Volume 18, Nomor 1, Hal.80-90 ISSN:0852

Volume 18, Nomor 1, Hal.80-90
Januari – Juni 2016
ISSN:0852-8349
PENGARUH AKTIVITAS SIKLUS SEL PADA FASE G2-M TERHADAP
PROGRESIVITAS SARKOMA JARINGAN LUNAK MELALUI
PENGUKURAN EKSPRESI mRNA GEN AURKA DAN ASCL2
Humaryanto1, M. Nurhalim Shahib2
1
Fakultas Kedokteran & Ilmu Kesehatan Universitas Jambi, Indonesia
2
Bagian Biokimia & Biologi Molekuler, Fakultas Kedokteran
Universitas Padjadjaran Bandung, Indonesia
ABSTRAK
Kejadian sarkoma jaringan lunak relatif rendah, insidensinya hanya sekitar 1-2%
dari semua kanker dewasa, sedang pada anak 6.5%, namun sarkoma jaringan lunak
memiliki lebih dari 70 sub tipe histologik. Gradasi histologi dari sarkoma
merupakan indikator penting guna menilai agresivitas dan prognosis yang baik
untuk perkembangan sarcoma serta kemungkinan/resiko metastasis. Gradasi
menggambarkan suatu proses translasi morfologi molekul yang menggambarkan
progresivitas sel tumor. Mekanisme serta regulasi yang mengatur hal tersebut
sampai dengan saat ini belum dapat dijelaskan secara pasti. Penelitian ini bertujuan
menganalisa kaitan antara perbedaan ekspresi gen aurora kinase Adan Ascl2, pada
sarcoma jaringan lunak gradasi ringan, sedang dan berat pada sediaan Formalin
Fixed Paraffin Embedded (FFPE). Pengukuran tingkat ekspresi mRNA dilakukan
menggunakan teknik Real-time PCR kemudian dianalisis perubahannya secara
kuantifikasi relatif dengan metode2-ΔΔCt. Penelitian telah dilakukan terhadap 23
sampel jaringan sarcoma jaringan lunak dari RSU H. Abdul Manap Kota Jambi
selama kurun waktu 2007-2013, terdiri dari gradasi ringan 7 sampel, gradasi sedang
9 sampel dan gradasi berat 7 sampel. Terdapat perbedaan perubahan yang
bermakna secara statistik ekspresi Aurka pada jaringan tumor sarkoma jaringan
lunak gradasi ringan, sedang dan berat (p=0.034, p=0.024, Kruskall Wallis).
Terdapat hubungan korelasi antara perubahan ekspresi aurora kinase dan Ascl2
dengan jaringan tumor sarkoma jaringan lunak grada siringan, sedang dan berat
(p<0.05, Spearman). Disimpulkan bahwa terdapat perubahan ekspresi gen mRNA
Aurka pada sarcoma jaringan lunak gradasi ringan, sedang dan berat dan terdapat
korelasi perubahan ekspresi aurora kinase A, dan Ascl2, antara jaringan tumor
sarkoma jaringan lunak gradasi ringan, sedang dan berat.
Kata kunci: Sarcoma jaringanlunak – gradasi – Aurka – cMyc - Ascl2 - KLF4 miR302b -Mdm2 - NFKB
PENDAHULUAN
Sarkoma jaringan lunak mencakup
kelompok besar tumor ganas pada
jaringan lunak, meliputi tulang rawan,
otot, lemak, saraf, pembuluh darah
dan jaringan ikat lainnya. Kelompok
ini mempunyai banyak variasi subtipe
histologik, lebih dari 50-70 subtipe.
Secara embriologi, sebagian besar
berasal dari mesoderm, dengan
kontribusi neuroectodermal dalam
80
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
kasus saraf perifer. Sejauh ini masih
belum dapat dipastikan penyebab
sarcoma jaringan lunak, faktor
penyebabnya tidak hanya oleh satu
faktor tunggal, tetapi banyak faktor
seperti faktor kelainan bawaan, faktor
genetik familial, faktor stimulasi
asing, faktor rangsangan zat kimia,
serta
faktor
adanya
trauma/luka/cedera.
Walau kejadian sarkoma jaringan
lunak
relatif
rendah,dilaporkan
insidensinya hanya sekitar sekitar 12% dari semua kanker dewasa, sedang
pada anak 6.5%, dan ditemukan pada
semua kelompok umur. Namun
kelainan
ini
memiliki
angka
morbiditas serta mortalitas yang
tinggi. Disamping itu, khususnya di
Indonesia, penderita datang dalam
kondisi stadium akhir sehingga
memberikan dampak angka mortalitas
yang semakin tinggi. Sampai saat ini
masih
ada
kontroversi
dalam
menentukan diagnosis, gradasi dan
stadium disebabkan beberapa jenis
sarcoma dari penilaian histologi tidak
dapat memberikan informasi guna
prediksi
penyakit,
agresifitasnya
berkaitan dengan metastase.
