envelope protein VP28 gene is widely used because its ability to

ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI PROTEIN PERMUKAAN VP28
White Spot Syndrome Virus (WSSV) PADA UDANG WINDU (Penaeus monodon
Fabricius, 1798)
Asmi Citra Malina1, Andi Aliah Hidayani1 dan Andi Parenrengi2
Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar1
Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau, Maros 2
[email protected], [email protected]
Abstract
White Spot Syndrome (WSS) is a viral disease which affects most of the commercially
cultivated marine shrimp species all over the world causing significant losses. White spot
syndrome virus (WSSV) envelope protein VP28 gene is widely used because its ability to
bind to the surface of shrimp epithelial cells and might promote innate immune recognition of
WSSV. Its recombinant protein was expressed in various expression systems and used as
recombinant vaccine or immunostimulant to increase shrimp survival against WSSV. This
research was aimed to isolate and characterize gene encoding envelope protein VP28 WSSV
from black tiger shrimps (Penaeus monodon Fabr). The genomic of DNA were isolated from
pleopods, periopods and tails of black tiger shrimp using DTAB-CTAB method. Isolation of
gene encoding envelope protein VP28 WSSV ws successfully performed with the results of
the length of DNA fragment was 672 bp. The results of homology analysis using BLASTn
homology suggested that these isolates genes from Takalar have closest relationship with
isolates from India.
Abstrak
Penyakit merupakan kendala terbesar yang dihadapi dalam budidaya udang windu (Penaeus
monodon). White Spot Syndrome Virus (WSSV) merupakan patogen yang paling serius
menyerang udang windu dan telah menghancurkan industri udang windu di berbagai negara.
Pencegahan penyakit udang windu termasuk WSS dapat dilakukan melalui penggunaan
immunostimulan dan vaksin. Protein dari WSSV dalam hal ini Viral Protein (VP) 28
diketahui terlibat dalam infeksi sistemik pada udang dan dapat menstimulasi munculnya
sistem kekebalan pada udang windu sehingga dapat digunakan sebagai vaksin rekombinan
maupun imunostimulan. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi
gen penyandi protein struktural VP28 WSSV pada udang windu. Genom DNA diisolasi dari
kaki renang, kaki jalan dan ekor menggunakan metode DTAB-CTAB. Isolasi gen penyandi
protein permukaan VP 28 berhasil dilakukan dengan hasil panjang fragmen 672 bp. Hasil
homologi antar sampel yang memiliki kekerabatan terdekat yaitu 99,406%. Hasil analisis
homologi dengan gene bank menggunakan kesejajaran lokal pada BLASTn menunjukkan
bahwa homologi sampel gabungan memiliki kekerabatan yang paling dekat dengan isolat dari
India.
Keywords:
Udang windu; penyakit; WSSV; VP28.
Pendahuluan
Budidaya udang di Indonesia mulai dilakukan secara intensif pada periode tahun
1980-an. Udang yang dibudidayakan saat itu adalah udang windu (Penaeus monodon). Pada
akhir tahun 1990-an terjadi kegagalan panen yang cukup besar di berbagai tambak di
Indonesia. Penyebab utama kegagalan panen tersebut adalah serangan penyakit viral yang
disebabkan antara lain oleh monodon baculo virus (MBV) dan white spot syndrome virus
(WSSV) (Sukenda, 2009).
WSSV merupakan patogen yang paling serius menyerang udang windu dan telah
menghancurkan industri udang windu di berbagai negara. Virus ini sangat ganas dan sangat
sulit dihentikan. WSSV pertama kali muncul di Taiwan pada tahun 1992. Kemudian
menyebar dengan cepat ke daerah-daerah utama produsen udang dan menyerang populasi
udang alam di Asia, Amerika Selatan, Amerika Tengah, dan negara-negara bagian selatan
Amerika Serikat (Rajendran et al., 1999).
Udang yang terserang penyakit ini menunjukkan tanda adanya bercak putih di seluruh
tubuhnya, dari karapas hingga pangkal ekor. Penyebab penyakit bercak putih viral adalah
WSSV, yang termasuk keluarga Nimaviridae (Murdjani, 2007). Beberapa pencegahan dalam
penyakit udang windu termasuk WSSV, yaitu penggunaan immunostimulan dan penggunaan
vaksin. Diketahui beberapa gen mayor yang terdapat pada virus WSSV adalah VP15, VP19,
VP24, VP26, dan VP28. Protein dari virus dalam hal ini VP28 diketahui terlibat dalam
infeksi sistemik pada udang dan dapat menstimulasi munculnya sistem kekebalan pada udang
windu. VP 28 juga dilaporkan berada pada permukaan virion dan terlibat dalam keterikatan
ke dalam sel (Sriwulan dan Irmawati, 2006).
