UJI EFEK SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH ASAM

Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, Vol. 16, No.2, 2011, halaman 209-215
ISSN : 1410-0177
UJI EFEK SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH ASAM KANDIS
(Garcinia cowa Roxb.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D DENGAN
METODA MTT (MICROTETRAZOLIUM) ASSAY
Fatma Sri Wahyuni, Suci Sutma, Yufri Aldi
Fakultas Farmasi Universitas Andalas
ABSTRACT
The evaluation of cytotoxic effect on ethanolic extract from the fruit rinds of asam
kandis (Garcinia cowa Roxb.) on T47D human breast cancer cells in vitro had been
evaluated. The cytotoxic effect was carried out by using MTT assay. Extraction of dried fruit
rinds of G. cowa Roxb. was macerated with ethanol 70%. The extract was prepared into 4
concentration groups, 100, 10, 1, and 0,1 µg/ml. Results showed that the IC50 of G. cowa
Roxb. ethanolic extract was 19,33 µg/ml ± 1,15 on breast cancer T47D cells. The percentage
of cells viability and concentration were analyzed analyzed by the two-way analysis of
variance (ANOVA) followed by Duncan test. Result showed that the ethanolic extract of G.
cowa Roxb gave a significant effect on T47D breast cancer cells viability (P<0.05).
Keywords: cytotoxic effect, asam kandis, Garcinia cowa Roxb.,T47D, MTT Assay
PENDAHULUAN
Tanaman asam kandis memiliki
aktivitas biologis dan farmakologis yang
bervariasi, seperti sitotoksik, antiinflamasi,
antimikroba, antifungi, dan antioksidan
(Mahabusarakam, Chairerk, and Taylor,
2004). Tanaman asam kandis ini telah
digunakan oleh masyarakat, baik berupa
buah, daun, akar, dan kulit batangnya
dalam berbagai bidang. Di Thailand buah
dari asam kandis dapat digunakan sebagai
ekspektoran,
laksatif,
dan
untuk
memperbaiki sirkulasi darah. Akarnya
dapat digunakan sebagai penurun panas
dan kulit batangnya sebagai antipiretik dan
antimikroba, sedangkan ekstrak kasar dari
daun asam kandis ini dalam pengobatan
tradisional di Thailand sudah digunakan
sebagai antitumor (Mahabusarakam, et al.,
2004). Di Indonesia, asam kandis
merupakan tanaman yang digunakan
sebagai bumbu masak, terutama di
Sumatera Barat.
Dari berbagai penelitian diketahui
bahwa tanaman asam kandis mengandung
santon, santon terprenilasi, maupun santon
tertetraoksigenasi pada hampir semua
bagiannya seperti pada akar, batang, kulit
batang, daun, buah dan getahnya
(Wahyuni et al., 2004; Mahabusarakam et
al., 2004; Shen and Yang, 2005; Panthong
et al., 2006; Darwati et al, 2010). Telah
ditemukan bahwa santon dan santon
terpenilasi menunjukkan potensi sitotoksik
yang kuat sehingga dapat dijadikan
sebagai agen sitotoksik baru yang
potensial (Jabit et al., 2009).
Insidensi kanker payudara di
negara berkembang semakin meningkat
dari tahun ke tahun (Yaar et al., 2007).
Insidensi kanker payudara di Indonesia
Fatma S., et al.
belum diketahui secara pasti karena belum
ada registrasi kanker berbasis populasi
(Sirait, Oemiati, dan Indrawati, 2009).
Menurut data Sistem Informasi Rumah
Sakit (SIRS) di Indonesia tahun 2007
diketahui
bahwa
kanker
payudara
menempati urutan pertama penyakit
keganasan pada pasien rawat inap wanita
di rumah sakit (Departemen Kesehatan RI,
2009).
Pengobatan
kanker
dilakukan
dengan empat cara utama yaitu melalui
pembedahan, radiasi, kemoterapi dan
terapi biologi (Dipiro, et al., 2009).
Penggunaan kemoterapi antikanker belum
memberikan hasil yang optimal karena
bekerja tidak spesifik sehingga dapat
merusak
sel
normal.
Pembedahan
umumnya tidak efektif lagi untuk sel yang
telah mengalami metastasis. Penyinaran
sering kali tidak selektif dan tidak aman
untuk sel-sel normal (Supardjan dan
Meiyanto, 2002).