Gradasi histologi dari sarkoma
merupakan indikator penting guna
menilai agresivitas dan prognosis
yang baik untuk perkembangan
sarcoma serta kemungkinan/resiko
metastasis. Gradasi menggambarkan
suatu proses translasi morfologi
molekul yang dapat menentukan
agresivitas sel tumor. Gradasi
menentukan progresivitas sel tumor
melalui penilaian proses diferensiasi
sel, mitosis, dan nekrosis mikroskopis,
adapula yang menilai invasi vaskuler.
Gradasi sarkoma terbagi menjadi 3
tingkatan, yaitu derajat 1/rendah (low
89
grade), 2/sedang (intermediate grade)
dan 3/tinggi (high grade). Semakin
berat gradasinya maka sel tumor
tampak lebih heterogen, tampak
sangat berbeda dari sel normal, tidak
terdiferensiasi
sehingga
sulit
diidentifikasi sel asalnya dan dapat
tumbuh lebih cepat. Sarkoma derajat
berat menunjukkan prognosis buruk
serta tingginya angka kejadian
metastasis.
Sebagaimana
telah
diketahui
bahwa dasar kelainan yang timbul
pada kanker adalah adanya proliferasi
sel yang terus menerus yang terjadi
akibat adanya gangguan siklus sel dan
regulasinya. Pada kelaian kanker
proses pembelahan seltidakterkendali
dan kemampuan sel menyerang
jaringan
biologislainnya,
baik
pertumbuhan langsung di jaringan
tetangganya (invasif) maupun migrasi
sel ke tempat yang lebih jauh
(metastasis). Pertumbuhan yang tidak
terkendali
tersebut
disebabkan
kerusakan DNA yang menyebabkan
mutasi di genvital yang mengontrol
pembelahan
sel.
Sel
kanker
kehilangan fungsi kontrolnya terhadap
regulasi daur sel maupun fungsi
homeostasis sel pada organisme
multiseluler sehingga sel tidak dapat
berproliferasi
secara
normal.
Akibatnya, sel akan berproliferasi
terus-menerus sehingga menimbulkan
pertumbuhan jaringan yang abnormal
Penelitian guna menganalisa gen yang
berperan dalan masing-masing fase
pada carcinogenesis sudah banyak
dilakukan. Beberapa gen diketahui
memiliki peran dalam regulasi siklus
sel seperti pada fase G1, G2-M dan
seterusnya.
Pada penelitian ini akan diteliti
aktivitas fase G2-M melalui ekspresi
Humaryanto., dkk: Pengaruh Aktifitas Siklus Sel pada Fase G2-M Terhadap Progresivitas
Sarkoma Jaringan Lunak Melalui Pengukuran Ekspresi mRNA Gen Aurka dan ASCL 2
gen Aurka dan Ascl2. Hal ini didasari
dugaan bahwa sarcoma tidak saja
terjadi gangguan pada fase G1, namun
juga diduga terjadi kelainan pada fase
lainnya, yaitu fase G2-M. Proses
mitosis dalam siklus sel dapat terjadi
karena adanya aktivasi mitotic kinase,
seperti kinesin spindle protein (KSP)
dan centromic protein E (CENPE),
aurora kinase (AK) seperti aurora A
(AKA) dan aurora B (AKB), dan
polo-like kinase (PLks). AK, PLK,
dan KSP diekspresikan terutama di Mfase dari siklus sel dan, pada tingkat
lebih rendah, di G2. Selama G1-, G0-,
dan S-fase, tingkat ekspresinya sangat
rendah7,8.Adanya
peningkatan
ekspresi aurora kinase ditemukan pada
lebih dari 50%
kasus tumor
colorectal, ovarium dan gaster, serta
sekitar 94% kasus invasive ductus
adenocarcinoma mamae. Sehingga
Aurora A menjadi salah satu
parameter proliferasi yang merupakan
faktor prognostik independen untuk
pasien invasif dini kanker payudara.
Wang, dkk melaporkan adanya
peningkatan ekspresi aurora kinase A
pada metastases kanker payudara.
Gen lain yang berperan juga dalam
fase G2-M siklus sel adalah gen
achaete-scute
like2
(Ascl2).
Penurunan ekspresi ascl2 terjadi
akibat
berhentinya
fungsi
pos
pemeriksaan (checkpoint) G2/M pada
siklus
sel.
Data
pendahuluan
menunjukkan bahwa secara in vitro
ascl2
dapat
mengontrol
pos
pemeriksaan G2/M pada siklus sel
melalui regulasi ekspresi dari survivin
dan cdc25b. Baik survivin maupun
cdc25b dilaporkan secara klinis
mempunyai peran penting pada
kanker colorectal. Sedang survivin
diketahui merupakan target dari sinyal
Wnt dan diduga merupakan faktor
radiosensitif pada kanker rektal, serta
dapat digunakan untuk memprediksi
kegagalan lokal dari kemoradioterapi
dan reseksi pembedahan pada kasus
malignansi rektal.