Viral protein 28 diketahui merupakan protein yang terlibat dalam infeksi organ-organ
penting udang sehingga protein ini dapat digunakan sebagai vaksin untuk meningkatkan
ketahanan tubuh udang terhadap WSSV. Hingga saat ini produksi vaksin rekombinan VP28
WSSV belum pernah dilakukan di Indonesia. Oleh karena itu penelitian mengenai isolasi dan
karakterisasi gen penyandi protein permukaan VP28 WSSV pada udang windu sangat
diperlukan sebagai bahan informasi dasar dalam pembuatan imunostimulan dan vaksin
sebagai usaha pencegahan penyakit virus WSSV.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen penyandi
protein struktural VP28 WSSV pada udang windu yang berasal dari daerah Kab. Takalar,
Sulawesi Selatan.
Materi dan Metode
a) Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah udang windu (P.monodon). Jumlah
sampel yang digunakan tiga sampel, yaitu : sampel A (kode sampel 25 dengan bobot 7gr),
sampel B (kode sampel 26 dengan bobot 15gr) dan sampel C (kode sampel 30 dengan bobot
± 10gr). Bagian yang diambil adalah kaki renang, kaki jalan dan sebagian ekor. Sampel ini
diperoleh dari Instalasi Tambak Percobaan Balai Penelitian Perikanan Budidaya Air Payau di
Takalar. Selanjutnya sampel dibawa ke Laboratorium Bioteknologi Balai Penelitian dan
Pengembangan Budidaya Air Payau (BPPBAP).
b)
Ekstraksi DNA Udang Windu yang Terinfeksi WSSV
Ekstraksi genom DNA udang windu diisolasi mengacu pada metode DTAB – CTAB
adalah sebagai berikut :
-
-
-
-
c)
Sampel udang windu yang digunakan adalah campuran bagian kaki renang, kaki jalan
dan ekor. Kaki renang, kaki jalan dan ekor ditimbang sekitar 20 mg kedalam tube
berukuran 2 µl berisi 0,6 µl solution.
Sampel yang berada didalam tube kemudian ditumbuk.
Selanjutnya sampel diinkubasi pada water bath bersuhu 75˚c selama 5 menit
kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Sampel divortex sebentar kemudian tambahkan 0,7 µl kloroform, vortex lagi sekitar
20 detik dan disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.
Selanjutnya bagian atas dipindahkan ke tube baru ukuran 2 µl, setelah itu
ditambahkan 100 µl larutan CTAB solution dan 900 µl ddH2O, vortex sebentar,
kemudian inkubasi dalam water bath bersuhu 75˚c selama 5 menit.
Sampel didinginkan pada suhu ruang dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm
selama 10 menit.
Supernatant kemudian dipindahkan dengan hati-hati, campurkan pellet dengan 150 µl
larutan Dissolve solution, inkubasi pada suhu 75˚c selama 5 menit kemudian
dinginkan pada suhu ruang.
Sampel kemudian disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Lalu
lapisan bening dipindahkan ke tube baru berukuran 0,5 µl dengan 300 µl ethanol 95%
Vortex sebentar, sampel kemudian disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 5
menit, kemudian pellet dicuci dengan menambahkan 200 µl ethanol 70%,
homogenkan, keringkan pellet selama kurang lebih 2 – 3 jam atau sampai dikira betulbetul kering dan terakhir tambahkan TE buffer sebanyak 100 µl.
Sampel di simpan dalam lemari pendingin bersuhu -20˚C.
Setelah proses ekstraksi, maka dilakukan PCR. Proses PCR dilakukan sebanyak 2 kali,
yaitu PCR pertama dan PCR lanjutan. Adapun langkah-langkahnya yaitu :
1) PCR Pertama (First PCR)
Denaturasi : 94˚C 30 detik; 62˚C 30 detik; 72˚C 30 detik, selama 5 siklus, kemudian
annealing : 94˚C 15 detik; 62˚C 15 detik; 72˚C 20 detik selama 15 siklus, selanjutnya
extension: 72˚C 30 detik; 20˚C 30 detik; dan extansion akhir pada suhu 4˚C.