Obat antikanker yang ideal
seharusnya dapat mematikan sel kanker
tanpa membahayakan jaringan sehat.
Namun, sampai sekarang belum ditemukan
obat yang memenuhi kriteria demikian.
Karenanya,
usaha
penelitian
terus
dilakukan untuk menemukan obat kanker
yang ideal. Salah satu sumber obat-obatan
kemoterapi yang potensial yaitu tumbuhtumbuhan sehingga sampai saat ini
pencarian obat-obatan kemoterapi dari
tumbuh-tumbuhan
terus
dilakukan
(Sukardiman, Ekasari, Hapsari, 2006).
METODE PENELITIAN
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk uji
aktivitas sitotoksik berupa sarung tangan
karet, botol semprot, labu Erlenmeyer,
gelas piala, flask culture (Iwaki®), botol
Duran,
mikrotube,
pipet
mikro
J. Sains Tek. Far., 16(2), 2011
(Ecopipette®), mikrotube, hemasitometer,
timbangan analitik, autoklaf (Hirayama®),
lemari es (Sharp®), inkubator 370C/5%
CO2 (Thermo Scientific®), microbiological
safety cabinet air flow kelas II (Thermo
Scientific®), vortex (Ika®), penangas air
(Memert®), sentrifus (Thermo Scientific®),
tabung sentrifus (Iwaki®), mikroskop
inverted (Zeiss®), microplate 96 well
(Iwaki®), dan spektrofotometer microplate
(xMarkTM).
Bahan
Bahan yang digunakan yaitu kulit buah
asam kandis yang didapat dari daerah
Toboh Ketek, Padang Pariaman, Sumatera
Barat. Bahan yang digunakan untuk uji
efek sitotoksik yaitu sel kanker payudara
manusia T47D diperoleh dari koleksi
Laboratorium
Parasitologi
Fakultas
Kedokteran Hewan, Universitas Gajah
Mada, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol
70%, air ultrapurifikasi, medium Roswell
Park Memorial Institute (RPMI) 1640
(Gibco®), Fetal Bovine Serum (FBS,
Gibco®),
Penicillin-Streptomycin
®
(Gibco ),
Tripsin-EDTA
(Gibco®),
Phosphate buffer Saline (PBS, Gibco®),
dan reagen MTT [3-(4,5- dimetilthiazol- 2il)-2,5difeniltetrazolium
bromida]
®
(Sigma ).
Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Asam
Kandis
Kulit basah asam kandis dipisahkan dari
daging
buahnya,
dibersihkan
dan
dikeringkan. Sampel dimasukkan ke dalam
beberapa wadah gelas berwarna gelap dan
dimaserasi dengan etanol 70% selama 5
hari sambil sekali-sekali diaduk. Maserasi
dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.
Hasil maserasi diuapkan pelarutnya
dengan alat rotari evaporator sehingga
diperoleh ekstrak kental etanol.
Fatma S., et al.
Uji Sitotoksisitas Ekstrak (MTT Assay)
Dibuat suspensi sel yang mengandung
2x103 sel/180 μl medium kultur. Sebanyak
180 μl suspensi yang berisi sel kanker
T47D dimasukkan ke dalam masingmasing sumuran microplate 96 well
kemudian diinkubasi selama 24 jam di
inkubator 370C/5% CO2 untuk beradaptasi
dan menempel di sumuran.Setelah itu
ditambahkan ekstrak etanol kulit buah
asam kandis dengan konsentrasi 100, 10, 1
dan 0,1 μg/ml dan diinkubasi selama 24
jam di inkubator 370C/5% CO2.
Selanjutnya, ke dalam setiap well plate
ditambahkan 20 µl larutan MTT 5 mg/ml
dan microplate diinkubasikan di inkubator
370C/5% CO2. Setelah 4 jam, larutan
dipipet
dan
ke
dalam
sumuran
ditambahkan 100 μl DMSO untuk
melarutkan kristal formazan. Absorbansi
kemudian dibaca dengan menggunakan
spektrofotometer microplate pada λ 550
nm. Pengujian masing-masing dengan 3
ulangan kontrol sel dan kontrol media.