METODE PENELITIAN
Teknik
pengambilan
sampel
menggunakan teknik total sampling,
semua sampel diseleksi berdasarkan
kelengkapan data, blok paraffin dan
jenis tumor. Objek penelitian yang
digunakan adalah sediaan paraffin
blok (FFPE, fixed formalin paraffin
embedded) penderita yang telah
didiagnosis fibrosarcoma melalui
pemeriksaan histopatologi dengan
pewarnaan hematoksilin eosin, yang
berasal dari biopsi dan/atau operasi
yang diterima di bagian Patologi
Anatomi RSU H. Abdul Manaf Kota
Jambi selama kurun waktu 2007-2013.
Jumlah sampel yang digunakan dalam
penelitian ini adalah 23 sampel
sarcoma jaringanlunak yang terdiri
dari 7 sampel sarcoma jaringan lunak
gradari ringan, 9 sampel jaringan
gradasi sedang dan 7 kasus jaringan
gradasi berat. Pengerjaan sampel dan
mulai isolasi RNA sampai tahap
RealTime-PCR
dilakukan
di
laboratorium Biologi Molekuler Unit
Penelitian Kedokteran (UPK) di
Fakultas Kedokteran Universitas
Padjadjaran.
Isolasi RNA
Sebelum dilakukan isolasi RNA,
maka sediaan paraffin (FFPE)
dilakukan tindakan deparaffinisasi,
yaitu dengan menambahkan 800µl
Hemo-De/xylol pada 5-20µl potongan
jaringan (0,5 cm3) ke dalam tabung
90
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
reaksi1.5ml. Kemudian dicampurkan
400µl ethanol absolut dan dilanjutkan
melakukan sentrifuga 12000-14000
rpm. Palet jaringan dikeringkan pada
suhu +55oC selama 10 menit
kemudian ditambahkan100µl larutan
buffer paraffin homogenisasi (botol
9b), 16µl larutan 10% SDS dan 40µl
larutan enzim paraffin homogenisasi.
Setelah itu dilakukan vortex segera
secara selaan dan intermiten dan
inkubasi semalam pada suhu +55oC.
Isolasi RNA dari sampel yang telah
diinkubasi
diprosesmenggunakan
protokol KAPA SYBR FAST OneStep qRT-PCR kit.
Amplifikasi qRT-PCR
Proses
amplifikasi
qPCR
®
menggunakan KAPA SYBR FAST
One-step
qPCR
Kits
yang
didisainmenurut
NCBI sequence
untukmengaplikasi gen MDM2, KL4
dan C-Myc dengan desain primer
sebagai berikut,
Aurka
Forward:
5′GAATGCTGTGTGTCTGTCCG3′
Reverse:
5′GCCTCTTCTGTATCCCAAGC3′
Ascl2Forward:
5’CGGGCTCCAGACGACCTAGG
AC-3’
Reverse:
5’
CTCATAGGTCGAGGGCGCTCA
GTA-3’
GAPDH
forward
5’TGCACCACCAACTGCTTAGC3’,
reverse
5’GGCATGGACTGTGGTCATGAG3’.
Pada tahapan ini dilakukan
pencampuran KAPA SYBR® FAST
89
master mix (2x), KAPA RT Mix
(50x), dUTP (10mM), ROX reference
Dye High/Low, template RNA dan
primer.
Pemeriksaan
qPCR
menggunakan alat mesin merk RotorGene (Qiagen) dengan Protokoler
cycling dimulai dengan
sintesis
cDNA pada suhu 42 oC selama 5
menit, inaktifasi RT pada suhu 95oC
selama 2-5 menit, denaturasi pada
suhu 95oC selama 3detik, annealing
pada suhu 60oC, dan terakhir fase
disosiasi sesuai buku petunjuk.
Secara kualitatif, ekspresi gen
dinilai berdasarkan Ct value, yaitu
nilai kuantifikasi jumlah copy ekspresi
gen yang melewati garis ambang
(threshold) yang telah ditetapkan,
digradasikan menjadi overekspresi
(<15), terekspresi sangat tinggi (1520), tinggi (20-25), sedang (25-30),
lemah (30-35) dan terekspresi sangat
lemah (35-40). Sedang nilai ekspresi
ditentukan mulai dari 1 sampai dengan
5, yaitu ekspresi ringan sampai
dengan terekspresi sangat tinggi.