2) PCR Lanjutan (Nested PCR)
94˚C 20 detik; 62˚C 30 detik; 72˚C 30 detik selama 25 siklus, tambahkan 72˚C 30
detik; 20˚C 30 detik diakhir siklus.
d) Setelah proses PCR dilakukan proses elektroforesis agarosa 2% dengan komposisi
sampel sebanyak 7 µl dan loading dye sebanyak 3 µl. elektroforesis ini menggunakan
marker 100bp sebanyak 1 µl dan kontrol positif dan kontrol negatif. Hasil elektroforesis
diamati dibawah UV transilluminator.
e)
Penentuan Konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA hasil ekstraksi dapat diketahui dengan metode spektrofotometer
dengan menggunakan alat Genequant pada panjang gelombang A260/280 nm. Kemurnian
DNA dikatakan murni jika angka pada gelombang A260/280 berada diantara 1,8 – 2,0. Selain
itu kualitas DNA yang telah diekstraksi dilihat melalui analisis eletroforesis gel agarosa.
f)
Amplifikasi PCR
Isolasi VP28 virus WSSV dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. Adapun
langkah-langkahnya adalah sebagai berikut :
-
Sampel yang telah diPCR dan bahan-bahan lain disiapkan.
Kemudian beads,1 µl primer VP28-F, 1 µl primer VP28-R, 1,5 genom (template)
udang windu dan 21,5 µl aquamilliQ dicampur kedalam tube.
Sampel disentrifuse cepat selama kurang lebih 10 – 15 detik.
Lalu sampel dimasukkan ke dalam mesin PCR. Adapun profil untuk PCR tersebut
adalah pre-denaturasi 94˚C 5 menit sebanyak 1 siklus; denaturasi: 94˚C 30 detik;
annealing 53˚C 30 detik; extansion 72˚C 30 detik sebanyak 35 siklus; final extansion
72˚C 7 menit kemudian tambahkan 4˚C diakhir siklus.
g) Elektroforesis Agarosa
-
-
-
Penyiapan gel agarosa 2%, dimana agarosa ini terdiri dari agarosa sebanyak 0,6 gr
dan TBE sebanyak 30 mL. Agarosa kemudian dipanaskan menggunakan microwave
selama 2 sampai 3 menit sampai agarosa menyatu sepenuhnya dengan TBE. Setelah
itu ditambahkan gel red sebanyak 1 µl dan dituangkan ke dalam cetakan.
Setelah agar mengeras dan mulai buram kemudian dilakukan elektroforesis, dengan
komposisi sampel sebanyak 3 µl dan loading dye 1 µl. Elektroforesis ini
menggunakan marker 100bp plus sebanyak 1 µl. elektroforesis ini dilakukan selama 1
jam atau lebih.
Hasil elektroforesis diamati dibawah UV transilluminator.
h) Penderetan Sekuen Nukleotida
Setelah proses amplifikasi PCR dilakukan, selanjutnya sampel dikirim ke
laboratorium First Base Singapura untuk dilakukan penderetan sekuen nukleotida.
Metode sekuen yang digunakan adalah metode sanger.
i)
Analisis Data
Sekuen hasil penderetan dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Version 7
untuk mendapatkan konsensus sekuen dari sekuen forward dan reverse. Untuk mengetahui
kemiripan (similaritas) sekuen yang dihasilkan, sekuen VP-28 disejajarkan (alignment)
dengan sekuen yang telah ada di dalam Bank Gen dengan menggunakan program BLAST-N
(basic local alignmen search tool-nucleotide). Hasil analisa ditujukan dengan pohon
filogenetika.
Hasil dan Pembahasan
Ekstraksi Udang Windu yang Terinfeksi WSSV
Proses ekstraksi udang windu yang terinfeksi WSSV dilakukan dengan metode DTAB
– CTAB. Ukuran udang windu yang digunakan adalah udang windu kecil, udang windu besar
dan . Bagian yang digunakan dari udang adalah campuran kaki renang, kaki jalan, dan ekor.