Analisis Data
Dengan menggunakan data absorban yang
diperoleh
dari
pengukuran,
dapat
ditentukan persentase sel yang terhambat
dengan menggunakan rumus sebagai
berikut:
Absorban sel uji – Absorban blanko
% Viabilitas=
X
Absorban
k
ontrol
Absornasi
blanko
100%
Absornasi blanko
Hubungan antara konsentrasi larutan uji
dengan viabilitas sel dapat ditampilkan
dalam bentuk grafik. Dari grafik tersebut
dapat ditentukan harga IC50 (konsentrasi
J. Sains Tek. Far., 16(2), 2011
yang
dapat
menghambat
50%
pertumbuhan sel) larutan uji. Selanjutnya,
data hubungan antara konsentrasi sediaan
uji dengan absorban dianalisis secara
statistik menggunakan analisa varian
(ANOVA) satu arah yang dilanjutkan
dengan uji wilayah berganda Duncan
(Duncan’s Multiple Range Test).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Berdasarkan uji MTT yang telah dilakukan
diketahui bahwa ekstrak etanol kulit buah
asam kandis memiliki nilai dengan IC50
19,33 µg/ml. Penurunan persentase
viabilitas
sel
meningkat
seiring
peningkatan konsentrasi ekstrak etanol
kulit buah asam kandis. Pada konsentrasi
0,1 µg/ml diperoleh rata-rata persen
viabilitas ± SE dengan nilai 90.0616575 ±
4.8259, konsentrasi 1 µg/ml diperoleh
81.5196925 ± 4.244, konsentrasi 10 µg/ml
diperoleh 59.9005692 ± 4.4494, dan
konsentrasi
100
µg/ml
diperoleh
19.2525442 ± 2.1758. Dari hasil
pengolahan data dengan uji Analisa Varian
(Anova) satu arah antara persentase
viabilitas sel kanker payudara T47D
dengan konsentrasi sediaan uji didapat
nilai signifikan 0,000 (P < 0,05) dan nilai
F hitung 60,725 > F tabel 2,82, sedangkan
hasil
pengolahan
data
lanjutan
menggunakan uji wilayah berganda
duncan menunjukkan tiga subset yang
berbeda yaitu kelompok konsentrasi 100
µg/ml, kelompok konsentrasi 10 µg/ml,
dan kelompok konsentrasi 1 dan 0,1
µg/ml.
Hasil foto sel memperlihatkan morfologi
sel yang berbeda antara sel yang diberi
perlakuan dengan ekstrak uji dengan
Fatma S., et al.
J. Sains Tek. Far., 16(2), 2011
konsentrasi
100
dan
10
μg/ml
dibandingkan
dengan
sel
kontrol.
Sedangkan pada sel uji yang diberi
perlakuan dengan ekstrak uji dengan
konsentrasi 1 dan 0, 1 μg/ml tidak
memperlihatkkan morfologi sel yang
berbeda.
pengujian secara in-vitro yaitu senyawa
yang digunakan untuk pengujian relatif
sedikit, waktu yang diperlukan relatif cepat
dan dapat memberi informasi tentang efek
secara langsung pada sel manusia. Uji invitro dilakukan terhadap
Pembahasan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
efek sitotoksik ekstrak etanol kulit buah
asam kandis secara in-vitro. Keuntungan
Parameter
IC50
Pengujian 1
18 µg/ml
Pengujian 2
20 µg/ml
Pengujian 3
20 µg/ml
Rata-rata
19,33 µg/ml
SD
1,15
Gambar 1. Pengaruh ekstrak etanol kulit buah asam kandis terhadap sel kanker payudara
T47D. Konsentrasi hambat (IC50) diukur dengan menggunakan metoda MTT. Data
ditampilkan
dalam
rata-rata
±
SD
(n=3)
A
B
Fatma S., et al.
C
J. Sains Tek. Far., 16(2), 2011
D
Gambar 2.
Foto mikroskopis sel kanker payudara T47D yang diberi perlakuan dengan ekstrak etanol
kulit buah asam kandis dengan konsentrasi A= 100 µg/ml ; B= 10 µg/ml ; C= 1 µg/ml ; D=
0,1 µg/ml pada perbesaran 10x
Selain itu, mereka menunjukkan tingkat
homogenitas yang relatif tinggi dan mudah
diganti dengan sel yang beku (frozen
stock) jika sel yang digunakan tidak layak
dipakai lagi, misalnya karena kontaminasi.