Setelah proses amplifikasi selesai,
diperoleh kurva disosiasi yang
kemudian dianalisa ekspresi relatifnya
dengan menggunakanmetode yang
membandingkan target Ct dengan
nilai referensi yang dipilih, yaitu level
ekspresi house keeping gene yang
pada penelitian ini menggunakan gen
GAPDH, dengan perhitungan ΔCt= Ct
target gen – Ct housekeeping gene. Bila nilai
ΔCt memiliki nilai positif maka nilai
Ct target gen lebih besar dari nilai
GADPH (+ΔCt) dan sebaliknya nilai
negatif bila Ct target gen lebih rendah
dari GADPH (-ΔCt). Kemudian
perbandingan level ekspresi didapat
dengan menggunakan rumus metode
2-ΔΔCt18.
Humaryanto., dkk: Pengaruh Aktifitas Siklus Sel pada Fase G2-M Terhadap Progresivitas
Sarkoma Jaringan Lunak Melalui Pengukuran Ekspresi mRNA Gen Aurka dan ASCL 2
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian inididapat sampel
sebanyak 23 buah jaringan yang
sesuai
dengan
kriteria
inklusi
penelitian ini, dan berikut adalah data
yang diperoleh.
Tabel 1. Karakteristik Subjek Penelitian (n=23)
Variabel
Gradasi Ringan
(n=7)
Gradasi Sedang
(n=9)
Gradasi Berat
(n=7)
Usia
Rerata±SD
Median
Range (min-max)
43,00±7,14
44,00
(30,00-52,00)
46,55±16,98
44,00
(19,00-75,00)
63,00±19,68
70,00
(27,00-80,00)
Jenis Kelamn
Laki-laki
Perempuan
3 (42,9%)
4 (57,1%)
7 (77,8%)
2 (22,2%)
3 (42,9%)
4 (57,1%)
Lokasi
Femur
Pectrolaris
Scapua
Cruris
Parietoksipital
Lainnya
2 (28,6%)
1 (14,3%)
1 (14,3%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
3 (42,9%)
6 (66,7%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
1 (11,1%)
2 (22,2%)
0 (0,0%)
1 (14,3%)
0 (0,0%)
1 (14,3%)
0 (0,0%)
5 (71,4%)
Diagnosis
Fibrosarcoma
Liposarcoma
Dermafibrosarcoma
Lainnya
2 (28,6%)
2 (28,6%)
2 (28,6%)
1 (14,3%)
5 (55,6%)
0 (0,0%)
2 (22,2%)
2 (22,2%)
3 (42,9%)
1 (14,3%)
0 (0,0%)
3 (42,9)
Pengukuran
tingkat
ekspresi
mRNA dilakukan secara kuantitatif
menggunakan real-time PCR pada
suhu yang didapat dari hasil optimasi.
Data yang diperoleh dianalisis dengan
metode kuantifikasi relatif metode 2ΔΔCt
(Livak,
Shcimttgen)
dengan
perbandingan delta delta threshold
(ΔΔCt). Metode ini membandingkan
target dengan nilai referensi yang
dipilih,
yaitu
level
ekspresi
housekeeping gene, yaitu GAPDH.
Adapun hasil Ct housekeeping
gene ini pada sarcoma jaringan lunak
berdasarkan gradasi ringan, sedang
dan berat adalah sebagai berikut:
Tabel 2. Nilai Ct Housekeeping Gene (GAPDH) Berdasarkan Gradasi
Sarkoma Jaringan Lunak
Ct GAPDH
Gradasi Ringan
Gradasi Sedang
Gradasi Berat
Aurka
Ascl2
28.80+2.46
29.90+1.94
28.36+1.62
90
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
yang
Data ΔCt masing-masing gen
telah diperoleh dianalisis
menggunakan kajian statistik sesuai
metode yang telah ditentukan
Tabel 3. Perbandingan Rerata Ct gen target Aurka dan Ascl2 Pada Ketiga
Kelompok Penelitian
Kelompok
Gradasi
Nilai
Variabel
Gradasi sedang Gradasi ringan
berat
P
n=7
n=9
n=7
ΔCt Aurka
0,034*
*
Rerata±Std Devitation
Median
Range (min-max)
3,541±2,219
2,630
1,41-7,56
3,092±3,750
4,160
-2,18-9,98
0,168±1,523
0,550
-0,37-1,30
ΔCt Ascl2
Rerata±Std Devitation
Median
Range (min-max)
6,258±1,970
6,370
2,78-9,38
4,762±3,032
4,760
0,20-10,13
3,557±2,217
0,157
3,560
0,75-6,42
Dalam penelitian ini diperoleh
gen pada sarcoma jaringan lunak
nilai ΔCt, ΔΔCt serta perbandingan
gradasi ringan, gradasi sedang dan