Setelah proses ekstraksi dilakukan maka selanjutnya dilakukan proses PCR. Setelah diPCR
kemudian sampel dielektroforesis, proses elektroforesis ini bertujuan untuk melihat apakah
udang diektraksi adalah udang yang positif atau negatif terinfeksi WSSV. Adapun hasil
elektroforesis udang windu dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil elektroforesis udang windu yang terinfeksi WSSV setelah proses
ekstraksi dengan menggunakan metode DTAB – CTAB. Keterangan,
SA=Sampel A; SB=Sampel B; SC=Sampel C.
Dari Gambar diatas dapat dilihat bahwa sampel A, B, dan C positif terinfeksi virus
WSSV. Hal ini ditandai dengan band pada sampel sesuai dengan kontrol positif yaitu 333 bp,
630 bp, dan 848 bp. Diagnosis penyakit yang paling mudah adalah apabila telah terjadi
infeksi akut, terlihat dengan timbulnya bercak putih pada bagian cephalothorax. Pada infeksi
dini dapat dilakukan dengan pemeriksaan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction
(PCR) menggunakan primer spesifik untuk WSSV (Mukhlis, 2010).
Ekspresi gen WSSV dibagi kedalam dua fase yaitu: 1) fase awal (early phase) yang
terjadi sebelum DNA virus bereplikasi; 2) Fase lanjut (late phase) terjadi ketika inisiasi
replika DNA virus atau setelahnya gen-gen WSSV yang ditranskripsikan pada fase awal
meliputi RR1,RR2, PK, TK-TMK, dan DNA pol, sedangkan gen-gen yang menyandikan
protein-protein struktural utama WSSV yaitu VP28, VP26, VP24, VP19, dan VP15 (Mukhlis,
2010).
Pengukuran Kemurnian Dan Konsentrasi DNA Genom
Tabel 1. Kemurnian dan Konsentrasi DNA Udang Windu asal Takalar
NO
Sampel
1
2
3
Sampel A (7gr)
Sampel B (15gr)
Sampel C (10gr)
Jumlah
Rata-rata
ABS
A260
0.876
0.800
0.703
ABS
A280
0.475
0.444
0.324
A260/A280
1.844
1.802
2.170
5.816
2.326,4
Konsentrasi
(μg/mL)
DNA
43.80
40.00
35.15
213
426
Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa hasil kemurnian dan konsentrasi DNA udang windu
asal Takalar menunjukkan hasil yang berbeda-beda, dimana sampel A dan B memiliki
kemurnian DNA yang murni yaitu 1.844 dan 1.802, sedangkan sampel C memiliki kemurnian
DNA yang menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat molekul berupa protein yaitu
2.170. Kemurnian yang rendah ini diduga disebabkan oleh protein yang tercampur pada DNA
yang dihasilkan. Sambrook et al. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau
lebih kecil dari nilai 1,8 – 2,0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol.
Metode spektofotomektrik digunakan untuk melihat kemurnian dan konsentrasi DNA
dimana DNA memiliki nilai absorbansi maksimal pada panjang gelombang 260 nm (λ 260
nm) sedangkan protein memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang 280 nm (λ
280 nm). Kemurnian DNA diketahui dari nilai rasio absorbansi DNA pada λ 260 nm dengan
λ 280 nm (A260/A280). Nilai rasio untuk DNA untai ganda murni yaitu 1,8 – 2,0. Nilai rasio
dibawah 1,8 menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat molekul besar misalnya
protein. Nilai rasio diatas 2,0 menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat molekul kecil
misalnya RNA.
Amplifikasi PCR dan Analisis Elektroforesis Agarosa
Panjang fragmen DNA hasil amplifikasi PCR menggunakan primer forward VP28 F
5’-GTTCGATAAAGAAAAAAACTCG-3′ dan primer reverse
VP28
R
5’CCCTATCTATATAAAAAGCACG-3’ dengan cetakan DNA genomik udang windu dewasa
dengan panjang nukleotida 672 bp. DNA PCR berhasil diisolasi dengan kemurnian yang
cukup tinggi, yang dapat terlihat dari pita yang jelas dan bersih. Pita sampel PCR DNA yang
bersih tanpa latar belakang mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang baik (DNA tidak
terdegredasi serta terkontaminasi). Hasil elektroforesis dari amplifikasi PCR dapat dilihat
pada Gambar 2.
Gambar 2.
Elektroforesis hasil sekuen PCR DNA, M adalah marker 100bp plus, 1, 2, 3
adalah sampel/ Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marker
DNA. Tanda kepala panah (
) di sebelah kanan gambar menunjukkan DNA
target dari hasil PCR.