E
Gambar 3.
Foto mikroskopis sel kanker payudara
T47D yang tidak diberi perlakuan dengan
ekstrak kulit buah asam kandis (kontrol)
dengan perbesaran 10x
sel kanker payudara. Sel kanker payudara
yang digunakan pada penelitian ini yaitu
sel T47D. Sel kanker payudara T47D
merupakan sel yang sensitif terhadap agen
kemoterapi dan memiliki kemampuan
replikasi yang cepat sehingga sangat cocok
digunakan
untuk
uji
sitotoksik.
Keuntungan penggunaan lini sel pada
pengujian yaitu mereka mudah ditangani
dan dapat mereplikasi diri tanpa batas.
Metoda uji yang digunakan yaitu uji MTT
dimana uji MTT merupakan suatu metoda
uji sitotoksik secara kolorimetri untuk
menentukan jumlah sel yang hidup
berdasarkan perubahan larutan MTT yang
berwarna kuning menjadi kristal formazan
yang berwarna ungu oleh mitokondria
yang aktif pada sel hidup. MTT diabsorpsi
ke dalam sel hidup dan dipecah melalui
reaksi reduksi oleh enzim reduktase dalam
rantai respirasi mitokondria menjadi
formazan yang tidak larut dalam air.
Intensitas warna ungu yang terbentuk
berbanding lurus dengan jumlah sel yang
aktif melakukan metabolisme. Semakin
tajam warna yang dibentuk, maka akan
semakin tinggi nilai absorban, dan
semakin banyak sel yang hidup
(Mosmann, 1983).
Fatma S., et al.
Metoda MTT memberikan hasil pengujian
yang akurat karena dapat memberikan
hubungan antara jumlah sel yang aktif
dengan absorban yang diperoleh dari
pengukuran yang digunakan untuk
menentukan nilai IC50. IC50 (Inhibitory
Concentration)
merupakan
nilai
konsentrasi yang menghasilkan hambatan
proliferasi sel sebesar 50%. Nilai IC50
dapat menunjukkan potensi suatu senyawa
sebagai sitotoksik (Melannisa, 2004).
Menurut The American National Cancer
Institute, suatu ekstrak dikatakan memiliki
aktivitas sitotoksik apabila nilai IC50 < 20
µg/ml (Lee & Houghton, 2005). Dari hasil
uji MTT diketahui bahwa ekstrak etanol
kulit buah asam kandis memiliki IC50
19,33 µg/ml. Dengan demikian, ekstrak
etanol kulit buah asam kandis dikatakan
memiliki aktivitas sitotoksik. Dari uji
Analisa Varian (Anova) hubungan antara
konsentrasi ekstrak etanol kulit buah asam
kandis dengan persentase viabilitas
didapatkan nilai P 0,000 < 0,05 dan F
hitung 60, 725 > F tabel 2,82. Artinya,
pemaparan ekstrak etanol kulit buah asam
kandis memberikan pengaruh secara nyata
terhadap persentase viabilitas sel kanker
payudara T47D.
Untuk mengetahui perbedaan dari setiap
variasi konsentrasi terhadap persentase
viabilitas, pengolahan data dilanjutkan
dengan uji wilayah berganda Duncan. Dari
hasil uji wilayah berganda Duncan
terdapat tiga kelompok subset yang
menunjukkan terdapat tiga kelompok
konsentrasi yang memberikan perbedaan
yang nyata terhadap persentase viabilitas,
yaitu kelompok konsentrasi 100 µg/ml,
kelompok konsentrasi 10 µg/ml, dan
kelompok konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml.
J. Sains Tek. Far., 16(2), 2011
Namun,
tidak
terdapat
perbedaan
persentase viabilitas yang nyata antara
variasi konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml.
KESIMPULAN
Ekstrak etanol kulit buah asam kandis
(Garcinia cowa Roxb.) memiliki efek
sitotoksik terhadap sel kanker payudara
T47D dengan IC50 19,33 µg/ml.
