47D dengan nilai IC50 0.52 µg/ml,
sedangkan fraksi air tidak memiliki efek
sitotoksik terhadap sel kanker payudara
T47D dengan nilai IC50 81.14 µg/ml.
Berdasarkan data hasil penelitian yang telah
dilakukan, dapat diambil kesimpulan bahwa
fraksi etil asetat akar asam kandis berpotensi
76
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
DAFTAR PUSTAKA
1. CCRC. (2009). Prosedur Tetap Uji
Sitotoksik Metode MTT. Yogyakarta:
Fakultas Farmasi, UGM.
2. Departemen Kesehatan. (2009). Profil
Kesehatan Indonesia 2008. Jakarta:
Departemen Kesehatan RI.
3. Jabit, Md. Lip, Wahyuni, F.S, Rozida, K.,
Ahmad, I.D., Khozirah, S., Lajis
Nordin H, & Johnson, S. (2009).
Cytotoxic and nitric oxide inhibitory
activities of methanol extracts of
Garcinia species. Pharmaceutical
Biology. 47(11): 1019–1026
4. Lee, C.C & Houghton, P. (2005).
Cytotoxicity of plants from Malaysia
and Thailand used traditionally to
treat cancer. J Ethnopharmacol, 2005;
100: 237-243.
5. Lenggo, S.(2013). Uji Efek Sitotoksik
Fraksinasi Ektrak Etanol Akar Asam
Kandis (Garcinia cowa Roxb.)
Terhadap Sel Kanker Payudara T47D
Dengan Metoda MTT. (Skripsi).
Padang. F.Farmasi,UNAND.
6. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric
assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and
cytotoxicity assays. Journal of
Immunological Method, 16;65(1-2),
55-63.
7. Tjindarbumi, D dan Mangunkusumo, R.
(2002). Cancer in Indonesia: Present
and Future. Jpn. J. Clin. Oncol. 32,
S17-S21.
8. Wahyuni, F.S., Byrne, L.T., Dachriyanus,
Dianita, R., Jubahar, J., Lajis, N.H., &
Sargent, M.V., (2004). A New RingReduced Tetraprenyltoluquinone and
a prenylated xanthone from Garcinia
cowa. Aust. J. Chem. 57: 223-226
77