Keberhasilan pengujian sampel dengan metode PCR dipengaruhi oleh beberapa hal,
seperti faktor kontaminasi silang, umur reagen atau enzim yang dipakai, jumlah enzim yang
dipakai, ketelitian saat proses ekstraksi, serta kondisi larutan buffer dan larutan etidium
bromina yang dipakai.
Penderetan Urutan Nukleotida VP 28
Untuk memastikan apakah fragmen DNA tersebut adalah target VP28 yang
diingankan, maka fragmen DNA dipurifikasi dari gel agarosa kemudian dilakukan
pembacaan nukleotidanya atau dikenal dengan istilah sekuensing. Hasil sekuens terdiri dari 3
hasil sampel, yaitu sampel A, B dan C. Sekuens A (Gambar 3), sekuens B (Gambar 4) dan
sekuens C (Gambar 5).
CNT
TAC
ACG
GCT
ACA
ACG
ACA
ATC
GTG
GTG
CGG
TCT
TTG
TCA
GAT
TTT
TGG
TAC
GCA
AGA
CTT
CCC
TCG
TAC
GCA
AAG
GGG
AAG
TGC
TTG
AGA
CCC
TCT
CGG
AAG
CCA
TCA
GTT
CTA
GTG
GTG
TAT
TAT
GTC
ATG
ATT
GTG
GTG
GCC
ATA
TTC
TTC
TCC
TCC
ATC
GAC
ACC
TCC
TCG
AAA
ATG
AAA
CGA
CTT
TCA
TCG
GGT
CCA
AAG
TTT
CCA
CAC
TGC
ACG
TTC
TTG
ACA
TCA
ATG
ATG
ATC
GCG
GAA
ACA
ATA
GTG
AAA
GCG
ACT
GAG
GAT
GTG
ACC
CCC
GGA
ATC
ATT
TCA
GCA
TTT
GTC
ACA
AGG
ATA
TAA
CCA
AGA
CCA
TCA
GAG
GGG
ATG
TTG
ACA
GTG
TGT
TTG
GTC
GTC
GTC
TTG
ATA
ATG
ACC
AAA
GAG
TTT
AAG
TCC
GTG
TTA
TTG
AAT
GTC
ATG
GCA
CCC
ATC
ACA
TCG
GTC
AAT
GCC
CTG
GCA
TAG
CCA
GTG
TCA
TTG
ATC
ATC
GTT
ACT
ACA
TCA
AAG
TTG
GGA
ATA
ACA
ACA
GAC
ACG
CGA
GTG
CCG
GTA
TCA
GAG
TTT
TTT
CCC
TCG
AGA
GAC
GTG
AAG
ATG
TTG
GTG
GCA
ACG
AGT
TTT
ACG
GCG
CCA
ATA
CTA
GGC
CTT
TCA
AGT
TCC
TTT
TCG
TAG
CGG
TCT
TTG
ATC
ACC
TTT
ATT
TGC
GTA
CAC
GAG
CCG
ACC
GAT
AAG
GCT
GCA
CCA
CTG
CCT
AGG
GTG
TGA
ACA
GAA
TTT
33
66
99
132
165
198
231
264
297
330
363
396
429
462
495
528
561
594
627
660
672
Gambar 3. Hasil sekuen viral-protein 28 WSSV udang Windu (Penaeus
monodon) sampel A
TTC
TTA
AGG
CAC
TGG
CAT
TGG
TCT
TCT
TTC
CTT
CCT
TTT
TGA
CGG
TAC
CAA
AGC
TTG
TTC
CCT
CGA
TTC
CGG
CGT
CGG
CAC
TAG
TAC
GCA
TTG
CAA
GTG
CCT
TCT
GCA
TAG
ACA
AGA
CGA
CCA
ATG
AGG
CTC
ATC
CAG
ACA
CAA
CAA
CGG
CAA
TCT
TGT
TGA
GGC
TTA
TGC
TGT
TTG
AGG
GGG
AGG
GCA
TGT
GAT
CCT
TAT
CAG
CGA
GTG
TGC
TGA
CCT
TAC
TCC
TCT
CCA
AAA
AGT
AAA
CGC
CAA
AGG
TTG
CAG
ACA
GCC
CGG
AAG
CGG
GAT
CAA
CTT
AGG
ATG
TGA
CCT
CCA
GAG
CAC
TCT
TTC
AGG
CAT
AGG
GGT
TGT
TGA
CAG
TGA
GAT
CAG
ACA
CAA
CCT
TGT
TAA
TGA
ATG
TCA
TGA
33
66
99
132
165
198
231
264
297
330
363
CAA
CAG
AGG
TGA
GAA
TAT