Peningkatan konsentrasi ekstrak etanol
kulit
buah
asam
kandis
dapat
mempengaruhi persentase viabilitas sel
kanker payudara T47D secara nyata (P <
0,05) pada kelompok konsentrasi 100
µg/ml, kelompok konsentrasi 10 µg/ml,
dan kelompok konsentrasi 1 dan 0,1
µg/ml.
DAFTRA PUSTAKA
Darwati, Husen H. Bahti, Dachriyanus, &
Supriyatna. (2010). Santon Terpenilasi
Aktif Antioksidan dari Kulit Batang
Garcinia cowa Roxb. J. bionatura. 11,
129-136.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia,
(2009). Profil kesehatan Indonesia
2008. Jakarta: Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.
Dipiro, Joseph., Talbert, Robert L., Yee, Gary
C., Matzke, Gary R., Wells, Barbara
G. & Posey, L. Michael. (2009).
Pharmacotherapy:
A
Pathophysiologic Approach Seventh
Edition.
The
McGraw-Hill
Companies: United States of America.
Jabit, Md. Lip, Wahyuni, F.S, Rozida, K.,
Ahmad, I.D., Khozirah, S., Lajis
Nordin H, & Johnson, S. (2009).
Cytotoxic and nitric oxide inhibitory
activities of methanol extracts of
Garcinia species. Pharmaceutical
Biology. 47(11): 1019–1026.
Fatma S., et al.
Lee, C.C & Houghton, P. (2005). Cytotoxicity
of plants from Malaysia and Thailand
used traditionally to treat cancer. J
Ethnopharmacol, 2005; 100: 237-243.
Mahabusarakam, W ., Chairerk, P., & Taylor,
W.C. (2004). Xanthones from
Garcinia
cowa
Roxb.
latex.
Phytochemistry. 66 (2005) 1148–1153
Melannisa, R. (2004). Pengaruh PGV-1 pada
Sel Kanker Payudara T47D yang
diinduksi
17β-Estradiol:
Kajian
Antiproliferasi, Pemacuan Apoptosis
dan
Antiangiogenesis,
(Tesis).
Program Pasca Sarjana Universitas
Gadjah Mada, Yogyakarta.
Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric
Assay for Cellular Growth and
survival: Application to Proliferation
and Cytotoxicity Assays. J. Immunol.
Methods, 65 (1-2), 55-63.
Panthong, K., Pongcharoen, W., Phongpaichit,
S., & Taylor, W.C. (2006).
Tetraoxygenated xanthones from the
fruits
of
Garcinia
cowa.
Phytochemistry. 67 (2006) 999–1004
Shen, Jie & Yang, Jun-Shan, (2005). Two
New Xanthones from the Stems of
Garcinia cowa. Chem. Pharm. Bull.
54(1) 126—128 (2006) Vol. 54, No. 1
Sirait, A.M., Oemiati, R., & Indrawati, L.
(2009). Hubungan Kontrasepsi Pil
dengan Tumor/Kanker Payudara di
Indonesia.
Majalah
Kedokteran
Indonesia Volum: 59, Nomor: 8,
Agustus 2009
Sukardiman, Ekasari, W., & Hapsari, P.P.
(2006). Aktivitas Antikanker dan
Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform
Daun Pepaya (Carica papaya L.)
terhadap Kultur Sel Kanker Myeloma.
Media kedokteran hewan. vol. 22, No.
2, Mei 2006
Supardjan, A.M. & Meiyanto, E., (2002). Efek
antiproliferatif pentagamavunon- 0
terhadap beberapa sel kanker.
Yogyakarta: Lembaga Penelitian
Universitas Gadjah Mada.
J. Sains Tek. Far., 16(2), 2011
Wahyuni, F.S., Byrne, L.T., Dachriyanus,
Dianita, R., Jubahar, J., Lajis, N.H., &
Sargent, M.V., (2004). A New RingReduced Tetraprenyltoluquinone and a
prenylated xanthone from Garcinia
cowa. Aust. J. Chem. 57: 223-226.
Yaar, Mina, Eller, Mark S., Panova, I.,
Kubera, J., Wee, Lee H., Cowan,
Kenneth H., & Gilchrest, B.A. (2007).
Telomeric DNA induces apoptosis and
senescence of human carcinoma cells.
Breast Cancer Research, 9, R13.