level ekspresi masing-masing target
gradasi berat sebagai berikut:
Tabel 4. Perbandingan Nilai ΔCt, ΔΔCt serta Perbandingan Level Ekspresi
Gen yang Berperan pada Aktivitas Siklus Sel (fase G2-M)pada
Kelompok Sarkoma Jaringan Lunak Gradasi Ringan, Sedang dan
Berat
Targeting
Genes
gradasi
GAPDH
Ct
ΔCt genes*)
genes Ct
ΔΔCt
+ΔCt
Aurka
Ascl2
Ringan
Sedang
Berat
Ringan
Sedang
Berat
28.80+2.46
29.90+1.94
28.36+1.62
28.80+2.46
29.90+1.94
28.36+1.62
29.76+1.23
32.99+3.23
31.90+1.70
32.50+1.55
34.73+2.76
34.06+2.49
Dalam penelitian ini dianalisis
pula korelasi antara perbedaan ΔCt
target gen dengan gradasi dari
89
0.168+1.52
3.092+3.75
3.54+2.22
3.56+2.43
4.76+3.03
5.70+2.61
ΔCt
0.168
3.092
3.54
3.56
4.76
5.7
Normalized
target gene
relative to
GAPDH
2-ΔΔCt
0.41
0.12
0.09
0.08
0.04
0.01
sarcoma jaringan lunak dengan kajian
statistic sebagai berikut:
Humaryanto., dkk: Pengaruh Aktifitas Siklus Sel pada Fase G2-M Terhadap Progresivitas
Sarkoma Jaringan Lunak Melalui Pengukuran Ekspresi mRNA Gen Aurka dan ASCL 2
Tabel 5. Kolerasi Antara Aurka, dan Ascl2, dengan Sarkoma Jaringan Lunak
Gradasi Berat, Sedang dan Ringan.
Variabel
R
P
Kolerasi
antara
Aurka
0,521
0,011**
dengan Gradasi
Kolerasi
antara
Ascl2
0,420
0,046**
dengan Gradasi
Keterangan: Korelasi antara ordinal dengan numerik menggunakan analisis korelasi Spearman;
nilai kemaknaan p < 0,05. Tanda ** menunjukkan signifikan atau bermakna secara
statistika. r: koefisien korelasi
Jumlah sampel dalam penelitian
ini relatif sedikit, yaitu 23 sampel dari
30 kasus sarcoma jaringan lunak di
RSU H. Abdul Manaf kota Jambi
selama tahun 2007-2013. Menurut
laporan registrasi kanker berbasis
rumah sakit di RS Kanker Dharmais
Jakarta pada tahun 2003-2007,
dilaporkan dari 10.195 kasus kanker
ditemukan kasus sarcoma jaringan
lunak hanya sebanyak 202 kasus. Bila
merujuk pada pustaka hal ini
menunjukkan bahwa benar kasus
sarcoma relatif jarang ditemukan,
insidennya sekitar 2 dari 100.000,
mendekati angka 1%, namun hampir
50% meninggal akibat penyakit
tersebut.
Pada tabel 1 diatas tampak bahwa
umur terbanyak pada kelompok
pasien berumur antara 19 tahun
hingga 80 tahun dengan rata rata usia
50, 47 tahun. Hal ini sesuai dengan
laporan lainnya dalam pustaka bahwa
distribusi
terbanyak
penderita
sarcoma jaringan lunak terdapat pada
kelompok umur dekade ke 2, 3, dan
4. Diestimasi bahwa sedikitnya ada
100 tumor jinak untuk setiap 1 tumor
ganas pada jaringan lunak. Sarkoma
jaringan lunak didapatkan sekitar
0,7% dari keganasan pada pria dan
0,6% dari keganasan pada wanita.
Sedang dari jenis kelamin diperoleh
data terdiri dari pasien laki-laki
sebanyak 13 orang (56,6%) dan
sebanyak 10 orang (43,5%) adalah
pasien perempuan. Dalam pustaka
dilaporkan
bahwa
perbandingan
angka kejadian sarkoma jaringan
lunak ini pada pria danwanita 1,15:1.
Sedang berdasar lokasi sarcoma
jaringan lunak sebagian besar terletak
pada ektremitas bawah, yaitu
sebanyak 8 orang pasien (34,8%)
terletak pada femur. Kemudian 2
orang (8,7%) terdapat pada pectoralis
dan masing-masing sebanyak
1
orang (4,3%) terdapat pada scapula,
kruris serta parietook sipital. Hasil
ini menunjukkan kemiripan dengan
data penelitian lain serta referensi
bahwa hampir 50% kasusterjadi di
ekstremitas terutama ekstremitas
bawah dan 30% kasus terjadi di
viseral dan retroperitoneal.