CAG
CAG
ACA
TTC
GAT
ACT
TGT
AGT
TGC
TGT
TGT
CAA
CGA
ATC
CCG
TTC
CGC
AGC
GGA
CTG
TGT
TCA
CCG
GAA
CAT
CAT
TGT
CTG
GGT
TGT
GAT
CAG
AAA
CAA
CTT
TGC
CAA
ATC
TTT
GGG
ACC
CAG
GAG
CTT
GGA
AGG
CAA
CAT
TTT
TAA
TGA
TAA
CCT
TCT
ACA
CCT
CCA
CGA
AAA
TGG
ACC
TCA
TGA
CAT
CAG
TGT
TGG
TCA
CGA
CGA
TCT
TTT
CAG
CAG
TTG
TCT
CAA
GGA
CGA
GTG
TGC
TCA
TCA
TCT
TGG
TAA
TGG
GTT
CAT
CCA
TCT
CAG
CGA
TCA
ATA
CCG
TTT
396
429
462
495
528
561
594
627
660
672
Gambar 4. Hasil sekuen viral-protein 28 WSSV udang Windu (Penaeus
monodon) sampel B
TTG
TTA
GTG
AAA
GCG
ACT
GAG
GAT
GTG
ACC
CCC
GGA
ATC
ATT
TCA
GCA
TTT
GTC
ACA
AGG
ATA
TTC
TAA
CCA
AGA
CCA
TCA
GAG
GGG
ATG
TTG
ACA
GTG
TGT
TTG
GTC
GTC
GTC
TTG
ATA
ATG
ACC
GAT AAA GAA AAA AAC TCG TCC CTA TCT 33
AAA GCA CGA TTT ATT TAC TCG GTC TCA 66
GAG TAG GTG ACG TGC ACG TAC ATG TCG 99
TTT CCA CCG GCG GTA GCT GCA ATT GGT 132
AAG GTG GTA CCA CAC ACA AAG GTG CCA 165
TCC TCA TCA ATA GAG ACG GGG GTG AAG 198
GTG TTG GAG CTA CCG ACA AAG GCC TTT 231
TTA ATC TTT GGC ACC ATC TGC ATA CCA 264
TTG ATC TTT CTT GAT GTG TTG TTC CAC 297
AAT GTT CCC TCA AAG GTG AGA TTC TGC 330
GTC ACT TCG AGT GCT CGG CCC TCC ACG 363
ATG ACA AGA TCC GCA TCT TCT TCC TTC 396
GCA TCA GAC TTT CCA TTG CGG ATC TTG 429
CCC AAG GTG TCG CTG TCA AAG GAC ACA 462
ATC TTG AAG TAG CCT GAT CCA ACC TCA 495
ACA GGA ATG CGG AGG TTT TCA TCC ATG 528
TCG ATA TTG TCT GTG TGG GTT TCG ATG 561
GTC ACA GTG TTG TGA TAC CTA AAA ATC 594
AAT ACA GCA ATC ACA GCA GTG ATG GCG 627
GCC GAC ACG ACC GAA AGA GTG AAA GAA 660
CGG ACG
672
Gambar 5.
Hasil sekuen viral-protein 28 WSSV udang Windu
monodon) sampel C
(Penaeus
Setelah dianalisa maka dapat diketahui panjang fragmen sampel A adalah 674 bp,
sampel B yaitu 677 bp dan sampel C sebesar 695 bp. Kemudian dengan menggunakan
software Genetyx Version 7, allignment sekuens parsial viral protein-28 dengan sampel
berupa udang windu dengan nomor sampel A, B, dan C ditunjukkan pada Gambar 6. Dari
hasil alignment diketahui bahwa posisi dari elemen-elemen penting tersebut adalah conserved
yaitu urutan yang mirip atau identik seperti dengan sekuensnya yang terjadi dalam asam
nukleotida. Start kodon ditandai dengan ATG dan stop kodon ditandai dengan TAA. Hal ini
memperkuat dugaan bahwa hasil isolasi merupakan viral protein-28 dari virus WSSV dari
sampel udang windu.
Gambar 6.
Allignment sekuen viral protein-28 antar beberapa sampel WSSV
yang
menginfeksi udang windu (no sampel a, b dan c) dengan panjang gen target
yaitu 674, 677, dan 695 bp. Start Kodon ditanda dengan ATG dan Stop Kodon
ditandai dengan TAA. Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan
urutan nukleotida, A=adenina, C=citosina, G=guanina, dan T=timinina.
Dari hasil homologi gabungan dari sampel A, B dan C maka didapatkan 3 hasil
perbandingan analisis urutan nukleotida, yaitu sampel A dan B sebesar 99,108% (Gambar 7)
dan sampel A dan C sebesar 99,406% (Gambar 8) dan sampel B dan C sebesar 98,95%
(Gambar 9).
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Sampel A
Sampel B
Gambar 7. Hasil homologi gabungan sampel A dan sampel B
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Sampel A
Sampel C
Gambar 8. homologi gabungan sampel A dan sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Sampel B
Sampel C
Gambar 9. homologi gabungan sampel B dan sampel C
Selanjutnya masih dengan menggunakan program Genetyx version 7 maka didapatkan
hasil dendogram bahwa sampel A dan C menunjukkan kekerabatan yang lebih dekat
dibandingkan dengan sampel B (Gambar 10).
Sampel A
Sampel C
Sampel B
Gambar 10. Dendogram sampel A, B dan C.
Berdasarkan hasil analisis menggunakan kesejajaran lokal (local alignment)
(BLASTn) VP28 menunjukkan kedekatan dengan Shrimp White Spot Syndrome Virus Strain
SDDL2/2008 VP28 gen, complete cds yang merupakan isolat dari India (EU414753.1) yaitu
100%. Pohon filogenetika yang menunjukkan kekerabatan isolat ini dengan beberapa VP28
yang ada dibasis data dapat dilihat pada gambar 11. Hasil tersebut menunjukkan bahwa gen
VP 28 yang ada di Indonesia khususnya Takalar memiliki kemiripan yang identik dengan
negara lain, ini berarti isolat dari Indonesia identik dengan isolat dari India.
Gambar 11. Pohon filogenetika VP28 yang menunjukkan kekerabatan dengan beberapa
VP28 yang ada di Gen Bank.
Kesimpulan
Kesimpulan yang didapat dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Isolasi gen penyandi protein permukaan VP 28 berhasil dilakukan dengan hasil
panjang fragmen yaitu 672 bp.
2. Hasil homologi antar sampel yang memiliki kekerabatan terdekat yaitu 99,406%
3. Hasil analisis homologi dengan gene bank menggunakan kesejajaran lokal pada
BLASTn menunjukkan bahwa homologi sampel gabungan memiliki kekerabatan
yang paling dekat dengan isolat dari India.
Daftar Pustaka
Mukhlis, A. 2010. Pengklonan gen VP28 Penyandi Viral Protein-28 dari virus White Spot
Syndrome sebagai langkah awal produksi vaksin rekombinan udang penaeid. Laporan
penelitian Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Murdjani, M. 2007. Penerapan Best Management Practices (BMP) Pada Budidaya Udang
Windu (Penaeus Monodon Fabricius) secara Intensif, Departemen Kelautan Dan
Perikanan, Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya Balai Besar Pengembangan
Budidaya Air Payau. Jepara.
Mavichaak, R, Kondo, H, Hirono I, dan Aoki, T. The Utilization of VP28 Gene to Protect
Penaeid Shrimps from white spot syndrom virus disease: a review. Diseases in
Aquaculture VII, 157-169.
Sriwulan, Irmawati, 2006, Karakterisasi Dan Kloning Gen Pengode VP28 White Spot
Syndrome Virus (WSSV) Isolat Indonesia Sebagai Kandidat Vaksin Rekombinan
Untuk Pengendalian Penyakit Bintik Putih Pada Udang Windu (Penaeus Monodon).
Laporan penelitian Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Makassar.
Sukenda, 2009, Keberadaan White Spot Syndrome Virus (WSSV), Taura Syndrome Virus
(TSV) Dan Infectious Hypodermal Haematopoitic Necrosis Virus (IHHNV) Di
Tambak Intensif Udang Vaname Litopenaeus Vannamei Di Bakauheni, Lampung
Selatan. Jurnal Akuakultur Indonesia, 8(2):1-8