Adapun
tabel
4di
atas
memperlihatkan bahwa ekspresi
Aurka pada sarkoma jaringan lunak
gradasi ringan menunjukkan ΔCt
value = 0.168+1.52, kemudian
meningkat secara signifikan pada
gradari sedang (3.09+3.75), kemudian
relatif menetap serta gradasi berat
3.54+2.22. Kemudian analisis data
perbandingan
level
ekspresinya
dengan menggunakan metode metode
2-ΔΔCt, menunjukkan bahwa gen
Aurka
pada
gradasi
ringan
diekspresikan
2-2.5 kali lebih
90
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
rendah daripada GAPDH dan pada
gradasi berat diekspresikan paling
rendah, yaitu mendekati seratus kali
lebih rendah dari GAPDH. Ekspresi
relatif yang rendah pada gradasi
sedang dan berat menggambarkan
bahwa gen Aurka disupresi lebih kuat
dibanding pada gradasi ringan dan
pada sarkoma jaringan lunak gradasi
berat disupresi paling kuat. Pada
Tabel 3 menunjukkan secara statistik
terdapat perbedaan rerata Aurka
antara kelompok sarcoma jaringan
lunak gradasi rendah, sedang dan
tinggi yang signifikan dan dengan
nilai kemaknaan atau nilai p sebesar
0.034 (p<0.05), kemudian pada tabel
5 hasil uji korelasi (Spearman)
p=0.011 (p<0.05) yang berarti
terdapat hubungan yang bermakna
antara ekspresi Aurka dengan gradasi
sarcoma jaringan lunak.
Hal ini menunjukkan bahwa Aurka
dapat membedakan sarkoma jaringan
lunak gradasi ringan dan berat, tetapi
tidak dapat membedakan antara
sedang dan berat. Hal ini mendukung
bahwa Aurka dapat digunakan untuk
diagnosis awal, tetapi tidak dapat
menunjukkan progresivitas se tumor.
Hal ini berbeda dari Ascl2, seperti
pada tabel 4, tampak bahwa semakin
berat gradasinya maka semakin besar
ekspresinya, yaitu ΔCt value Ascl2
pada gradasi ringan
= 3.56+2.43,
gradasi sedang = 4.76+3.03 dan
gradasi berat = 5.70+2.61. Pada tabel
3 uji statistika menggunakan uji
analisis ANOVA diperoleh nilai p
value = 0.157 (P value> 0,05), maka
dapat dikatakan tidak ada perbedaan
rerata antara variabel Ascl2 antara
ketiga
kelompok
penelitian
berdasarkan gradasi ringan, sedang
dan berat. Pada tabel 5 hasil uji
89
korelasi
(Spearman)
p=0.046
(p<0.05) yang berarti terdapat
hubungan yang bermakna antara
ekspresi Ascl2 dengan gradasi
sarcoma jaringan lunak.
Kemudian
pada
tabel
4,
menggunakan metode kuantifikasi
relatif
(relative
quantification)
berdasarkan metode 2-ΔΔCt (Livak,
Shcimttgen) terdapat hubungan antara
gradasi sarkoma jaringan lunak
dengan ekspresi Ascl2, dimana pada
gradasi berat gen Ascl2 diekspresikan
sangat rendah, mencapai 100 kali
lebih rendah dibanding GAPDH. Dari
metode ini tampak bahwa semakin
berat gradasinya tampak gen Ascl2
semakin disupresi. Hal ini berarti
Ascl2 dapat digunakan untuk
mengetahui progresivitas sel tumor.
Hal ini diduga peran Aurk yang
dapat menekan induksi apoptosis
Myc pada fase G2-M dari siklus sel.
Meskipun belum diketahui secara
pasti mekanismenya, diduga hal ini
melibatkan bypass mitosis pos
pemeriksaan dan/atau inhibisi Aurkb
juga memblok fungsi antiapoptotic
Survivin.Proses
apoptosis
yang
merupakan respon terhadap inhibisi
Aurk
mengakibatkan
ekspresi
berlebih sel Myc secara selektif,
sejalan dengan adanya efek yang jelas
lebih kuat dari inhibisi Aurka/Aurkb
dalam sel yang sedang berproliferatif
yang
didorong
oleh
Myc
dibandingkan onkogen lainnya.
Adanya peningkatan ekspresi
aurora kinase ditemukan pada lebih
dari 50% kasus tumor colorectal,
ovarium dan gaster, serta sekitar 94%
kasus
invasive
ductus
adenocarcinoma mamae. Aurka dan
Aurkb meningkatkan transformasi
yang diinduksi oleh Ras. Meskipun,
Humaryanto., dkk: Pengaruh Aktifitas Siklus Sel pada Fase G2-M Terhadap Progresivitas
Sarkoma Jaringan Lunak Melalui Pengukuran Ekspresi mRNA Gen Aurka dan ASCL 2
Aurka juga terlihat mengekang
turmogenesis, sebagaimana Aurka
heterozigot meningkatkan angka
perkembangan tumor; dan tidak
adanya p53, inhibisi Aurka dapat
memberikan
pertumbuhan
yang
menguntungkan. Aurora A menjadi
salah satu parameter proliferasi yang
merupakan
faktor
prognostik
independen untuk pasien invasif dini
kanker
payudara.
Wang,
dkk
melaporkan adanya peningkatan
ekspresi aurora kinase A pada
metastases kanker payudara. Ekspresi
berlebih aurora kinase A telah
ditemukan
berkorelasi
dengan
fosforilasi penekan tumor seperti p53,
sehingga
terjadi
modulasi
aktivitasnya dan menunjukkan peran
dalam proliferasi yang tidak diatur
dan kerusakan DNA yang diinduksi
apoptosis pada kanker payudara.
Ascl2 merupakan salah satu faktor
transkripsi basic helix-loop-helix
(bHLH)
yang
pada
awalnya
ditemukan bertanggung jawab pada
sifat yang diturunkan oleh trofoblas
pada jaringan normal plasenta. Pada
kasus neoplasia kolorektal ditemukan
meningkat ekspresinya dibandingkan
yang diekspresikan pada jaringan
normal manusia. Ekspresi Ascl2
berlebih diakibatkan dari adanya
disregulasi penyandian Wnt pada
tahap awal neoplasia intestin.
Survivin dan cdc25b dilaporkan
menjadi target dari sinyal Wnt, yang
banyak ditunjukkan pada kanker
colorectal dibandingkan dengan kolon
normal dan progresi melalui G2/M.
Secara in vitro data menunjukkan
bahwa ekspresi Ascl2 yang menurun
diakibatkan arrest dari checkpoint
siklus sel G2/M. Oleh Karena itu
diberi hipotesis bahwa G2/M yang
tampak pada penurunan ascl2
kemungkinan sekunder dari regulasi
transkripsi dari survivin dan/atau
cdc25b oleh ascl2. Survivin diketahui
merupakan target dari penyandian
Wnt,
diduga
menjadi
faktor
radioresisten kanker rektum serta
dapat memprediksi kegagalan lokal
pada keganasan rektum setelah
kemoradioterapi dan reseksi bedah,
sedang
cdc25b
diketahui
diekspresikan berlebih pada 56%
kanker kolorektal serta ekspresinya
dapat memprediksi angka survival.
Adanya blokade secara selektif
terhadap ekspresi Ascl2 dapat
menyebabkan arrest pertumbuhan
tumor, baik secara in vitro maupun in
vivo yang kemungkinan melalui
inhibisi yang berkaitan dengan miR302b pada sel progenitor kanker
kolon.20
Ekspresi Ascl2 diduga
secara in vitro berperan menurunkan
proses proliferasi seluler, kemampuan
invasi sel tumor serta kemampuannya
bermigrasi, serta potensi menjadi
keganasan secara in vivo.
Beberapa hal yang menjadi
keterbatasan dalam penelitian ini
diantaranya adalah jumlah sampel
yang kurang, dengan keberagaman
maupun
jumlah
masing-masing
subtype sarcoma jaringan lunak yang
terbatas. Kemudian jenis sampel
penelitian berupa FPPE membuat
hasil pemeriksaan PCR terbatas,
ekspresi target gen menjadi tidak
optimal sehingga ada beberapa
sampel harus dilakukan penilaian
berulang kali.
KESIMPULAN
Dari penelitian ini diperoleh
simpulan bahwa terdapat perbedaan
90
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
ekspresi aurora kinase Adan Ascl2
pada jaringan tumor sarkoma jaringan
lunak gradasi ringan, sedang dan
berat melalui jalur siklus sel fase G2M. Walaupun secara kajian statistik
pada gen Ascl2 tidak terdapat
perbedaan pada jaringan tumor
sarkoma jaringan lunak gradasi
ringan, sedang dan berat.
Pada penelitian ini menunjukkan
bahwa walaupun dengan kajian
statistik tidak terdapat hubungan
bermakna untuk membedakan sel
sarkoma dari sel normal, atau
progresivitas sel tumornya, namun
untuk menetapkan deteksi dini dalam
penelitian ini dengan menggunakan
penilaian dengan metode livak.
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti dalam kesempatan ini
menyampaikan banyak terima kasih
serta penghargaan kepada semua
pihak, terutama kepada tim promotor,
Unit Penelitian Kedokteran Fakultas
Kedokteran Universitas Padjadjaran,
Program Pascasarjana S3 Fakultas
Kedokteran Universitas Padjadjaran,
serta pihak lain yang turut serta
membantu baik secara langsung
maupun tidak langsung dalam
pelaksanaan penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Weiss SW, Goldblum JR, Folpe AL.
Enzinger and Weiss's Soft
Tissue
Tumors.Elsevier
Health Sciences; 2007.
Gilbert NF, Cannon CP, Lin PP,
Lewis
VO.
Soft-tissue
Sarcoma. Journal of the
American
Academy
of
89
Orthopaedic
Surgeons.
2009;17(1):40-7.
Cormier JN, Pollock RE. Soft Tissue
Sarcomas. CA: A Cancer
Journal
for
Clinicians.
2004;54(2):94-109.
Fletcher CDM UK, Mertens F.
Pathology and Genetics of
Tumours of Soft Tissue and
Bone. Organization WH,
Pathology IAo. 2002.
Coindre J-M. Grading of Soft Tissue
Sarcomas:
Review
and
Update.
Archives
of
Pathology
&
Laboratory
Medicine.
2006;130(10):1448-53.
Chintamani. Soft Tissue SarcomasThe Pitfalls in Diagnosis and
Management!! Indian Journal
of
Surgical
Oncology.
2011;2(4):261-4.
Gritsko TM, Coppola D, Paciga JE,
Yang L, Sun M, Shelley SA,
et
al.
Activation
and
Overexpression
of
Centrosome
Kinase
BTAK/Aurora-A in Human
Ovarian Cancer. Clinical
Cancer
Research.
2003;9(4):1420-6.
Madhu Kollareddya PD, Daniella
Zhelevab, Marian Hajducha.
Aurora Kinases: Structure,
Function and their Association
with Cancer. Biomed Pap
Med Fac Univ Palacky
Olomouc
Czech
Repub.
2008;52(1):27-33.
Lam AK-Y, Ong K, Ho Y-H. Aurora
kinase expression in colorectal
adenocarcinoma: correlations
with
clinicopathological
features, p16 expression, and
telomerase activity. Human
Humaryanto., dkk: Pengaruh Aktifitas Siklus Sel pada Fase G2-M Terhadap Progresivitas
Sarkoma Jaringan Lunak Melalui Pengukuran Ekspresi mRNA Gen Aurka dan ASCL 2
pathology. 2008;39(4): 599604.
Blay P, Astudillo A, Buesa JM,
Campo E, Abad M, GarcíaGarcía J, et al. Protein Kinase
C θ Is Highly Expressed in
Gastrointestinal
Stromal
Tumors But Not in Other
Mesenchymal
Neoplasias.
Clinical Cancer Research.
2004;10(12): 4089-95.
Mountzios G, Terpos E, Dimopoulos
M-A. Aurora Kinases as
Targets for Cancer Therapy.
Cancer Treatment Reviews.
2008;34(2):175-82.
Katayama H, Brinkley W, Sen S. The
Aurora kinases: Role in cell
transformation
and
tumorigenesis.
Cancer
Metastasis
Rev.
2003;22(4):451-64.
Yamamoto S, Yamamoto-Ibusuki M,
Yamamoto Y, Fujiwara S,
Iwase H. A comprehensive
analysis of Aurora A;
transcript levels are the most
reliable in association with
proliferation and prognosis in
breast cancer. BMC Cancer.
2013;13(1):217.
Wang L-h, Xiang J, Yan M, Zhang Y,
Zhao Y, Yue C-f, et al. The
Mitotic Kinase Aurora-A
Induces
Mammary
Cell
Migration and Breast Cancer
Metastasis by Activating the
Cofilin-F-actin
Pathway.
Cancer
Research.
2010;70(22):9118-28.
Jubb AM, Chalasani S, Frantz GD,
Smits R, Grabsch HI, Kavi V,
et al. Achaete-scute like 2
(ascl2) is a target of Wnt
signalling and is upregulated
in
intestinal
neoplasia.
Oncogene. 2006;25(24):344557.
Rodel F, Hoffmann J, Distel L,
Herrmann M, Noisternig T,
Papadopoulos T, et al.
Survivin as a radioresistance
factor, and prognostic and
therapeutic
target
for
radiotherapy in rectal cancer.
Cancer
Res.
2005;65(11):4881-7.
M. nurhalim Shahib B, Zoraya
A.Feranty. Studies on Gene
Expression at the RNA level
Associated with the Senile
Lens Change in Human Lens
Cataract. Donnish Journal of
Medicine
and
Medical
Sciences. 2015; 2(3).
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis
of Relative Gene Expression
Data
Using
Real-Time
Quantitative PCR and the
2−ΔΔCT Method. Methods.
2001;25(4):402-8.
den Hollander J, Rimpi S, Doherty
JR, Rudelius M, Buck A,
Hoellein A, et al. Aurora
kinases A and B are upregulated by Myc and are
essential for maintenance of
the malignant state. Blood.
2010;116(9):1498-505.
Zhu R, Yang Y, Tian Y, Bai J, Zhang
X, Li X, et al. Ascl2
Knockdown Results in Tumor
Growth Arrest by miRNA302b-Related Inhibition of
Colon Cancer Progenitor
Cells.
PLoS
ONE.
2012;7(2):e32170.
90